【CN109576246A】一种-葡萄糖苷酶突变体及其应用【专利】
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代理人 张勇
(51)Int .Cl . C12N 9/26(2006 .01) C12N 15/56(2006 .01) C12N 1/19(2006 .01) C12P 19/14(2006 .01) C12P 19/04(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用
( 57 )摘要 本发明涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其
应用，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其 在生产低聚异麦芽糖和抗性糊精中的应用，属于 基因工程技术领域。本发明通过将来源于构巢曲 霉的α-葡萄糖苷酶突变体基因转入毕氏酵母中 表达 ，将重组 α-葡萄糖苷酶 用于 制备 低聚 异麦 芽糖和抗性糊精，在45℃、pH 5 .5、加酶量5U/g、 底物浓度300g/L条件下，低聚异麦芽糖的产量达 216g/L ，转化率为72％。以 焦糊精为底物时 ，采用 分支酶 ，α-CGT酶 ，α-葡萄糖苷酶三酶复配来提 高抗性糊精成分，可以使焦糊精的抗性成分从原 先的44％提高至70％。此方法有效提高了生产效 率，降低了生产成本。
(10)申请公布号 CN 109576246 A (43)申请公布日 2019.04.05 C12P 19/02(2006 .01) C12P 19/12(2006 .01) C12R 1/84(2006 .01)
权利要求书1页 明书5页 序列表5页 附图3页
CN 109576246 A
CN 109576246 A
2
CN 109576246 A
说 明 书
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一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用
技术领域 [0001] 本发明涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶突变 体及其在生产低聚异麦芽糖和抗性糊精中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术 [0002] α-葡萄糖苷酶在工业上可应用于低聚异麦芽糖(IMOs)的生产。低聚异麦芽糖又称 分支低聚糖，是一种以淀粉为原料采用全酶法工艺生产的糖浆，由2-10个葡萄糖残基构成， 分子中至少有1个α-1 ,6糖苷键，其他为α-1 ,4糖苷键。低聚异麦芽糖是世界上功能性低聚糖 中生产和销售量很高的 产品 ，它主要具有促进人体肠道内有益菌群增殖 ，抑制许多病原菌 和腐败菌的生长，增强人体免疫力降低血清胆固醇、甘油三酯及游离脂肪酸的含量，消除心 血管疾患的 病因 ；抗龋齿性甚佳 ，很难或不被人体消化吸收 ，提供的能量很低或根本没有 ， 可作为糖尿病人、肥胖病人和低血糖病人的保健甜味剂。 [0003] 目前工业化生产的低聚异麦芽糖是由黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶发酵生成的，虽 然其转苷能力较强，其转化率能达到60％左右，但水解能力也很强，最终生成的葡萄糖仍然 很多，限制了含α-1 ,6键的低聚糖含量。其次，黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶生成的低聚异麦 芽糖中的异麦芽糖含量较高 ，而异麦芽糖属于二糖 ，目前被认为不属于膳食纤维 ，降 低了该 低聚异麦芽糖产品的保健价值。 [0004] 抗性糊精由淀粉经过高温酸热降解，然后加工提纯而制成，它含有α-1 ,2与α-1 ,3 键，还含有α-1 ,4和α-1 ,6键，甚至在某些还原末端上含有β-1 ,6键的结构。其中α-1 ,3，α-1 , 2，α-1 ,6键不能被存在于人体内的各种消化酶分解，而且进入到人体消化道之后也不能被 小肠消化和吸收 ，所以能够进入到人体内大肠 ，被存在于人体大肠内的各种益生菌作为养 料所发酵，可以发挥膳食纤维的各种生理作用。抗性糊精还可以让人们感觉到饱腹感，适合 患有肥胖病的人使 用，抗性糊精没有甜味 ，能够保持原味 ，且极易溶于水呈中性 ，不仅能够 增加如饮料等的口感风味 ，作为食品添加剂添加到食品中也具有独特的优势。抗性糊精还 有许多益处，比如血糖反应较低，释放热量的时间也较长，还有它对肠道的蠕动和健康也非 常有益 ，利于排便 ；2012年期间我国卫生部门 第16号公告中明 确表示已 经将抗性 糊精视为 普通食品，这将使得抗性糊精在食品行业中的应用越来越广阔。 [0005] 目前抗性糊精的生产工艺一般为：淀粉-高温酸热水解-焦糊精-酶水解-提纯-喷 雾干燥。一般淀粉经过高温酸热水解后的 焦糊精中抗性含量可以 达到50％ ，工业生产中 用 糖化酶处理后 ，可形成抗性成分80％以 上的成品 ，但此生产方法反应条件剧烈、操作复 杂、 不利于环保。 [0006] 因此，提供一种成本低、操作简单且环保的低聚异麦芽糖和抗性糊精生产方法，对 于工业制备低聚异麦芽糖和抗性糊精有重要的应用价值。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910026579 .1
(22)申请日 2019 .01 .11
(71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号
