点饱和突变技术及其在蛋白质工程中的应用_陶苏丹

起到事 半功 倍的 效 果。 G abor等 [17 ] 对 青霉 素 酰化 酶 A rg160、Phe161 和 Phe24 位点进行了多点饱和突变, 根 据 3个位点的位置关系, 设计了一对兼并引物, 其中正 向引物在 A rg160 和 Phe161 位点处, 反向引物在 Phe24 位点处, 以这对兼并引物扩增出的双链 DNA 片段作为 一对长引物进 行质粒扩增 诱变, 成功地 筛选出了 能提
或质粒扩增诱变, 有 时将两种或 多种方法结 合起来 会 高氨苄青霉素产量的进化子。 表 1 常用点饱和突变技术特性的比较
Tab le 1 The com par ison of sever a l techn iques of siteOsa tur a tion m u tagen esis
方法 寡核苷酸定向诱变 盒式诱变 突变引物诱变 重叠延伸 PCR
位点处交错, 互为模板重叠延伸成全长基因 (图 1 )。重 叠延伸 PCR 是 最 经典 的 点 饱 和 突 变的 方 法, D oucet 等 [14 ]利用此技术对大肠杆菌 BO内酰胺酶 Tyr105 进行 了点饱和突变, 研究 105 位氨基 酸在酶 识别底物 和稳 定底物中的作用, 分析表明, Ty r105 能赋予酶更高的底 物亲和性, 105位的芳香环在酶的活性中心形成一层墙 状结构, 对于稳定并水解底物具有非常重要的作用。
基于 PCR 的点饱 和突变方法相对简便, 其基本 原 理是在靶位点处设计兼并引物对目的基因进行扩增以 获取突变子。兼并引物一般设计成 NNN 或 NNX (N 代 表 4 种核苷酸等比例混合物; X 代表 2 种核苷酸等比例 混合物 (如 G /C 或 G /T), 4种或 2种 核苷酸在同一 位 点的替换不存在偏好性 [ 12 ]。根据扩增位点的不 同, 基 于 PCR 的点饱和突变方法分为以下几种。 1. 3. 1 突 变 引 物 诱 变 ( mu tagen ic oligonu cleotide O directed PCR amp lification ) 当 靶 位点 位于 基因 两 端 时, 可设计这样一对引物扩增目的基因, 正向引物为靶 位点突变 的 兼并 引 物, 反 向 引物 为 目 的基 因 序 列 引 物 [13 ]。突变引物诱变是基于 PCR 的点饱和 突变中 最 简单、最快速的方法, 但难以对基因中间的靶位点进行 点饱和突变。 1. 3. 2 重 叠 延 伸 PCR ( gene sp licing by overlap extension) 设计一对兼并引物, 使其在 靶位点附近 有 一定程度的重叠 (图 1 中的 B、C引物 ), 分别与基因 5c 和 3c端引物 (图 1中的 A、D 引物 )组合, 扩增含突变靶 位点的上游片段和 下游片段, 然 后将上下游 片段在 靶
收稿日期: 2007-04-24 修回日期: 2007-05-14 * 国家自然科学基金资助项目 ( 30671183) ** 通讯作者, 电子信箱: chendefu@ n anka.i edu. cn
1 常用点饱和突变技术
目前已 发展了多种 点饱和突变方 法, 主要有 以下 几种。 1. 1 寡 核 苷 酸 定 向 诱 变 ( oligonu cleot id eOd irected
质粒扩增诱变
基本原理 突变引物, 延伸 成全长 基因, 转 入细 胞内扩增 突变密码子盒 兼并引物, PCR 扩增目的基因
兼并引物, 重叠延伸
兼并引物, 扩增整个重组质粒
优点
易于筛选
不受位置限制, 易于多点饱和突变 简单方便, 突变率高 突变率高, 适合突变中间靶位点和多 点饱和突变
简单, 快捷, 适合各种位置的突变
