mRNAstability
真核生物mRNA稳定性的控制机制
真核生物mRNA稳定性的控制机制韩 飞 王 高(海南大学生命科学与农学院,海南海口 570228)摘 要:真核生物mRNA的稳定性的调节是调节基因表达的主要机制之一。
调控mRNA的途径主要有4个:mRNA 自身的序列元件(5′-帽结构、5′-非翻译区、编码区、3′-非翻译区、poly(A)尾巴、5′-和3′-两末端的相互作用), mRNA结合蛋白(5′-帽结合蛋白、编码区结合蛋白、3′-UTR结合蛋白、poly(A)结合蛋白),mRNA的翻译产物(自主调控),核酸酶、病毒等因素对mRNA稳定性的控制。
关键词:mRNA序列;结合蛋白;翻译产物中图分类号 Q522 文献标识码 B 文章编号 1007-7731(2007)11-27-03Regul a ti on of eukaryote m RNA st ab ilityHan Fe iW ang Gao (life science and agriculture school Hainan university,Hainan Haikou570228)Abstract:The regulati on of eukaryote mRNA′s stabiluoy turnover is an i m portant deter m inant of levels of gene exp ressi on1 There are four main way t o regulati on of eukaryote mRNA′s stability:sequential ele ment of mRNA(5′-cap;5′-UTR; coding regi on;3′-UTR;poly(A)tail;reacti on of bet w een5′and3′);mRNA binding p r otein(5′Cap-B inding Pr otein; coding regi on p r otein;3′UTR-B inding Pr otein;poly(A)-B inding Pr otein);translati on p r oducti on of mRNA(I ndepend2 ently regulates);ribonuclease,virus and others fact or1Key words:sequential ele ment of eukaryote mRNA;binding p r otein;translati on p r oducti on 对于真核生物的mRNA来说,它的半衰期、丰度、基因表达与调控之间存在着非常重要的联系。
mRNAstability
Furuichi & colleagues, 1977
Labeled reovirus RNAs w/ capped (green), blocked (blue) or decapped (red) 5’-end a) glycerol gradient centrifugation (ggc) b) incubation in X. oocyte, 8 h > ggc c) decapped & deblocked RNAs (b-elimination yielding pppGm & pppG) + incubation in X. oocyte, 8 h > ggc d) as (b) but incubation in wheat germ extract
Most mammalian mRNAs are polyadenylated!
mRNA Decay and Translation
The intimate relationship between mRNA decay and translation is further indicated by the ability of translation-initiation factors (eIF) and proteins (PAB) that bind the poly(A) tail to protect the mRNA from degradation. Moreover, evidence shows that inhibiting translation elongation promotes mRNA stabilization.
w/o w/
Elements in the 3’ UTR
RNA结合蛋白与转录后调控
RNA结合蛋白与转录后调控 结合蛋白与转录后调控
王文恭
DNA and chromatin levels
Gene Regulation
Transcription level Maturation mRNA export Post-transcriptional level mRNA turnover Translation level Post-translation level
