流式细胞分析仪在细胞因子检验中的应用价值

流式细胞分析仪在细胞因子检验中的应用价值
董一波，沈煜轩，姚沈明
江苏盛泽医院检验科，江苏盛泽215228
[摘要]目的分析流式细胞分析仪在细胞因子检验中应用的价值。

方法选取2023年2—5月在江苏盛泽医院接受健康体检者和门诊住院患者（共112例）血浆标本，运用流式细胞分析仪分析血浆标本的8项细胞因子精密度、准确度和线性范围验证实验结果。

结果低值和高值连续5 d检测结果变异系数（coefficient of vari⁃ability, CV）均≤15%。

低值和高值连续5 d检测结果准确度均符合（偏差≤±15%）范围。

8项细胞因子检测试剂盒在流式细胞分析仪上检测结果均在范围内呈线性，满足准确度（r2≥0.98）的标准范围，r2分别为0.998 8、1.000 0、1.000 0、0.999 8、1.000 0、0.999 4、0.999 5、0.984 3。

结论流式细胞分析仪在细胞因子检测中的应用
的准确度、可靠性和重复性较好，能满足临床需求，可广泛应用于实验室相关检测当中。

[关键词]流式细胞分析仪；细胞因子；临床检验
[中图分类号]R4 [文献标识码]A [文章编号]2096-1782（2023）10(b)-0040-04 Application Value of Flow Cytometry in Cytokine Detection
DONG Yibo, SHEN Yuxuan, YAO Shenming
Department of Laboratory, Jiangsu Shengze Hospital, Shengze, Jiangsu Province, 215228 China
[Abstract] Objective To analyze the application value of flow cytometry in cytokine detection. Methods Plasma samples were collected from 112 patients (in total) who received physical examination in Shengze Hospital from Febru⁃ary to May 2023. The accuracy, accuracy and linear range of 8 cytokines in plasma samples were analyzed by flow cy⁃tometry to verify the experimental results. Results Coefficient of variance (CV) values of both low and high values for 5 dconsecutive days were ≤15%. The accuracy of low and high values for 5 d continuous detection was in the range of (deviation≤±15%). The results of 8 cytokine detection kits on flow cytometry analyzer were linear in the range, meet⁃ing the standard range of accuracy (r2≥0.98), r2was 0.998 8, 1.000 0, 1.000 0, 0.999 8, 1.000 0, 0.999 4, 0.9995, 0.9843, respectively. Conclusion The accuracy, reliability and repeatability of flow cytometry in the detection of cyto⁃kines are good, which can meet the clinical needs, and can be widely used in laboratory related detection.
[Key words] Flow cytometry; Cytokines; Clinical examination
流式细胞分析仪在细胞因子检验中具有重要的应用价值。

细胞因子是一类分泌性蛋白质，在免疫系统中扮演着关键的角色，调控细胞间的相互作用和信号传导，影响着炎症、免疫反应和细胞生长等生理过程[1-2]。

对于了解炎症、免疫反应、感染、自身免疫性疾病等生理和病理过程，以及指导相应的诊断和治疗，细胞因子的检测显得至关重要。

过去几十年中，流式细胞分析仪已经成为在细胞因子检验中广泛应用的工具之一，其应用价值愈加凸显。

因此，研究和监测细胞因子的表达水平对于了解免疫系统的功能、疾病诊断和治疗等领域具有重
要意义[3-4]。

传统的细胞因子检验方法包括酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）和免疫印迹等，这些方法通常需要较多的样本量，耗时且复杂，不适用于大规模样本的高通量
分析[5-6]。

流式细胞分析仪的出现革命性地改变了细胞因子检验的方式，本研究将2023年2—5月在江苏盛泽医院接受健康体检和门急诊住院的112例患者作为研究对象，探讨流式细胞分析仪在细胞因子检验中应用的价值，现报道如下。

