一种暗褐网柄牛肝菌菌种保藏方法[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.12.11C N 103430773 A (21)申请号 201310385305.4
(22)申请日 2013.08.28
A01G 1/04(2006.01)
(71)申请人云南省热带作物科学研究所
地址666100 云南省西双版纳傣族自治州西
双版纳州景洪市宣慰大道99号
(72)发明人张春霞 何明霞 王文兵 刘静
高锋 曹旸 伍英 纪开萍 王云
(74)专利代理机构昆明今威专利商标代理有限
公司 53115
代理人杨宏珍
(54)发明名称
一种暗褐网柄牛肝菌菌种保藏方法
(57)摘要
一种暗褐网柄牛肝菌菌种保藏方法，属于真
菌技术领域。

方法步骤为：a.将暗褐网柄牛肝菌
子实体组织接入M1试管培养基中培养菌丝体，
培养条件为30℃，暗光培养15-20d ；b.分别将重
量百分比为5%的海藻糖和20%的甘油保护剂装
至1.8ml 的冻存管中，121℃灭菌30min ；c.将暗
褐网柄牛肝菌菌丝块接种于冻存管中，每支接种
3-5块，接种完放入冻存盒中；d.将冻存盒先放
入-20℃冰箱12h ，然后迅速放入-80℃超低温冰
箱保藏。

优点在于：1、能实现低温保藏，且保藏的
时间更长；保存8个月的菌种仍性状优良。

2、用保
藏方法保存的菌种进行菇房人工栽培，子实体的
成熟天数相对较短，子实体的重量相对较重。

(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书2页(10)申请公布号CN 103430773 A
*CN103430773A*
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1.一种暗褐网柄牛肝菌菌种保藏方法，其特征在于该菌种保藏方法的步骤如下：
a.将暗褐网柄牛肝菌子实体组织接入M1试管培养基中培养菌丝体，培养条件为30℃，暗光培养15-20d ；
b.分别将重量百分比为5%的海藻糖和20%的甘油保护剂装至1.8ml 的冻存管中，121℃灭菌30min ；
c.将暗褐网柄牛肝菌菌丝块接种于冻存管中，每支接种3-5块，接种完放入冻存盒中；
d.将冻存盒先放入-20℃冰箱12h ，然后迅速放入-80℃超低温冰箱保藏。

2.权利要求1所述的一种暗褐网柄牛肝菌菌种保藏方法，其特征在于M1培养基的组成为：葡萄糖20.0g ，硫酸镁1.0g ，磷酸二氢钾1.0g ，酵母膏2.0g ，马铃薯200.0g ，琼脂20.0g ，用自来水定容至1L ，pH4.0～5.0。

权 利 要 求 书CN 103430773 A
一种暗褐网柄牛肝菌菌种保藏方法
技术领域
[0001] 本发明属于真菌技术领域，具体涉及一种暗褐网柄牛肝菌菌种保藏方法。

背景技术
[0002] 暗褐网柄牛肝菌Phlebopus portentosus（Berk.&Broome）Boedijn隶属于小牛肝菌科Boletinellaceae，脉柄牛肝菌属Phlebopus。

国内分布于云南、广西和海南等地（臧穆，1986，2006；杨祝良和臧穆，2003;Kai-Ping Ji et al.2011）；国外分布于泰国、斯里兰卡、越南、印度尼西亚、巴西、墨西哥、澳大利亚和新西兰（Heinemann et al.1982；Barbara&Segedin,1987；Watling，2001；Bandala et al.2004；Maria&Marina，2007）。

其子实体个体肥大，味道鲜美，营养价值丰富，是云南南部及泰国东北部最受群众喜爱的名贵食用菌之一（纪开萍等，2007，2009；Saisamorn et al.2007）。

目前我们已经在温室（菇房）人工栽培和田间半人工栽培暗褐网柄牛肝菌方面取得了成功，栽培的方法和模式都初具规模。

[0003] 菌种是科研和生产的重要资源。

菌种保藏即在人为创造的条件下，使菌种的新陈代谢活动处于不活跃状态，从而较长时间地保持菌种的生命力和原有性状。

暗褐网柄牛肝菌菌种保藏是从事暗褐网柄牛肝菌栽培、菌种生产的一项重要工作。

[0004] 目前食用菌保藏方法主要有传代培养保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、液氮低温保藏法、砂土管保藏法以及自然基质保藏法等。

目前暗褐网柄牛肝菌生产上常用的传代培养保藏法，是将菌种置于15℃-20℃条件下保藏，每隔3-6个月转管1次。

这一技术提供了一个简便有效的短期保藏方法，但也增加了菌种产生污染和形态、生理特征发生变异的风险。

发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种低温条件下暗褐网柄牛肝菌菌种保藏方法。

[0006] 为实现以上目的，本发明采取的技术方案如下：
[0007] a.将暗褐网柄牛肝菌子实体组织接入M1试管培养基中培养菌丝体，培养条件为30℃，暗光培养15-20天；
[0008] b.分别将重量百分比为5%的海藻糖和20%的甘油保护剂装至1.8ml的冻存管中，121℃灭菌30min；
[0009] c.将暗褐网柄牛肝菌菌丝块接种于冻存管中，每支接种3-5块，接种完放入[0010] 冻存盒中；d.将冻存盒先放入-20℃冰箱12h，然后迅速放入-80℃超低温冰[0011] 箱保藏。

[0012] 所述的M1培养基的组成为：葡萄糖20.0g，硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾1.0g，酵母膏2.0g，马铃薯200.0g，琼脂20.0g，用自来水定容至1L，pH4.0～5.0。

[0013] 本发明的优点在于：
[0014] 1、能实现暗褐网柄牛肝菌的低温保藏，而且保藏的时间比常规的传代培养保藏法更长。

经此保藏方法保存8个月的菌种仍能保持优良性状。

[0015] 2、用本发明保藏方法保存的菌种进行菇房人工栽培，子实体的成熟天数相对较短，子实体的重量相对较重。

具体实施方式
[0016] 以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。

[0017] 实施例1：
[0018] 采用本发明保存暗褐网柄牛肝菌菌种的方法如下：
[0019] a.将暗褐网柄牛肝菌子实体组织接入M1试管（18mm×180mm）培养基中培养菌丝体，培养条件为30℃，暗光培养20d；
[0020] b.分别将重量百分比为5%的海藻糖和20%的甘油保护剂装至1.8ml的冻存管中，121℃灭菌30min；
[0021] c.将暗褐网柄牛肝菌菌丝块接种于冻存管中，每支接种3-5块，接种完放入冻存盒中；d.将冻存盒先放入-20℃冰箱12h，然后迅速放入-80℃超低温冰箱保藏。

[0022] 实施例2：采用本发明保存暗褐网柄牛肝菌菌种的方法如下：
[0023] a.将保藏的暗褐网柄牛肝菌菌株PP10003接入M1试管（18mm×180mm）培养基中培养菌丝体，培养条件为30℃，暗光培养15d；
[0024] b.分别将重量百分比为5%的海藻糖和20%的甘油保护剂装至1.8ml的冻存管中，121℃灭菌30min；
[0025] c.将暗褐网柄牛肝菌菌丝块接种于冻存管中，每支接种3-5块，接种完放入冻存盒中；d.将冻存盒先放入-20℃冰箱12h，然后迅速放入-80℃超低温冰箱保藏。

[0026] 用本发明方法保藏的菌种进行生产或扩大繁殖时，要先经30℃的水浴锅溶解，再接种于M1培养基上。

接种和培养基制作均遵循微生物实验的无菌操作要求。