HuR
Hel-N1 HuD TTP
BRF1 TIA-1 KSRP
CUG-BP2 Nucleolin TINO PAIP2
c-myc (46) c-myc (42) c-fos (42,67) c-fos (53) PTH (56) p21 (48) GM–CSF (42) Cyclin D1 (48) TNF-alpha (42) GM–CSF (53,54) IL-3 (55) c-fos(59,63,67) p53(99,137) TNF-alpha (139) MyoD (68) Cox-2 (139) p21 (48,68,69) Cyclin A (70) Cyclin B1 (70) Cyclin D1 (48) NOS II/iNOS (64) GM–CSF (59) TNF-alpha (65,74,139) Cox-2 (71,139) IL-3 (55,66) VEGF (62) Myogenin (68) NF-M (73) TNF-alpha (74) GLUT1 (72) GLUT1 (72) GAP-43 (75–77) c-fos (90) GM–CSF (18,81,83–85,91) TNF-alpha (18,81,83–86,89,90) Cox-2 (87) IL-2 (82,90) IL-3 (18,66,83,84,88) TNF-alpha (89,93) IL-3 (55,92,93) TNF-alpha (120) Cox-2 (121) c-fos (90,93) NOS II/iNOS (102) TNF-alpha (90,93) IL-2 (90,93) c-jun (93) Cox-2 (150) Cox-2 (150) bcl-2 (175) bcl-2 (176) VEGF (177)
mrna质量标准
mrna质量标准mRNA质量标准是衡量mRNA制备和纯化质量的重要指标。
在mRNA研究和应用中，高质量的mRNA是确保研究结果的可靠性和准确性的基础。
本文将介绍mRNA质量的评估指标，常见的mRNA质量问题以及提高mRNA质量的方法。
mRNA质量的评估指标主要包括纯度、完整性和稳定性。
首先是纯度，纯度指标评估mRNA样品中是否有杂质存在。
常用的方法包括紫外-可见分光光度法测定mRNA与杂质之间的比例，例如A260/A280比值和A260/A230比值。
A260/A280比值应在1.8-2.1之间，而A260/A230比值应在2.0以上。
较低的比值可能表示有蛋白质、盐或有机溶剂等杂质存在。
其次是完整性，完整性指mRNA在制备和纯化过程中是否发生降解。
mRNA通常具有自然的不稳定性，因此在mRNA实验中，保持mRNA的完整性非常重要。
常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳可以检测mRNA的分子量和条带的清晰度，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可以更好地检测mRNA的分子量和形态。
最后是稳定性，稳定性指mRNA的保持时间和储存条件。
mRNA在环境中很容易被降解，因此适当的储存条件可以延长mRNA的寿命。
常见的存储条件包括-80°C冻存和使用RNase抑制剂。
此外，也可以通过超滤或柱子纯化等方法去除余留的RNase，提高mRNA的稳定性。
在mRNA制备和纯化过程中，常见的mRNA质量问题包括降解、污染和重组RNA的产生。
mRNA降解可能是由于制备过程中使用的酶或未恰当的储存条件导致的。
mRNA的纯化过程中可能存在DNA、RNA残留物或其他污染物，这些污染物可能会干扰后续的实验结果。
另外，某些反应条件下，如高温反应，可能会促使mRNA重组，导致产生不完整的RNA序列。
为了提高mRNA的质量，一些关键的方法和步骤可以被采用。
首先，选择合适的mRNA制备和纯化试剂和仪器。
质量可靠的试剂和仪器可以减少制备和纯化过程中的污染和降解。
mRNA稳定性与基因表达
二、原核生物中mRNA稳定性与基因表达
Csr AB是大肠杆菌中的一个调节系统，CsrA是 一个RNA结合蛋白，CsrB是一个非编码RNA分子。 一般条件下CsrA结合到CsrB分子上，调控表达 时，CsrA从CsrB上脱落，结合在受调控的mRNA 分子上，通过改变mRNA的二级结构，使得其变 成易受核酸酶攻击的不稳定构象，最终被降解。 静止期细菌细胞糖原的储存和生长期糖酵解途 径消耗糖原的平衡便是由Csr AB系统调节。
而mRNA分子降解的可能性主要取决于他们的二 级结构。
inhibit
DNA
feedback
RNA聚合酶/转 录复合物
识别蛋白
protein
inhibit
mRNA
RNase/ PNPase/ RNA helicase
mRNA degradation
Figure1 mRNA稳定性调节模型图
PNPase： exonuclease polynucleotide phosphorylase
