一种斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010293123.4
(22)申请日 2020.04.15
(71)申请人 江苏艾津农业科技服务有限公司
地址 211500 江苏省南京市六合区横梁街
道三友湖村三友水库之南
(72)发明人 李明　鲁平　叶发林　袁飞　
金振鹏　
(74)专利代理机构 南京瑞华腾知识产权代理事
务所(普通合伙) 32368
代理人 梁金娟
(51)Int.Cl.
C12N 7/00(2006.01)
C12N 5/07(2010.01)
A01N 63/40(2020.01)
A01P 7/04(2006.01)
(54)发明名称
一种斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法
(57)摘要
本发明公开了一种斜纹夜蛾核型多角体病
毒的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)
病毒的浓缩；(2)细胞的培养；(3)病毒的接种等
步骤。

本发明的方法可以有效的在原来的基础上
提高多角体病毒的生产效率，缩短多角体病毒的
生产周期，降低了生产成本。

根据本发明的制备
方法得到的斜纹夜蛾核型多角体病毒特异性强，
对斜纹夜蛾特效，对人畜及其他生物安全，对抗
药性、顽固性害虫作用突出，使用后不会产生抗
药性。

权利要求书1页 说明书7页CN 111321124 A 2020.06.23
C N 111321124
A
1.一种斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：
(1)病毒的浓缩：将游离态的斜纹夜蛾核型多角体病毒接种到纹夜蛾SL -1细胞系，培养一段时间后经离心分离得上清液，将上清液浓缩，即得浓缩型的病毒液，置于冰箱中保存；
(2)细胞的培养：将斜纹夜蛾SL -1细胞系培养至300-400w/ml后分装到离心管中离心分离，将分离得到的细胞沉淀物重悬，然后分装并稀释成不同密度的细胞液；
(3)病毒的接种：将上述步骤(1)中制备的游离态的斜纹夜蛾核型多角体病毒接种到上述步骤(2)中制备得到的细胞液中并培养一段时间后经离心分离，收集得到的上清液用作再次侵染的毒源，收集得到的细胞沉淀物经粉碎后即制得斜纹夜蛾核型多角体病毒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述斜纹夜蛾细胞系的密度为200w/ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述游离态的斜纹夜蛾核型多角体病毒与所述斜纹夜蛾细胞系按照体积比为5:100的比例进行接种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述斜纹夜蛾细胞系的体积为200ml。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述培养时间为4-5天，所述离心条件为：转速8000r/min，时间20min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中所述离心条件为：转速1000r/min，时间5min。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中所述重悬后的细胞密度为600w/ml。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中所述稀释后的细胞液密度为100-300w/ml。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(3)中所述游离态的斜纹夜蛾核型多角体病毒与培养后的细胞液按照体积比为(2-10):100的比例进行接种。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(3)中所述培养时间为7-10天，所述离心条件为：转速8000r/min，时间20min。

权　利　要　求　书1/1页CN 111321124 A
一种斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物杀虫剂技术领域，特别是涉及一种斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法。

背景技术
[0002]随着农业生产的发展，人们迫切希望绿色甚至有机消费，并迫切希望有对环境和人类无危害的农药来保证作物的生长和食用的安全。

[0003]目前，农民施用的农药，大多是化工原料制成，化学农药能快速杀死害虫提高农作物产量，但其亦会残留在农作物上或进入人类生态循环系统中，危害人类的身体健康，农作物的污染是其叶茎直接吸附和从根部渗透吸收，化学农药的施放，如农药残留物有有机磷、有机氯等，人类每天在摄取含有农药残留物的蔬菜、水果以及水等都会危害身心健康。

因此施用化学农药过多会使得这些农作物常因残留农药成分过高而被国内外销售市场拒绝，造成不少农产品滞销。

[0004]化学农药经常使用会使部分害虫产生抗药性，这会使得害虫防治变得更加艰难，但以生物治虫的生物农药对农作物无任何副作用，且害虫不会产生抗药性，能更好的为农作物的生长提供保障，对人类的生态循环系统也无任何的毒副作用。

[0005]昆虫病毒不仅被广泛用作外源基因的表达载体，以编码医学、药学和兽医学上重要的蛋白物质，而且还因其特异性强的优势而用来作为农业、林业上害虫的重要杀虫剂。

目前商业上或者相关技术上的多角体病毒产品大多数还是通过培养昆虫幼虫感染病毒所得，这种方法既昂贵、费时，又很难大规模生产，无法适应现代化生产的需要。

[0006]由此可见，上述现有的斜纹夜蛾核型多角体病毒在制备方法上，显然仍存在有不便与缺陷，而亟待加以进一步改进。

为了解决斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法中存在的问题，相关厂商莫不费尽心思来谋求解决之道，但长久以来一直未见适用的设计被发展完成，而一般又没有适切的方法能够解决上述问题，此显然是相关业者急欲解决的问题。

[0007]有鉴于上述现有的斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法所存在的缺陷，本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种新的斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法，能够改进一般现有的斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法，使其更具有实用性。