m u tagen esis) 该方法于上世纪 70 年代末建立, 将目的基因克隆 到噬菌体 M13 单链表达载体上, 然后合成一段 在靶位 点处含突变寡核苷酸的引物, 使其与目的基因配对, 再 加入四种 dNTP和 K lenow DNA 聚合 酶, 使 寡聚核苷酸 引物延伸成全长基因, 获得的重组双链 DNA 分子转染 细菌后 大量 复制, 进而 筛 选出 阳性 突 变子 [1 ]。 Bethel 等 [3]用此法对 BO内酰胺酶 A sp104 位点进行点 饱和突 变, 获得了对头孢噻肟钠抗性增强的突变子 A sp104A rg 和 A sp104Lys; 对 B O内 酰 胺 酶 突 变 子 G ly238Ser 的 A sp104位点进行点饱和突 变, 获得了水解头孢 噻肟钠 活性提高 3倍的进化子, 进而确定 BO内酰胺酶的第 104 位点是非常重要的活 性位点。该法突 出优点是: 目的 基因可插入到 噬菌体衣壳 蛋白编码基 因内, 通过 噬菌 体表面展示技术可方便地筛选出重组子 [8 ]。不足之处 是: ( 1)对 19种氨基酸须分别设计各自寡核苷酸引物, 费用较大; ( 2 )大肠 杆菌宿主细胞存在自身 修复系统, 因突变修复而难以筛选出突变子; ( 3 )不适合多点饱和 突变 (m u ltip le siteOsatu ration mu tagenesis, MSM ) [9 ]。针 对上述问题, 各 生物技术公 司对相关技 术和产品 进行 不断 的改造与优 化, 如 Stratagene公 司和 Amersham 公
上世纪 70 年 代末, 加拿 大著名 科学家 Sm ith[1 ] 发 明了寡聚核苷酸定 点突变技术, 使蛋白质工 程翻开 了 新的一页, 他也 因此荣获 了 1993 年度诺 贝尔化学 奖。 时至今日, 定点突变 ( siteOd irected mu tagenesis)作为 一 种理性设计方案仍被广泛应用于蛋白质改造中。尽管 定点突变技术的应用极大地推动了蛋白质工程技术的 发展, 但其仍 面临着 自身无法 解决的 难题 )) ) 如何 从 其它 19种天然氨基酸 中找到合适 的替换者 来突变 靶 位点。近来一系列研究 表明, 多点 突变往往 能获得 比 单点突变更为理 想的进化子 [ 2], 多点突变是 定点突 变 不易直接获得的。对于定点突变技术不能解决的这些 问题, 恰恰是点饱和突变技术的独特之处。
图 1 重叠延伸 PCR 技术流程 A、D分别表示基因上下游引物; B、C 分别表示靶位点正反向 突变引物; 基因上的黑色区域为靶位点; NNN 表示兼并引物
或突变的核苷酸 F ig. 1 The pr otocol of gene sp lic ing b y
over lap exten sion 该法主要优点是: ( 1)能方便地对基因中间的靶位 点进行点饱和突变, 解决中间靶位点不易突变的难题; ( 2 )突变与重组同时完成, 大大缩短实验周期; ( 3 )不存 在突变修复问题, 容 易筛选出全部突变子; ( 4 )可方便 地进行多点饱和突变。不足之 处是: 当 靶位点靠 近目 的基因末端时, 分段扩增的片段过小而不易回收; 分别 扩增上下游片 段时, 不能使 用具有无模 板加尾性 能的 pol I型耐热 DNA 聚合酶, 而应使用无加尾性能的高保 真 A型或混合型耐热 DNA 聚合酶。 1. 3. 3 质粒扩增诱变 (mu tagen ic p lasm id amp lification) 在靶位点 处设计一对 反向兼并引物, 扩增质粒 全长 片段, 然后用 D pn I消化含甲基化位点的亲本链, 新合成 链由于没有甲基化位点而被保护。G eddie等 [15]利用此 法对葡萄糖醛酸酶 Ser557、A sn566 和 Lys568位点进行 了点饱和突变, 筛选出了 活性增强 的进化 子。由 于此 法需要扩增质粒全长序列, 因此在 PCR反 应中应特别
缺点
突变率低, 不宜多点饱和突变
需引入酶切位点, 筛选困难 不适合基因中间的靶位点突变 需经 3轮扩增, 不易对基因两端靶位 点进行突变 扩增片段长, 易导致 随机 突变, 需 用 高保真聚合酶
2 点饱和突变技术在蛋白质工程中的应用