铁浓较低
不能起始翻译
稳定性高 不降解
铁浓度较高 起始翻译 稳定性低 降解
csrA-csrB 复合体
glg mRNA
csrA
核酸酶
glg mRNA降解
glg mRNA不能作为模版翻译
三、真核生物中mRNA稳定性与基因表达
真核生物中，转铁蛋白受体（TfR）负责铁摄取， 铁蛋白负责铁解毒。在转铁蛋白受体和铁蛋白 mRNA上存在相似的铁应答元件（iron responsive element，IRE），IRE与IRE结合蛋 白（IRP）之间的相互作用控制了两个mRNA的翻 译效率。 其中，铁蛋白中，IRE和IRP的相互作用促使 mRNA构象改变，无法起始铁蛋白mRNA的翻译。 在转铁蛋白受体中，IRE和IRP的相互作用使得 mRNA变得更加的稳定，不易受到细胞中核酸酶 的攻击，可以稳定的翻译出新的蛋白质。
真核生物mRNA稳定性的控制机制
节 比其 它调节机 制更快 捷 、 经济 。如编码 Ｃ ｌ 和 Ｃ ｊｎ —ｏ ｓ — ｕ 的调节 蛋 白， 它们 的 ｍ Ｎ Ｒ Ａ不 稳定 ， 因此 调 节转 录 本 的稳
定性可 能成 为调节 基 因表 达 的 主要 机 制之 一 。还 有涉 及 分化 和发 育 的基 因主要 受 ｍＲ Ａ定 位 的选 择性 翻译 而调 Ｎ
ｍＮ Ｒ Ａ的稳定 性变 化 会 对基 因表 达 产 生调 控 。 因 为 ｍ ・ Ｒ Ｎ Ａ半 衰期 的微 弱变 化可 能 在短 时 间 内使 ｍＲ Ａ 的 丰度 Ｎ 发 生 １０ ０ ０倍甚 至是 更 大 的 变化 。同 时 ， Ｎ 水 平 的调 ｍＲ Ａ
０ ５ ｉ。但 突变 的 Ｃ—ｍ ｃ 因 的 ｍ Ｎ —１ｍｎ ｙ基 Ｒ Ａ被 截短 ， 们 它
Ｒ ｅ ｕｌ ｔｏ ｆ ｅ ａ ｙ ｔ ＲＮ Ａ ｔ ｂｉｉｙ ｇ ａ ｉ ｎ ｏ ｕｋ ｒ ｏ ｅ ｍ ｓａ ｌ ｔ
Ｈａ ｅ Ｗ ａ ｇＧ ｏ （ｉ ｃ ｎ ｅａｄａｒ ｕｔｒ ｓｈｏ Ｈ ｉａ ｎｖｒｔ ｎＦ ｉ ｎ ａ １ｅｓｉ ｃ ｎ ｇｉ ｌ ｅ ｃｏｌ ａ ｎｕ ｉ ｓｙ，Ｈ ｉ ｎＨ ｉ ｕ５ ０ ２ ） ｆ ｅ ｃ ｕ ｎ ｅｉ ａ ａ ａ ｏ ７２ ８ ｎ ｋ
主调控） 核 酸酶 、 毒等因素对 ｍＲ Ａ稳 定性的控制 。 ， 病 Ｎ
关 键 词 ： Ｒ Ａ序 列 ； ｍ Ｎ 结合 蛋 白 ； 译 产 物 翻 中图 分 类 号 Ｑ ２ ５２ 文献标识码 Ｂ 文章编号 １０ ７ ３ （０ ７ ｌ 一 ７— ３ ０ ７— ７ ｌ ２０ ） ｌ ２ ０
ｃｄｎ ｇ ｎ ３ ｏｉｇｒ ｉ ； 一Ｕ Ｒ； ｏ （ ｔｉ ｒａｔ ｎｏ ｅ ｅｎ５ ｎ ； Ｒ Ａｂｎ ｉ ｒｔ ｎ（ Ｃ ｐ—Ｂｎ ｉｇＰｏ ｉ； ｅｏ Ｔ ｐｌ Ａ）ａ ； ｅｃｉ ｆ ｔ ｅ ｙ ｌ ｏ ｂｗ ａｄ３ ） ｍ Ｎ ｉｄｎ ｐｏｅ ５ ａ ｇ ｉ ｉｄ ｒｔ ｎ ｎ ｅ ｃｄｎ ｇ ｎｐｏ ｉ； Ｔ ｏｉｇｒ ｉ ｒ ｅ ３Ｕ Ｒ—ＢｎｉｇＰｏ ｉ；ｐｌ（ ｅｏ ｔｎ ｉｄｎ ｒｔｎ ｏ Ａ）一Ｂｎ ｉｇＰｏ ｉ） ｔ ｎｌｔｎｐｏｕｔ ｎｏ ｍＲ Ａ （ｎ ｅｅｄ ｅ ｙ ｉｄ ｒ ｅ ； ｒ ｓ ｉ ｒｄ ｃｏ ｆ Ｎ Ｉｄ ｐｎ・ ｎ ｔｎ ａ ａｏ ｉ
mRNA稳定性和细胞内定位
FIGURE 06: The major deadenylation-dependent decay pathways in eukaryotes
22.5 Most Eukaryotic mRNA is Degraded via Two Deadenylation-Dependent Pathways
22.4 Prokaryotic mRNA Degradation Involves Multiple Enzymes
• Degradation of bacterial mRNAs is initiated by removal of a pyrophosphate from the 5′ terminus. • Monophosphorylated mRNAs are degraded during translation in a twostep cycle involving endonucleolytic cleavages, followed by 3′ to 5′ digestion of the resulting fragments.
– It does not use a template.
22.4 Prokaryotic mRNA Involves Multiple Enzymes
• poly(A) – A stretch of adenylic acid that is added to the 3′ end of mRNA following its synthesis. • The main degradation enzymes work as a complex called the degradosome.