DOI：10.19368/ki.2096-1782.2023.20.040
[作者简介] 董一波（1984-），男，本科，主管检验师，研究方向为流式细胞。

1 资料与方法
1.1一般资料
选取本院接受健康体检者和门急诊住院患者（共112例）的血浆标本，确保标本无溶血、血脂及血凝块现象。

采用BD FACS Canto Ⅱ流式细胞分析仪（生产厂家：青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司）的8项细胞因子检测试剂盒进行检验。

1.2方法
检测项目：用8项细胞因子检测试剂盒对标本的白细胞介素（interleukin, IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、干扰素γ（interferon-γ, IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的浓度及分布。

检测原理：试剂盒在免疫学分析法基础上运用直接夹心法的原理进行分析，与常规“三明治”免疫分析方法相同，采用荧光发光微球做免疫反应的固相，随后采用免疫学分析法将其与流式细胞分析仪相结合，检测血浆标本中细胞因子的浓度水平。

技术原理：采用荧光发光微球耦联的细胞因子抗体与生物素所标记的循细胞因子配对抗体、标本以及校准品中的细胞因子相结合，从而形成“三明治”复合物，随后与加入标记有藻红蛋白的SA-PE 反应进行分析。

具体荧光发光强度采用流式细胞分析仪进行检测，得到标本中含有的细胞因子浓度，从而加以分析。

预处理方法：在验证其性能前就需要校对仪器的标准性，检测质量控制的有效性，保障仪器的标准性和检测质量在可控范围内方可开展检测工作。

检测方法：首先将实验用试剂恢复到与室内温度相同的标准，在冻干粉基质当中添加5 mL实验缓冲液，将其静置15 min，等到冻干粉溶解后采用涡旋旋转方式将其进行充分搅匀，剩余的基质分装到EP管当中，将其储存到-20℃的环境下维持1个月。

在校准品冻干粉当中添加250 L实验缓冲液，将冻干粉完全溶解后在常温室内静止10 min，浓度为1 000.00 pg/mL，将其标注为A7。

准备6支空管，将其分别标记为A1、A2、A3、A4、A5、A6，并在每支空管中放置75 L实验缓冲液，并进行倍比稀释，在A7中取25 L溶液放置到A6当中并充分混合，采用同样的方法依次进行稀释，分别得到A1、A2、A3、A4、A5的校准品。

此外，再选取1支空管，只加入实验缓冲液，将其标注为A0。

A0~A7校准品终浓度为：A0 0.00 pg/mL，A1 2.44 pg/mL，A2 9.77 pg/mL，A3 39.06 pg/mL，A4 156.25 pg/mL，A5 625.00 pg/mL，A6 2500.00 pg/mL，A7 1000.00 pg/mL。

标本根据实
际情况使用实验缓冲液，并进行稀释，在校准管中分别添加25 L的基质与校准品，在标本馆中分别添加25 L的试验缓冲液和稀释样品，再在所有管中添加25 L捕获微球抗体，振荡均匀1 min后再加入25 L检测抗体，将试管用锡箔纸包住，在室内温度为25℃左右的环境下避光震荡2 h。

随后添加25 L SA-PE，用锡箔纸包住后在室内温度为25℃左右的环境下避光震荡30 min，2 500 r/min，离心处理5 min，除去上清液后添加200 L 10×洗涤缓冲液，采用旋涡将微球重悬30 s，1 600 r/min离心处理5 min 后去除上清液，结合流式细胞分析仪上样的需求在每个试管内添加150~300 L洗涤缓冲液，经涡旋微球重悬后上机进行检测。

1.3观察指标
①分析8项细胞因子的精密度，连续5 d做精密度校准检测，每天对同一浓度的精密度具有溯源性的校准品，检测5次，每个标本获取25组数据。

经结果的统计与分析，计算变异系数（CV值）。

精密度范围CV≤15%。

②分析8项细胞因子的准确度，连续5 d做准确度检测，每天对统一浓度的准确度校准品做3次测定，每个标本获取15组数据，对结果进行记录并加以分析，相对偏差≤±15%则准确度可靠。