经过不断的研究、设计，并经反复试作及改进后，终于创设出确具实用价值的本发明。

发明内容
[0008]本发明的主要目的在于，克服现有的斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法存在的缺陷，而提供一种新的斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法，所要解决的技术问题是使其产量高，生产周期短，从而更加适于实用，且具有产业上的利用价值。

[0009]本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

[0010]根据本发明提出的一种斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法，其中，该方法包括
以下步骤：
[0011](1)病毒的浓缩：将游离态的斜纹夜蛾核型多角体病毒感接种到纹夜蛾细胞系，培养一段时间后经离心分离得上清液，将上清液过滤，即得浓缩型的病毒液，置于冰箱中保存；
[0012](2)细胞的培养：将斜纹夜蛾SL-1细胞系培养至300-400w/ml后分装到离心管中离心分离，将分离得到的细胞沉淀物重悬，然后分装并稀释成不同密度的细胞液；
[0013](3)病毒的接种：将上述步骤(1)中制备的游离态的斜纹夜蛾核型多角体病毒接种到上述步骤(2)中制备得到的细胞液中并培养一段时间后经离心分离，收集得到的上清液用作再次侵染的毒源，收集得到的细胞沉淀物经粉碎后即制得斜纹夜蛾核型多角体病毒。

[0014]前述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述斜纹夜蛾细胞系的密度为200w/ml。

[0015]前述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述游离态的斜纹夜蛾核型多角体病毒与所述斜纹夜蛾细胞系按照体积比为5:100的比例进行接种。

[0016]前述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述斜纹夜蛾细胞系的体积为200ml。

[0017]前述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述培养时间为4-5天，所述离心条件为：转速8000r/min，时间：20min。

[0018]前述的制备方法，其中，所述步骤(2)中所述离心条件为：转速1000r/min，时间：5min。

[0019]前述的制备方法，其中，所述步骤(2)中所述重悬后的细胞密度为600w/ml。

[0020]前述的制备方法，其中，所述步骤(2)中所述稀释后的细胞液密度为100-300w/ml。

[0021]前述的制备方法，其中，所述步骤(3)中所述游离态的斜纹夜蛾核型多角体病毒与培养后的细胞液按照体积比为(2-10):100的比例进行接种。

[0022]前述的制备方法，其中，所述步骤(3)中所述培养时间为7-10天，所述离心条件为：转速8000r/min，时间20min。

[0023]借由上述技术方案，本发明的一种斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法至少具有下列优点：
[0024](1)本发明的方法是在离体大规模培养昆虫细胞来大量生产多角体病毒的基础上，分别对接毒比例和接毒时细胞密度进行了优化，可以有效的在实验室基础上提高多角体病毒的生产效率，缩短多角体病毒的生产周期，降低了生产成本。

[0025](2)根据本发明的制备方法得到的斜纹夜蛾核型多角体病毒对斜纹夜蛾有较强的专一性，且其选择性强，不伤天敌，对斜纹夜蛾特效，对人畜及其他生物安全，对抗药性、顽固性害虫作用突出，使用后不会产生抗药性。

[0026](3)根据本发明的制备方法得到的斜纹夜蛾核型多角体病毒后效作用显著，病毒能够在数代害虫之间传播流行，药效持续时间长。

有效成分含量高，剂型先进，用量少，使用方便。

[0027]综上所述，本发明特殊的斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法，能够有效提高多角体病毒的产量并缩短生产周期。

其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类方法中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，其不论在方法上或产品性能上皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有的方法具有增进的多项功效，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。

[0028]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

具体实施方式
[0029]为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的斜纹夜蛾核型多角体病毒的制备方法其具体实施方式、方法、步骤、结构、特征及其功效，详细说明如后。

[0030]实施例1-6
[0031]本发明的实施例均按照以下方法实施：
[0032]一、所用的实验器材包括：
[0033]移液枪
[0034]Thermo高速离心机(货号：75004250)
[0035]生化培养箱(型号：ZXSD-1160)
[0036]无菌净化台(博迅型号：BJ-2CD)
[0037]中空纤维柱100Kd(Spectrum公司)
[0038]二、具体步骤如下：
[0039]1、斜纹夜蛾核型多角体病毒BV的浓缩
[0040]将游离态的斜纹夜蛾核型多角体病毒接种到纹夜蛾SL-1细胞，接种时细胞密度为200w/ml(万/毫升)，接毒比例为5％，接种体积分别为200ml，培养4-5天后收毒。

将接毒培养4-5天的细胞培养液分装到50ml离心管，8000r/min离心20min，去除细胞碎片，上清用100kd 的中空纤维柱进行10倍浓缩，得浓缩型的病毒液，无菌过滤后放置4℃冰箱备用。

[0041]2、斜纹夜蛾SL-1细胞系的培养
[0042]将斜纹夜蛾SL-1细胞系培养至300-400w/ml后，分装到50ml离心管中，每管40ml，1000r/min离心5min，倒掉上清，用20ml sf-9细胞培养基重悬细胞沉淀物，此时每管细胞密度为600w/ml。