22.5 Most Eukaryotic mRNA is Degraded via Two Deadenylation-Dependent Pathways
名词简答整理
增强子：是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。
它可以在启动子的上游，也可以在启动子的下游，绝大多数增强子具有组织特异性。
Operon：是细菌基因表达调控的一个完整单元，包含结构基因以及能够被调节基因产物所识别并结合的顺式作用元件。
朊病毒：是一种无免疫原性但能在细胞内复制、并能侵染动物的疏水性蛋白质。
致病途径具有自发性、遗传性和传染性三个特征。
C值矛盾：生物体进化程度高低与大C值不成明显相关（非线性）；亲缘关系相近的生物大C值相差较大；一种生物内大C值与小c值相差极大。
RNAi：是由外源双链RNA产生的21~25nt小的干涉RNA而触发内生同源mRNA降解的过程，是一种转录后水平上的基因沉默机制。
RNA编辑：RNA编辑是指由RNA水平的核苷酸改变所引起的密码子发生变化的一种预定修饰，一种RNA编辑是以另一RNA为模板来修饰mRNA前体。
通过编辑，可以给mRNA前体添加新的遗传信息。
移码突变：由于缺失或插入而导致突变位点以后的三联体密码可读矿改变。
Transcription：是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶的催化下，以4种NTP（A TP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。
顺式作用元件：是指DNA上对基因表达有调节活性的某些特定的调控序列，其活性仅影响与其自身处于同一DNA分子上的基因。
分子伴侣：是结合其他不稳定蛋白质并稳定其构象的一类蛋白质。
通过与部分折叠的多肽协调性地结合与释放，分子伴侣促进了包括蛋白质折叠、寡聚体装配、亚细胞定位和蛋白质降解等多个过程。
转座子：是染色体或质粒上的一段独立的DNA序列，作为一个可以重组但不交换的遗传单元，能在原位保留其本身的情况下，从一个位点转移到另一个位点。
DNA复杂度：是DNA分子中无重复的核苷酸序列的最大长度。
负调控：阻遏蛋白结合在操作子位点，阻止基因的表达。
没有调节蛋白时操纵元内结构基因是表达的，而加入调节蛋白后结构基因的表达活性被关闭，这种调节称为负调节。
mRNA稳定性和细胞内定位
22.4 Prokaryotic mRNA Degradation Involves Multiple Enzymes
• poly(A) – A stretch of adenylic acid that is added to the 3′ end of mRNA following its synthesis. • The main degradation enzymes work as a complex called the degradosome.
– Both are variable in size.
22.2 Messenger RNAs Are Unstable Molecules
• mRNA instability is due to the action of ribonucleases. • Ribonucleases differ in their substrate preference and mode of attack. • endoribonuclease – A ribonuclease that cleaves an RNA at an internal site(s). • exoribonuclease – A ribonuclease that removes terminal ribonucleotides from RNA.
FIGURE 05: Degradation of bacterial mRNAs
22.4 Prokaryotic mRNA Degradation Involves Multiple Enzymes
• 3′ polyadenylation can facilitate the degradation of mRNA fragments containing secondary structure. • poly(A) polymerase (PAP) – The enzyme that adds the stretch of polyadenylic acid to the 3′ end of eukaryotic mRNA.
翻译调控mRNA稳定性和速度
翻译调控mRNA稳定性和速度随着基因组学的发展，我们对于基因调控的认识越来越深入。
mRNA是基因转录的产物，但是它并不是立即被翻译成蛋白质的。
在细胞中，mRNA的稳定性和速度会影响到蛋白质合成的效率和数量。
因此，研究如何翻译调控mRNA的稳定性和速度变得越来越重要。
IRES与5'UTR5'UTR（5'非翻译区）是mRNA中的一个结构。
它在翻译过程中并没有直接产生蛋白质，而是通过调节到达蛋白翻译的速度来影响细胞中蛋白质的合成。
IRES（internal ribosome entry site）是5'UTR中一个特别的序列，它可以在5'端没有5'帽子的mRNA中招募核糖体，并促进翻译的开展。
因此，IRES序列的特点可以影响5'UTR对mRNA翻译的调控。
mRNA的稳定性mRNA的稳定性是指mRNA在细胞内的降解速度。
mRNA的稳定性会影响到细胞中翻译mRNA表达的数量。
mRNA稳定性通常受到转录后调控元件（TE，transcriptional regulatory element）的调控。
这些TE包括启动子、强化子和转录因子的结合位点。
当转录因子结合在TE上时，它们可以增加或减少mRNA的稳定性。
此外，mRNA自身的结构也可以影响到它的稳定性。
例如，如果mRNA中有结晶的序列，它们可以降低mRNA的稳定性。
3'UTR调控3'UTR是mRNA的另一个结构，它位于剪切信号后面。
3'UTR中的序列和结构对翻译的效率和mRNA的稳定性都有影响。
在3'UTR中，有一类序列被称为ARE（AU-rich element），这类序列可以通过调控RNA酶的结构来影响mRNA的稳定性。
此外，3'UTR中的序列也可以影响到mRNA的翻译速度，例如与泛素化相关的序列。
总结mRNA的稳定性和速度对蛋白质表达来说非常重要。
研究表明，IRES、5'UTR、转录后调控元件、mRNA序列和3'UTR都可以影响到mRNA的稳定性和速度。
mrna不稳定的生物学意义
mrna不稳定的生物学意义
