新城疫抗体检测

新城疫的抗体检测
某些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力, 称为病毒的血凝, 利用这种特性设计的实验称血球凝集试验, 以此来推断被检材料中有无病毒存在, 是非特异性的, 但病毒的血凝可为相应的抗体所抑制, 即血球凝集抑制实验（HI）, 通过血凝与血凝抑制试验, 可用已知血清来鉴定未知病毒, 也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

一目的意义
1免疫监测（1）免疫效果评价（2）免疫时机确定
2诊断疾病（根据有无抗体或抗体的高低）
3流行病学调查
二试验仪器与试剂
1试验仪器离心机、离心管两支、50ml量筒一个、V型微量反应板、微量加样器（移液器）、塑料吸头（黄色）若干、1ml吸管1支、胶头滴管两支、微量振荡器、
电热恒温培养箱、托盘天平。

2试验试剂鸡新城疫抗原、流感H5.H9抗原、1%鸡红细胞、生理盐水、3.8%柠檬酸钠抗凝剂、待检血清。

三方法
1病毒的血凝试验
1.1 3.8%柠檬酸钠抗凝剂的配制: 用托盘天平称取柠檬酸钠3.8克溶于100ml蒸馏水或纯净水中, 摇匀使其充分溶解即可, 有条件的可121℃高压蒸汽灭菌20分钟, 冷却至室温后置4℃冰箱中保存备用。

1.2 1%鸡红细胞制备过程：事先用5ml（或10ml）的注射器吸入抗凝剂若干（其量为所需血量的1/5）,从健康公鸡（未经新城疫疫苗注射）的心脏或翅下静脉采取2-4毫升血液,以2000转每分钟, 离心5分钟, 吸去上清液（注意要将血细胞泥表面的一种薄膜吸净）。

然后用生理盐水（用量为血细胞泥的5-10倍）洗红细胞, 离心5分钟, 弃去上清液, 如此反复洗3-5次, 直至上清液透明清亮为止, 最后一次要用生理盐水将血细胞泥稀释成1%浓度, 然后置4℃冰箱备用（一般可保存3天）。

1.3 红细胞凝集试验（血凝试验）操作方法（见表1）:
（1）取一块洁净的96孔V型微量血凝反应板, 用微量移液器从第一列第一孔开始依次加入生理盐水, 每孔25微升, 直至加到第十五孔（第一列12孔, 第二列3孔）。

（2）取新城疫抗原液25微升加入第一孔中, 充分混合后吸取25微升加入第二孔中, 如此直至第14孔, 混合后吸取25微升丢弃, 第15孔不加病毒为对照。

（3）更换移液器前端的塑料吸头, 每孔加已备的1%鸡红细胞液各25微升（注意从后往前加）。

（4）将反应板置微型震荡器上, 振动混合1分钟, 取下置37℃恒温箱中作用30分钟后开始观察结果, 注意每五分钟观察一次, 直至30分钟, 判定并记录结果。

判定结果如下:
++++——红细胞全部凝集, 均匀分布于孔底。

++-------红细胞部分凝集, 沉积于孔底呈小圆点状。

-——红细胞全部不凝集, 沉积于孔底呈圆点状。

以使红细胞全部凝集的病毒最高稀释倍数为该病毒的凝集效价。

4单位病毒的确定, 以上述血凝价除以4即为4单位病毒, 如血凝价为1:128, 则1:128的0.1ml中有一个凝集单位, 4单位病毒为128/4=32, 即1:32为4个凝集单位。

稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128
256
512
1024 2048 4096
8192
16384 对照组
生理盐水 抗原 1%鸡红细胞
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
振荡混匀置30℃恒温箱30分钟
2血凝抑制试验（HI ）血凝试验可以被病毒血清所抑制, 因此可以通过血凝抑制试验检测抗病毒抗体。

根据抗体效价的高低, 可制订预防疾病的合理的免疫程序, 也可间接得知鸡群是否存在病毒, 对科学地防治具有重要意义。

具体方法如下（见表2）:
（1） 清洁的96孔V 型微量血清反应板一块, 在每孔中加生理盐水25微升（每一份血清加一列）。

（2） 将被检血清25微升加入第1孔中, 充分混合后, 取25微升加入第2孔中, 如此稀释直至第10孔, 第11孔不加血清为抗原对照孔, 第12不加血清和抗原为红细胞对照。

（3） 根据血凝试验测定的病毒效价, 配制4个血凝单位病毒稀释液。

（4） 将反应板置混合器上振荡3分钟, 取下放室温10分钟。

（5） 每孔中加入1％鸡红细胞各25微升。

（6） 置微型混合器上振荡３分钟, 取下放室温15分钟开始观察, 至60分钟判定记录结果.
振荡混匀1分钟后置37℃恒温箱中作用15分钟
以100％抑制凝集的血清最大稀释倍数为该血清的血凝抑制效价即滴度。