(72)发明人 陈晟 吴敬 任莉琼
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211
权 利 要 求 书
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1 .一种α-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，含SEQ ID NO .1所示的氨基酸序列。 2 .编码权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体的基因。 3 .含权利要求2所述基因的载体或细胞。 4 .一种重组毕赤酵母，其特征在于，表达权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体。 5 .如权利要求4所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以Pichia pastoris KM71为表达宿 主，以pPIC9K为表达载体。 6 .一种生产α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，应用了权利要求4或5所述重组毕赤酵 母进行发酵。 7 .如权利要求6所述的方法，其特征在于，是挑取重组毕赤酵母单菌落接种到YPD培养 基中 ，28-32℃、200-220rpm ，培养20-30h ；将培养液按5-10％的 接种量接种到BMGY培养基 中 ，先于28-32℃、200-220rpm ，培养20-30h ，离心 ，弃上清 ，收集菌体 ，用BMGY培养基重悬菌 体，加入甲醇诱导产酶，28-32℃、200-220rpm，培养110-130h，发酵液经超声破碎后离心，上 清即为重组α-葡萄糖苷酶。 8 .权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体或表达权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体 的细胞在制备低聚异麦芽糖中的应用。 9 .权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体或表达权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体 的细胞在制备抗性糊精中的应用。 10 .权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体或表达权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体 的细胞在食品、饲料或制药领域中的应用。
(51)Int .Cl . C12N 9/26(2006 .01) C12N 15/56(2006 .01) C12N 1/19(2006 .01) C12P 19/14(2006 .01) C12P 19/04(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用
( 57 )摘要 本发明涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其
应用，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其 在生产低聚异麦芽糖和抗性糊精中的应用，属于 基因工程技术领域。本发明通过将来源于构巢曲 霉的α-葡萄糖苷酶突变体基因转入毕氏酵母中 表达 ，将重组 α-葡萄糖苷酶 用于 制备 低聚 异麦 芽糖和抗性糊精，在45℃、pH 5 .5、加酶量5U/g、 底物浓度300g/L条件下，低聚异麦芽糖的产量达 216g/L ，转化率为72％。以 焦糊精为底物时 ，采用 分支酶 ，α-CGT酶 ，α-葡萄糖苷酶三酶复配来提 高抗性糊精成分，可以使焦糊精的抗性成分从原 先的44％提高至70％。此方法有效提高了生产效 率，降低了生产成本。
(10)申请公布号 CN 109576246 A (43)申请公布日 2019.04.05 C12P 19/02(2006 .01) C12P 19/12(2006 .01) C12R 1/84(2006 .01)
权利要求书1页 明书5页 序列表5页 附图3页
CN 109576246 A
CN 109576246 A
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CN 109576246 A
说 明 书
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一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用