mRNA（信使 RNA）的不稳定性在生物学中具有重要的意义，主要包括以下几个方面：
1. 调节基因表达：mRNA 的不稳定性可以影响基因的表达水平。
细胞可以通过控制 mRNA 的稳定性来调节特定基因的表达量，从而实现对细胞功能和生物学过程的精细调控。
2. 发育和分化：在细胞发育和分化过程中，不同细胞类型需要表达特定的基因组合。
mRNA 的不稳定性可以帮助确保在特定时间和地点只表达特定的基因，从而实现细胞的特化和功能的分化。
3. 适应环境变化：当细胞面临环境变化时，mRNA 的稳定性可以迅速调整基因表达以适应新的环境条件。
通过控制 mRNA 的稳定性，细胞可以在需要时增加或减少特定基因的表达，以应对环境压力或刺激。
4. 细胞质量控制：mRNA 的不稳定性也可以作为一种细胞质量控制机制。
如果 mRNA 编码的蛋白质是错误的或有害的，细胞可以通过促进其降解来减少有害蛋白质的产生，从而保护细胞的正常功能。
5. 信号转导和细胞通讯：mRNA 的稳定性还可以参与信号转导和细胞通讯过程。
一些信号分子可以调节 mRNA 的稳定性，从而影响基因表达和细胞反应。
总之，mRNA 的不稳定性是细胞调节基因表达、适应环境变化、维持细胞质量和参与信号转导等生物学过程的一种重要机制。
它使得细胞能够根据内部和外部的需求，精确地控制基因表达，从而实现复杂的生物学功能。
基因表达调控 第三课 mRNA水平的研究9-29
11.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％。
12.TM值在55-63度之间。
Real-time PCR的应用：
DNA 或RNA 的绝对定量分析，包括病原微生物 或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数 的检测，RNAi 基因失活率的检测等。 基因表达差异分析，例如比较 经过不同处理样本 之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处 理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达 差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。 基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。
（3）Alternative polyadenylation (APA)
APA consist of two steps, cleavage and polyadenylation of RNAs, which are maturation events that cut and add an oligo(dA) tail to the 3’ end of the nascent transcript. This processing protects mRNAs from degradation and increases their stability. The specific cleavage position and the efficiency of the process depend on the interaction between trans-acting polyadenylation factors and cis-elements present in the pre-mRNAs, such as the central sequence motif AAUAAA.
提取用试剂：Trizol reagent RNA提取注意事项：要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase
第十六章转录
• 影响mRNA稳定性的因素： – 多聚（A）尾部的长短 – 5’-帽子 – 3’-UTR序列的不同可影响mRNA 降解.
（二）mRNA的剪接
（二）转录延长
1. 亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变 构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前 移； 2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合， RNA链不断延长。 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi
转录泡（transcription bubble）：
在转录延长过程中，由局部打开的
1.mRNA的转录后加工
一、mRNA的转录后加工
(一)首尾的修饰 1. 5´-端加帽：m7GpppG—— 2. 3´-端加尾：多聚腺苷酸 (poly A)
帽子结构: 真核mRNA 5-末端与7-甲基鸟嘌呤核 苷以 5，5三磷酸连接键相连
帽子结构的生成
5 pppGp…
磷酸酶
5 ppGp…
结构基因
3' 5'
RNA聚合酶 保护法
RNA聚合酶保护区 结构基因
5 3 5 3 -35 区 3 5 3 5
-50
-40
-30
-20
-10
1
10
开始转录 -10 区
T A T A A T Pu A T A T T A Py
TTGACA AA C T G T
原核生物启动子保守序列
trp tRNATrp lac rec A ara
转录起始过程
1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合。 2. DNA双链解开。 3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反 应，形成转录起始复合物。
石胆酸通过上调miR-21表达降低核受体PPARα_mRNA的稳定性
除酒精、病毒、药物等脂肪肝致病因素外，大泡性肝细胞脂肪变性超过5%诊断为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD ），其疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH ）、肝纤维化、肝硬化和肝癌［1,2］。
2018年NAFLD 全球患病率高达25%［3］。
我国NAFLD 患病率已赶超欧美发达国家，严重危害国民健康和社会发展［1］。
脂肪肝是NAFLD 早期阶段，肝脏脂肪分解利用与新生脂肪生成的失调是重要的致病风险因素，因此，促进肝内脂肪酸β-氧化分解，降低肝脏脂肪堆积可有效延缓或阻止NAFLD 发展。