分别取2ml、4ml、6ml到50ml摇瓶中，稀释至12ml，使得细胞密度分别为100w/ ml(2瓶)、200w/ml(4瓶)、300w/ml(6瓶)。

[0043]3、病毒的接种
[0044]分别在上述步骤中制得的三种密度的细胞中接种病毒，其中：
[0045]实施例1：在密度为100w/ml的细胞中接毒240ul，使得接毒比例为2％(实施例1)，接2瓶。

[0046]实施例2-3：在密度为200w/ml的细胞中分别接毒240ul、600ul，使得接毒比例分别为2％(实施例2)、5％(实施例3)，每种接2瓶。

[0047]实施例4-6：在300w/ml密度细胞中分别接毒240ul、600ul、1.2ml，使得接毒比例分别为2％(实施例4)、5％(实施例5)、10％(实施例6)，每种接2瓶。

[0048]接毒后放至27度培养箱的摇床上培养。

每隔24小时取样观察各个处理中细胞状态，及细胞中多角体的形成情况。

总共观察6天，第6天观察结束后，8000r/min下离心分离20min，然后分别收集上清液和细胞沉淀，置于-80℃保存。

将6天结束后收集的细胞沉淀分别用无菌水定容至20ml，超声破碎后统计多角体的数目，计算出在各个比例和密度下的单个细胞产生的多角体数目。

具体结果见如下表1。

[0049]表1.不同接种比例的细胞死亡率和多角体病毒形成情况汇总
[0050]
[0051]
[0053]由上表1可以看出，能产生多角体病毒的细胞占总细胞的65％左右，可能是部分的细胞对斜纹夜蛾核型多角体病毒不敏感。

100w/ml密度，接毒比例2％，共产生的多角体为25*107PIB，细胞总数为3708万，每个细胞产生多角体数目为6.74个。

200w/ml密度，接毒比例2％，共产生的多角体为60.25*107PIB，细胞总数为7407万，每个细胞产生多角体数目为8.13个；200w/ml密度，接毒比例5％，共产生的多角体为53.45*107PIB，细胞总数为7176万，每个细胞产生多角体数目为7.45个。

300w/ml密度，接毒比例2％，共产生的多角体为73.65* 107PIB，细胞总数为8376万，每个细胞产生多角体数目为8.8个；300w/ml密度，接毒比例5％，共产生的多角体为58.8*107PIB，细胞总数为7596万，每个细胞产生多角体数目为7.74个；300w/ml密度，接毒比例10％，共产生的多角体为50.4*107PIB，细胞总数为6720万，每个细胞产生多角体数目为7.5个。

[0054]从上述结果来看，同等BV条件下，同等时间内，300w/ml的细胞密度，接毒比例2％(实施例4)时，最终产生的多角体数目明显高于其他实验组。

[0055]试验例1、斜纹夜蛾多角体病毒农药对斜纹夜蛾的杀虫效果评价
[0056]将上述实施例中制备得到的多角体制成相应制剂，一般为有效成分含量为10亿PIB/mL，每公顷用量900-1125ml，每公顷用水量450公斤。

在傍晚或阴天进行喷药，尽量避免阳光直射，并且使用时不可与碱性物质混合。

[0057]对三块相同面积(每块面积20平方米)的甘蓝田亩(编号1、2、3)预先统计每块田的斜纹夜蛾的活虫数量，斜纹夜蛾大部分处于幼虫期2龄-3龄，其中，一块(编号为1)喷洒本发明的多角体病毒农药，含量10亿PIB/mL，用药量70ml/亩；另一块喷洒普通农药5％甲维盐悬浮剂，用药量20ml/亩(编号为2)；最后一块(编号为3)不做任何处理，施药后第3、7和14天分别统计各个田间的斜纹夜蛾活虫数量，具体结果见表2。

[0058]表2.不同处理条件下的斜纹夜蛾多角体病毒对斜纹夜蛾的防效情况对比
[0060]由上述表2可以看出，施用本发明的斜纹夜蛾多角体病毒农药的蔬菜田间7天后和14天的斜纹夜蛾的防效明显高于施用普通农药的蔬菜田。

因此，本发明的生物农药选择性强，不伤天敌，对斜纹夜蛾特效，对人畜及其他生物安全。

对抗药性、顽固性害虫作用突出，使用后不会产生抗药性。

后效作用显著，病毒能够在数代害虫之间传播流行，药效持续时间长。

有效成分含量高，剂型先进，用量少，使用方便。

[0061]基于目前市面上的多角体病毒大多通过虫体制备，但是杂质多，而该发明通过细胞培养来制备多角体，得到的多角体更纯净，利于制剂的制备。

国内外在实验室基础上通过细胞培养来大规模生产多角体一直还处于摸索阶段，没有具体数据来支撑在何种条件下获得最多的多角体病毒，该发明在实验室基础上优化了如何在同等条件下获得最多的多角体病毒，为大规模制备多角体病毒提供了依据，达到了节约成本的目的。

[0062]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案
的范围内。