③分析8项细胞因子线性范围验证实验结果，首先采用Grubbs法剔除离群值，运用Excel做回归方程的现行分析，判断是否为非线性，按照浓度血清的配置稀释关系计算各实验样品内含有的分析物浓度，获取系列样品的理论值。

根据系列浓度血清进行反复测定，计算均值，每份均值与理论值做相关分析，偏离<10%，计算方法：Y=bX+a。

1.4统计方法
用SPSS25.0统计学软件和Microsoft Excel 2013软件处理并分析数据，计算CV值和相对偏差值。

采用Pearson相关分析对线性验证中各浓度理论值和实测值的关系进行分析，计数资料用例数（n）和率（%）表示，进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.18项细胞因子精密度分析
低值和高值连续5 d检测结果CV值均≤15%，见表1。

2.28项细胞因子准确度分析
低值和高值连续5 d检测结果准确度均符合（偏差≤±15%）范围，见表2。

2.38项细胞因子线性规范验证实验结果分析
8项细胞因子检测试剂盒在流式细胞分析仪上检测结果均在范围内呈线性，各细胞因子线性理论范围为2.44~1 000.00 pg/mL，r2≥0.98，满足准确度标准范围，见表3。

3 讨论
流式细胞分析仪能够同时测量多个细胞因子的表达水平，包括细胞表面标志物和胞内细胞因子[7-8]。

这种多参数分析使研究人员能够全面了解免疫细胞群体的状态，揭示不同细胞亚群之间的差异，为疾病诊断和治疗提供更准确的信息[9-10]。

流式细胞分析仪能够检测极低浓度的细胞因子，因此对于疾病早期诊断和监测起着至关重要的作用[11-12]。

此外，它可以在短时间内分析大量样本，适用于临床试验、药物筛选和流行病学研究等需要高通量分析的场合[13]。

该检测方式还可以用于动态监测细胞因子的变化，例如，在治疗过程中追踪患者的免疫反应或观察细胞因子的时空表达[14]。

表1　8项细胞因子精密度分析（%）
项目IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 IFN-γIL-17 IFN-γTNF-α
低值（625.00 pg/mL）批内CV
第1天
2.35
4.85
1.86
8.69
14.25
9.42
13.98
10.86
第2天
3.34
3.56
1.85
9.16
4.15
2.98
5.34
5.58
第3天
2.28
2.13
2.34
12.58
4.62
3.85
4.85
7.31
第4天
2.64
2.85
2.46
7.58
1.43
2.84
5.84
4.28
第5天
2.58
2.75
2.34
4.25
1.84
2.58
3.46
3.31
低值（625.00 pg/
mL）批间CV
2.58
9.25
1.46
8.43
3.29
2.57
5.34
3.75
高值（2 500.00 pg/mL）批内CV
第1天
4.13
3.58
4.13
13.25
11.25
10.58
10.64
8.46
第2天
4.26
1.85
4.58
9.45
5.16
2.13
2.58
7.46
第3天
2.34
1.58
3.54
5.98
3.26
1.58
5.85
7.46
第4天
4.25
1.58
3.26
5.46
3.34
2.64
1.85
4.28
第5天
2.13
0.89
1.68
5.46
3.25
4.26
4.16
3.98
高值（2 500.00 pg/
mL）批间CV
4.13
6.45
4.25
14.13
5.58
4.36
5.16
11.15
表2　8项细胞因子准确度分析（pg/mL）
项目IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 IFN-γIL-17 IFN-γTNF-α
低值（625.00 pg/mL）批内相对偏差
第1天
2.31
11.25
-0.85
1.15
1.54
3.58
6.66
5.34
第2天
-3.46
-4.16
-5.28
3.89
-0.46
-7.58
-7.13
0.89
第3天
-4.28
10.23
-4.65
3.56
1.58
-2.58
-7.15
0.48
第4天
-3.75
8.46
-4.13
6.25
-2.46
-7.46
-7.58
-2.13
第5天
-4.25
-11.13
-2.58
-10.14
-3.46
-8.46
-5.13
-6.89