Lithocholic acid decreases mRNA stability of nuclear receptor PPAR αby upregulating miR-21expression in hepatoma HepG2cellsP ANG Biying,HUANG Nana,HUANG Xiaoxia,LI Xin,XIONG Wenting,KONG Bo,YAO Yan School of Life Science,Guangzhou University,Guangzhou 510000,China摘要：目的探讨石胆酸在转录后水平对PPAR αmRNA 稳定性的调控。
方法构建PPAR α3'UTR 荧光素酶报告基因载体并转染HepG2细胞，比较两种浓度石胆酸处理后荧光素酶活性的变化。
结合生物信息学预测，确定石胆酸诱导下差异表达的miRNAs 及其在3'UTR 上的潜在结合位点，对结合位点进行突变（Mut1、Mut2和Mut1+Mut2），比较石胆酸处理后Mut1、Mut2和Mut1+Mut2荧光素酶活性的变化。
利用Western blot 和RT-qPCR 检测两种浓度石胆酸处理下信号通路的激活及其下游转录因子基因表达水平，比较不转染对照组和瞬时转染过表达转录因子的PPAR α蛋白表达，确定参与石胆酸调控PPAR αmRNA 稳定性的信号通路和转录因子。
真的搞错了吗？RNA去甲基化酶FTO的作用底物解读
真的搞错了吗？RNA去甲基化酶FTO的作⽤底物解读作者：段洪超本平台获作者授权发布（⾸发于BioArt）最近⼀段时间，围绕m6A修饰的相关研究有种让⼈应接不暇的感觉，⽽且对于催化、去除和识别m6A的酶或者蛋⽩基本上学术界已经有⼀个统⼀的定论了。
然⽽前不久，康奈尔⼤学医学院的Samie R. Jaffrey课题组在Nature上发表⼀篇长⽂，⽂章赋予了m6A甲基化修饰酶FTO新的重要催化功能，并且暗⽰FTO事实上更多的酶活是催化m6Am⽽不是m6A去甲基化。
当然，如果Samie课题组的这⼀结论是对的话，那么过去围绕FTO酶活的研究就会受到严重的质疑，然是事情究竟是怎样呢？为此，北京⼤学化学与分⼦⼯程学院的博⼠⽣段洪超关于上述问题的详细解读，将有助于读者朋友更深⼊地了解科学研究的真谛所在。
m6A，还有它背后的RNA表观遗传学/表观转录组学，已经是⼀座名副其实的⾦矿了。
淘⾦越来越⽕热，⼤佬们各说各话，各种研究结果也是铺天盖地的。
声⾳的来源多当然是好事啦，说明这是个⽅兴未艾的“活”领域，对于在这个⼤坑⾥扑腾的⼩弱，最好的消息肯定是发的⽂章引⽤次数必然“咔咔”地涨，也就不⽤愁没有杂志接收了。
不过，如此庞杂的研究结果，其中甚⾄还有相⽭盾的结论，怎样摸清脉络、把握⽅向、去伪存真，还真得多下些⼯夫。
笔者说来也在这个领域做过蛮长时间了，这⾥就和⼤家讲⼀些其中的⼩trick。
就拿FTO在体内的作⽤底物这件事来说吧。
今年年初，康奈尔⼤学的Samie Jaffrey教授搞了个⼤新闻，他在⼀篇Nature⽂章上报道称，mRNA上5’cap区域的m6Am修饰是可逆的，并且调控了mRNA的稳定性和翻译效率。
和m6A⼀样，m6Am也是在上个世纪70年代就被发现的mRNA修饰，然⽽这么多年来，它的功能⼀直是个谜，甚⾄连它是怎么来的（甲基转移酶）都不知道。
竟发现m6Am修饰的去甲本来嘛，发现了⼀个新的RNA修饰的功能，⼩弱们只要在后⾯紧跟⼀波就⾏了，没成想定睛⼀看，竟发现在体内真正的底物。
N端9个谷氨酸或7个天冬氨酸显著增强普鲁兰酶在大肠杆菌中表达分泌
N端9个谷氨酸或7个天冬氨酸显著增强普鲁兰酶在大肠杆菌中表达分泌栗亚美;安展飞;陈阿娜;杨艳坤;白仲虎【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2017(34)3【摘要】Various tags,especially charged amino acids,were widely applied in soluble expression and secretion of heterogenous proteins in Escherichia coli recent years.To know how the charged amino acids types and numbers influent the Pul13A expression and secretion,25 Pul13A mutants were constructed,which had different N-terminal amino acid tags.Among them,the nine-glutamine tag could decrease the transcription level and increase the N-terminal mRNA stability,and Pul13A′s activity changed to 179.60 U/mL that was 278.28% higher than the control without any amino acid tag.Meanwhile,the N-terminal seven-aspartate tag enhanced the inner membrane permeability,and secreted massive pullulanse into the culture medium (48.18 U/mL).Furthermore,it was found that the CBM41 structural domain was different in different mutants,which maybe mainly result in the differences of the expression and secretion levels.%各种标签被广泛应用于大肠杆菌分泌表达异源蛋白,其中最简单有效地便是氨基酸标签,尤其是带电荷氨基酸标签.为了研究N端添加不同种类和数目的带电荷氨基酸标签对普鲁兰酶(pullulanase,BaPul13A)在大肠杆菌中表达分泌水平的影响,构建了25株BaPul13A变体.实验结果表明:N端添加9个连续的谷氨酸标签,降低了mRNA的转录水平,增加了N端mRNA的稳定性,使得普鲁兰酶总酶活达到179.60 U/mL,比不添加氨基酸标签的对照菌高278.28%.N端添加7个连续的天冬氨酸标签,增强了大肠杆菌细胞内膜通透性,大量的普鲁兰酶,48.18 U/mL,分泌到培养基中.