所谓点饱和突变技术 ( siteOsatu ration m utagenesis), 是通过对目的蛋白 的编码基因 进行改造, 短 时间内 获 取靶位点氨基酸分 别被其它 19 种 天然氨基 酸所替 代 的突变子。它不是定点 突变技术 的简单延 伸, 而是 蛋 白质设计理念的全 面升华, 广泛 地应用于蛋 白质改 造 及结构 ) 功能关系研究中, 并取得 了一系列 令人瞩 目 的成绩。如利用点 饱 和突 变技 术 鉴定 蛋白 质功 能 位 点 [3 ], 提高酶比活 力 [ 4], 改善酶 热稳定性 [ 5]、底物结 合 特异性 [6]及立体异构特异性 [7 ]等多方面性质。本文概 述了几种常用点饱 和突变技术, 介绍了其在 蛋白质 工 程中的应用状况, 讨论了其在应用中的问题, 展望了其 应用前景。
DOI：10.13523/j.cb.20070815
中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2007, 27( 8): 82~ 86
点饱和突变技术及其在蛋白质工程中的应用*
陶苏丹 刘 佳 陈喜文 陈德富**
(南开大学生命科学学院分子遗传学研究室 天津 300071)
摘要 点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门新兴技术, 它通过对目的蛋白 19种氨基酸替代的突变子。此技术不仅是蛋白质定 向改造的强有力工具, 而且是蛋白质结构 - 功能关系研究的重要手段。概述了几种常用点饱和 突变技术, 介绍和讨论了它在蛋白质工程中的应用状况, 存在的问题, 并展望了其应用前景。 关键词 点饱和突变 蛋白质工程 靶位点氨基酸 重叠延伸 进化子 中图分类号 TQ 93
该法突出优 点是: 一个靶位 点两侧的酶 切位点 经 过改造可替换成其 它氨基酸, 相 对于寡核苷 酸定向 诱 变而言节省了引物 合成的费用, 而且可对多 个非邻 近 位点同时进行点饱和突变。不足之处是: ( 1)每个靶位 点两侧需分别设计酶切位点; ( 2 )密码子盒两端存在重 复序列, 因自连而增加突变子筛选难度。 1. 3 基于 PCR 的点饱和突变
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中国生物工程杂志 China Biotechnology
Vo.l 27 No. 8 2007
注意扩增的保真性, 一般采用高 保真 A 型或混合型 耐 热 DNA 聚合酶 。 [ 16 ]
表 1对上述几 种点饱和突 变技术进 行了比较, 可 以看出, 每种方法都有其独特之处, 应根据实际情况选 择合适方案。如靶位点 在目的基 因两侧, 一 般采用 突 变引物诱变法; 如靶位点在中间, 则选用重叠延伸 PCR
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陶苏丹 等: 点 饱和突变技术及其在蛋白质工程中的应用
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司选用突 变修 复缺损 株为 受体 菌来 降低 突变 修复 频 率。 1. 2 盒式诱变 ( Ca ssette m u tagen esis)
该法利用一种含有突变靶位点和特殊酶切位点序 列的密码子盒 ( codon cassette)来引入突变序列 [10 ]。由 于密码子盒可从正 反两方向插 入目的基因, 因此只 须 11种密码子盒就可替换产 生全部 20 种氨基酸以达 到 点饱和突变的效果, 如两侧为 CAG /GTC的密码子盒可 通过正反插入方式分别引入 G ln ( CAG )和 Leu ( CUG ) 密码子 [9 ]。 Lee等 [11 ]用此法对人类血清谷氨酸脱氢酶 (GLDH )的 Lys450 和 Tyr266 位点 分别进 行点 饱和 突 变, 发现 GTP浓度高达 300 Lm ol /L、ATP 浓度高达 100 Lm ol /L时, Lys450Ser和 Lys450G lu 突变子仍有 90% 活 性, 而野生型及 Tyr266 所有突变 子的活性明显受到 抑 制, 暗示 Lys450 位点在 GTP /ATP 调节中起着非常重要 的作用。