低值（625.00 pg/mL）
批间相对偏差
-2.64
2.85
-3.72
0.98
-0.79
-4.58
-1.58
-0.55
高值（2 500.00 pg/mL）批内相对偏差
第1天
3.58
1.84
6.43
6.76
-9.46
-7.13
-14.76
-11.95
第2天
-0.34
-1.25
0.58
-0.48
1.88
-4.46
-9.13
-6.58
第3天
1.98
-3.13
-0.46
1.28
-1.31
-5.23
-6.28
-1.25
第4天
2.46
-1.48
0.58
-12.68
0.08
0.79
-8.13
-10.58
第5天
7.13
-12.13
5.46
-13.02
2.43
2.96
-6.13
0.84
高值（2 500.00 pg/
mL）批间相对偏差
2.89
-3.16
2.46
-3.28
-1.19
-2.46
-8.50
-5.16
表3　8项细胞因子线性规范验证实验结果分析（pg/mL）
项目IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 IFN-γIL-17 IFN-γTNF-α理论值A1
2.46
5.64
2.34
2.58
1.87
1.96
2.13
1.89
2.58
A2
9.58
15.13
9.18
7.45
8.15
7.46
8.46
3.58
9.87
A3
39.13
29.41
38.13
26.46
37.13
36.41
37.15
36.85
39.42
A4
163.46
162.43
161.43
182.13
164.13
153.28
157.14
166.43
155.45
A5
601.13
672.13
592.13
543.13
537.13
573.18
549.13
593.13
628.13
A6
2 584.43
2 485.13
2 684.64
3 115.13
3 152.13
2 356.13
2 031.13
2 364.13
2 500.00
A7
8 946.16
9 431.58
10 534.16
10 643.13
9 648.13
10 643.13
9 834.26
12 462.23
10 000.00
回归方程
Y=1.114 3X-59.462 0
Y=1.035 2X-16.135 0
Y=0.949 5X+13.462 0
Y=0.934 8X-31.258 0
Y=1.053 2X+2.635 4
Y=0.983 4X+43.993 0
Y=1.085 3X+43.132 0
Y=0.840 5X+108.165 0
r2
0.998 8
1.000 0
1.000 0
0.999 8
1.000 0
0.999 4
0.999 5
0.984 3
这有助于个体化治疗的制定和疾病进展的监测。

吴晗等[15]在研究中指出8项细胞因子低值和高值精密度在CV≤15%范围内，准确度在偏差≤±15%
范围内，且各项细胞因子线性理论范围2.44~10 000.00 pg/ml，r2≥0.98，符合准确度的需求。

本研究最终研究结果与该学者研究结果一致，证明本研
究具有较高的可行性。

本研究中指出，8项细胞因子的低值批间CV值
为 2.58%、9.25%、1.46%、8.43%、3.29%、2.57%、5.34%、3.75%；高值批间CV值为4.13%、6.45%、4.25%、14.13%、5.58%、4.36%、5.16%、11.15%。

8项细胞因子准确度分析，低值批间相对差分别为-2.64、2.85、-3.72、0.98、-0.79、-4.58、-1.58、-0.55；高值批间相对差分别为2.89、-3.16、2.46、-3.28、-1.19、-2.46、-8.50、-5.16。

8项细胞因子线性规范实验结果中r2值分别为0.998 8、1.000 0、0.999 8、1.000 0、0.999 4、0.999 5、0.984 3，在r2≥0.98标准范围内。

因此，流式细胞分析仪在细胞因子检测中应用的精密度、准确度和现行规范结果均符合标准范围，可在临床检测中提供准确且可信的数据，以供参考。

综上所述，流式细胞分析仪在细胞因子检验中应用的精密度、准确度及重复性较好，可满足临床需求，值得在实验室相关检测中推广应用。

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