通过蛋白质结构预测软件I-TASSER分析得知,N端添加不同带电荷氨基酸标签引起CBM41结构域发生变化,猜测该变化是导致BaPul13A变体表达分泌水平差异的主要原因.【总页数】7页(P11-17)【作者】栗亚美;安展飞;陈阿娜;杨艳坤;白仲虎【作者单位】江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122;江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122;江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122;江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122;江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室, 无锡214122;江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122;江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122;江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室, 无锡214122;江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122;江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122【正文语种】中文【中图分类】Q78;TQ925【相关文献】1.嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化 [J], 杨向会;陈晟;吴敬2.酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中分泌表达研究 [J], 栗亚美;陈阿娜;杨艳坤;白仲虎3.苏云金芽孢杆菌BtR05普鲁兰酶基因pul在重组大肠杆菌中的自诱导表达 [J], 李桂龙;扈进冬;李纪顺;侯运华4.活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸环境下对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体、谷氨酰胺合成酶蛋白表达及活性的影响[J], 贾鑫;苏学敏;张越;袁立飞;杨赞章;张铭连5.多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 张春园;张鸣明;胡先望;李素岳;何海宁;梁宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
分子生物学英语名词解释
分子生物学英语名词讲解————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期 :A ｐpeｎｄｉ x C:Gl ｏssaryαheli ｘAｈｅｌ ical secondａ ry sｔructu ｒ e in prot ｅ ins.Pl. α hｅ lices.α-a ｍａ nitinＡｔｏ xin that iｎ hibits t ｈe thｒ ee e ｕｋ aryoti ｃＲ N Ａｐｏｌ ymeraseｓ to di ｆ fｅ rent ｅｘ tｅ nｔ s．Nａｍ e derｉv ｅ s from ｍ ushroｏ m of genｕｓ Aman ｉta ｉ n which toxin iｓｆ oｕ nd.β- ｇ alactosｉdaseEｎ zyme ｔ hat cleaves lａctosｅ inｔ o ｇ al ａｃ tose anｄ glucｏｓ e. Name origin: thｅbond cuｔ by t ｈ is eｎ zyme i ｓcalled a -ｇβalａｃ tosidｉｃbond.βsｈ eetA sｅ coｎｄ ary sｔ rｕ cture iｎproteins, rel ａｔｉ vｅ ly flat aｎ d fｏｒｍｅｄ hy ｄ rogen ｂｏ nding between tｗ oｐ aｒallel or anti-parallel st ｒｅｔｃ hes of p ｏｌｙ peptidｅ．σｓｕ bｕ nitＣｏ mponenｔｏ f pr ｏ karyotic RNA po ｌ y ｍeｒaｓ e hｏｌ oeｎ zyｍ e. Requiｒｅ d for r ｅ cogｎ i ｔ i ｏn of promot ｅrs.ρ-dependｅnt termiｎationＡ form of t ｒａ nsｃriptio ｎｔ erminａtion i ｎ pｒｏ kａrｙｏ tesｔｈａ t depends ｏ n the protein ρａs well as on sｅ quｅnces in the Ｄ NA/R Ｎ A.─1０ boxＣommｏｎ prｏ motｅ r element ｉｎ E. col ｉ.Named for its lｏcaｔｉ on approximaｔ elｙ 1０ baｓ es ｕ pstrｅ aｍｏ f the ｔ ransｃｒｉ ption staｒｔｓ ite.附录Ｃ : 名词讲解α螺旋蛋白质中一种螺旋形的二级结构。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
poly(A) synthesis
aided by PAB II (yellow)
Darnell & colleagues, 1973
Poly(A): nuclear form 210 nt, cytoplasmic form 190 nt > poly(A) undergoes considerable shortening in the cytoplasm
Significance of mRNA Stability
Controlling the rate at which the mRNA decays can regulate the levels of cellular messenger RNA transcripts. Because decay rates affect the expression of specific genes, they provide a cell with flexibility in effecting rapid change.