技术领域 [0001] 本发明涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶突变 体及其在生产低聚异麦芽糖和抗性糊精中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术 [0002] α-葡萄糖苷酶在工业上可应用于低聚异麦芽糖(IMOs)的生产。低聚异麦芽糖又称 分支低聚糖，是一种以淀粉为原料采用全酶法工艺生产的糖浆，由2-10个葡萄糖残基构成， 分子中至少有1个α-1 ,6糖苷键，其他为α-1 ,4糖苷键。低聚异麦芽糖是世界上功能性低聚糖 中生产和销售量很高的 产品 ，它主要具有促进人体肠道内有益菌群增殖 ，抑制许多病原菌 和腐败菌的生长，增强人体免疫力降低血清胆固醇、甘油三酯及游离脂肪酸的含量，消除心 血管疾患的 病因 ；抗龋齿性甚佳 ，很难或不被人体消化吸收 ，提供的能量很低或根本没有 ， 可作为糖尿病人、肥胖病人和低血糖病人的保健甜味剂。 [0003] 目前工业化生产的低聚异麦芽糖是由黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶发酵生成的，虽 然其转苷能力较强，其转化率能达到60％左右，但水解能力也很强，最终生成的葡萄糖仍然 很多，限制了含α-1 ,6键的低聚糖含量。其次，黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶生成的低聚异麦 芽糖中的异麦芽糖含量较高 ，而异麦芽糖属于二糖 ，目前被认为不属于膳食纤维 ，降 低了该 低聚异麦芽糖产品的保健价值。 [0004] 抗性糊精由淀粉经过高温酸热降解，然后加工提纯而制成，它含有α-1 ,2与α-1 ,3 键，还含有α-1 ,4和α-1 ,6键，甚至在某些还原末端上含有β-1 ,6键的结构。其中α-1 ,3，α-1 , 2，α-1 ,6键不能被存在于人体内的各种消化酶分解，而且进入到人体消化道之后也不能被 小肠消化和吸收 ，所以能够进入到人体内大肠 ，被存在于人体大肠内的各种益生菌作为养 料所发酵，可以发挥膳食纤维的各种生理作用。抗性糊精还可以让人们感觉到饱腹感，适合 患有肥胖病的人使 用，抗性糊精没有甜味 ，能够保持原味 ，且极易溶于水呈中性 ，不仅能够 增加如饮料等的口感风味 ，作为食品添加剂添加到食品中也具有独特的优势。抗性糊精还 有许多益处，比如血糖反应较低，释放热量的时间也较长，还有它对肠道的蠕动和健康也非 常有益 ，利于排便 ；2012年期间我国卫生部门 第16号公告中明 确表示已 经将抗性 糊精视为 普通食品，这将使得抗性糊精在食品行业中的应用越来越广阔。 [0005] 目前抗性糊精的生产工艺一般为：淀粉-高温酸热水解-焦糊精-酶水解-提纯-喷 雾干燥。一般淀粉经过高温酸热水解后的 焦糊精中抗性含量可以 达到50％ ，工业生产中 用 糖化酶处理后 ，可形成抗性成分80％以 上的成品 ，但此生产方法反应条件剧烈、操作复 杂、 不利于环保。 [0006] 因此，提供一种成本低、操作简单且环保的低聚异麦芽糖和抗性糊精生产方法，对 于工业制备低聚异麦芽糖和抗性糊精有重要的应用价值。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910026579 .1
(22)申请日 2019 .01 .11
(71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号
(72)发明人 陈晟 吴敬 任莉琼
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211
权 利 要 求 书
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1 .一种α-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，含SEQ ID NO .1所示的氨基酸序列。 2 .编码权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体的基因。 3 .含权利要求2所述基因的载体或细胞。 4 .一种重组毕赤酵母，其特征在于，表达权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体。 5 .如权利要求4所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以Pichia pastoris KM71为表达宿 主，以pPIC9K为表达载体。 6 .一种生产α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，应用了权利要求4或5所述重组毕赤酵 母进行发酵。 7 .如权利要求6所述的方法，其特征在于，是挑取重组毕赤酵母单菌落接种到YPD培养 基中 ，28-32℃、200-220rpm ，培养20-30h ；将培养液按5-10％的 接种量接种到BMGY培养基 中 ，先于28-32℃、200-220rpm ，培养20-30h ，离心 ，弃上清 ，收集菌体 ，用BMGY培养基重悬菌 体，加入甲醇诱导产酶，28-32℃、200-220rpm，培养110-130h，发酵液经超声破碎后离心，上 清即为重组α-葡萄糖苷酶。 8 .权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体或表达权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体 的细胞在制备低聚异麦芽糖中的应用。 9 .权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体或表达权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体 的细胞在制备抗性糊精中的应用。 10 .权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体或表达权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体 的细胞在食品、饲料或制药领域中的应用。