Furuichi & colleagues, 1977
Labeled reovirus RNAs w/ capped (green), blocked (blue) or decapped (red) 5’-end a) glycerol gradient centrifugation (ggc) b) incubation in X. oocyte, 8 h > ggc c) decapped & deblocked RNAs (b-elimination yielding pppGm & pppG) + incubation in X. oocyte, 8 h > ggc d) as (b) but incubation in wheat germ extract
Most mammalian mRNAs are polyadenylated!
mRNA Decay and Translation
The intimate relationship between mRNA decay and translation is further indicated by the ability of translation-initiation factors (eIF) and proteins (PAB) that bind the poly(A) tail to protect the mRNA from degradation. Moreover, evidence shows that inhibiting translation elongation promotes mRNA stabilization.
Stability of mRNA
• Structure features of eukaryotic mRNA untranslated regions (UTR) • Regulation of mRNA stability in mammalian cells • Bioinformatic analysis of UTR functional characterization
Elements in the 5’ UTR
7-methylguanosine cap
Caps provide at least four functions:
• Protection of mRNA from degradation (see example)
• Enhancement of mRNA’s translatability • Transport of mRNA out of nucleus • Proper splicing of pre-mRNA
CPSF: blue CstF: brown CF I & II: grey
cleavage
stimulated by pol II CTD CstF & CFs leaves PAP (orange) enters
oligo(A) synthesis
aided by CPSF
Cytoplasmic polyadenylation elements (CPE) & binding proteins
What are the sequence elements and factors that control the half-lives of mRNAs?
General Structure of a Eukaryotic mRNA
illustrating some post-transcriptional regulatory elements for gene expression and their activity. 5’UTR mediated regulation may involve: the 7-methyl-guanine (cap); hairpin-like secondary structure; RNA-protein interactions; upstream open reading frames (uORFs); internal ribosome entry sites (IRES). 3’UTR mediated regulation may involve: antisense RNA interactions; RNA-protein interactions, involving also multiprotein complexes; cytoplasmic polyadenylation elements (CPE); poly(A) tail and variation of its size.
In eukaryotes: the 3’ poly(A) tail confers stability. In bacteria: a hairpin structure in mRNA with
r-independent terminator confers stability.
Moreover, many clinically relevant mRNAs-including several encoding cytokines, growth factors and proto-oncogenes--are regulated by differential RNA stability.
mRNA abundance is determined by balancing transcription and RNA decay. mRNA stability can be rapidly modulated to alter the expression of specific genes thereby providing flexibility in affecting changes in patterns of protein synthesis.
When the poly(A) is gone, the mRNA is slated for destruction
Stability of mRNA
• Structure features of eukaryotic mRNA untranslated regions (UTR) • Regulation of mRNA stability in mammalian cells • Bioinformatic analysis of UTR functional characterization
w/o w/
Elements in the 3’ UTR
• AU-rich element (ARE) and proteins that bind AREs • Iron-responsive element (IRE) and iron regulatory protein (IRP) • Cell cycle-regulated histone mRNA stemloop determinant (SL/SLBP) • Cytoplasmic polyadenylation element (CPE)……
Translation initiation complex
What is the rate-limiting step in mRNA degradation?
An evolutionarily conserved mRNAdegradation pathway is initiated by the removal of the 3’- poly(A) tail. This disrupts the translation initiation complex and provides degradative enzymes with access to the 5’ cap and remaining RNA body.
Transferrin receptor mRNA ion-responsive element & IRP
PNAS 93: 8179-8182, 1996
Histone mRNA stem loop determinant & SLBP
Gene 239: 1-14, 1999
assembly
Nuclear
cytoplasmic
5S rRNA
Cytoplasmic polyadenylation of maternal mRNAs
The best studied cases are those that occur during oocyte maturation
Maturation-specific polyadenylation of Xenopus maternal mRNAs in the cytoplasm depends on two sequence motifs: The AAUAAA motif & an upstream motif with UUUUUAU or a closely related sequence