DNA 甲基化分析技术

文章编号:1007-4287(2005)02-0304-03
DNA 甲基化分析技术
黄　庆,府伟灵3
(第三军医大学西南医院检验科,四川重庆400038)
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30370398);重庆市国家自然科学基金资助项目(编号:2004227222);第三军医大学科研基金资助项目(编号:XG 200326)3通讯作者
甲基化胞嘧啶(5’2methylated cytosine ,5mC )被称之为人类DNA 的第5种碱基。

肿瘤表观基因组
(cancer epigenomics )概念的提出和人类表观基因组计划(Human E pigenetic Project ,HEP )的实施将表观遗传学研究又推向了一个新的高度[1]。

了解DNA 甲基化分析技术的原理、适应范围和优缺点有利于研究者根据自身不同需求和设备条件来选择有效方法达到最终目的[2,3]。

1　DNA 甲基化非特异性分析
属于早期的DNA 甲基化分析技术,其主要特征是只能分析基因组水平的5mC 比例,主要包括高效液相色谱、高效毛细管电泳、薄层层析、M.Sss I 甲基转移酶分析、去水乙缩氯醛反应、5mC 免疫学抗体技术等[2,3]。

随着人类基因组计划的完成及HEP 的实施,单纯地判断基因组5mC 水平已经不能满足现代表观遗传学研究的需求。

2　DNA 甲基化特异性分析是一类可分析特定基因或序列位点甲基化状态的分析技术,也是近年来发展比较迅速的技术之一。

根据其作用原理,可将其分为依赖和不依赖于重亚硫酸盐修饰的检测技术。

211　不依赖于重亚硫酸盐修饰的检测技术　主要包括肼反应、高锰酸反应和限制性内切酶技术[2,3]。

其中,前两种技术因此操作费时和步骤复杂等原因已很少被研究者所采用。

限制性内切酶技术是碱基未经任何修饰的情况下对基因组或已知基因进行甲基化分析的最常用方法之一,其原理是基于甲基化敏感限制性核酸内切酶(methylation 2sensitive restric 2tion endonucleases ,MS 2RE )和甲基化不敏感限制性核酸内切酶(methylation 2sensitive restriction endonucleas 2es ,MIS 2RE )的单酶切/组合酶切和随后的S outhern 杂交或PCR 检测酶切产物属性而确定DNA 甲基化
状态和模式。

将S outhern 杂交和PCR 技术引入酶切产物的后续分析大大提高了检测灵敏度,特别是当DNA 数量有限时若采用PCR 技术可大大节约DNA
的用量,此外,PCR 技术的引入还可对甲基化DNA 进行定量分析,如固相定量引物延伸方法(s olid 2phase quantitative primer extension method )、竞争性引
物结合位点(com petitive primer binding sites )技术、连接物引导PCR (ligation 2mediated PCR ,LM 2PCR )和单核苷引物延伸反应等[2～4]。

不过,由于限制酶自身的特性使该技术只能判断酶切位点所在序列的甲基化状态,因此,如果使用了不同的酶切体系可导致不同研究者之间的结果存在差异而缺乏比较性。

212　依赖于重亚硫酸盐修饰的检测技术　是指利
用重亚硫酸盐对胞嘧啶和5mC 修饰的差异而达到鉴别二者的一类技术,重亚硫酸钠修饰后胞嘧啶被转变成尿嘧啶,而5mC 则在修饰前后保持不变。

因此,利用DNA 测序技术或PCR 技术等可达到对5mC 的特异性分析,主要包括重亚硫酸测序、甲基化特异性PCR (methylation 2specific PCR ,MS 2PCR )、甲基化特异性单核苷引物延伸(methylation 2sensitive single nu 2cleotide primer extension ,Ms 2S NuPE )、重亚硫酸盐限制酶组合分析(combined bisulphate restriction analysis ,C OBRA )、甲基化敏感差异展示分析(methylation 2sen 2sitive 2representation difference analysis ,MS 2RDA )和甲
基化敏感单链构象分析(methylation 2sensitive single 2strand con formation analysis ,MS 2SCC A )等[5～11]。

MS 2PCR 是目前研究DNA 甲基化最为常用的方
法之一,其中,引物设计是其成败的关键[2,6]。

除标准的MS 2PCR 之外,荧光MS 2PCR 和定量MS 2PCR 等新方法将标准MS 2PCR 的检测灵敏度和适用性又推向了一个新的高度[7]。

尽管如此,由于MS 2PCR 引物设计的特殊性使其仅能判断引物序列所在C p G 位点的甲基化状态,因此,不同的MS 2PCR 引物可能会产生不同的分析结果。

Ms 2S NuPE 将基因突变检测和等位基因特异性表达分析中所应用的单核苷引物延伸技术引用入DNA 甲基化分析,其特点是可同
—
403—Chin J Lab Diagn ,April ,2005,V ol 9,N o.2
时分析多个特定C p G位点的甲基化状态,因此,如果对不同研究者的MS2PCR结果存在歧义时,该方法不失为一种有效的验证手段。

C OBRA是利用基因组DNA在重亚硫酸盐修饰前后因胞嘧啶和5mC 的转变差异而导致甲基化DNA中原有的MS2RE酶切位点保留,而非甲基化DNA则丧失,通过分析酶切片段,即可确定是否存在甲基化DNA[9]。

与单纯的酶切技术相比较,C OBRA大大提高了分析的能力和灵敏度。

MS2RDA将MS2RE代替标准差异展示分析中的六核苷序列识别限制酶,采用基于此原理的过量克隆清除式MS2RDA(MS2RDA with elimination of excessive clones,MS2RDA2WEEC)方法可分离到单拷贝的甲基化DNA序列,从而大大提高了检测灵敏度[10]。

MS2SCC A的原理则是将重亚硫酸盐修饰DNA进行单链构象多态性(single2stranded con forma2 tional polym orphism,SSCP)分析,也被称之为重亚硫酸盐甲基化2PCR2SSCP(Biusulfite2PCR2SSCP,BiPS),其优点是可对甲基化DNA进行快速的半定量分析[11]。

3　DNA甲基化相关基因的筛选及新的甲基化位点寻找技术
经典的DNA甲基化分析研究主要是集中于已知基因序列的甲基化分析,而在基因组水平分析未知序列的甲基化水平并寻找与之相关的新基因是目前DNA甲基化分析研究中的一个很吸引人的研究领域,它对于寻找与疾病表观遗传学异常机制相关的新的基因及新的疾病标志物具有重要的应用价值与前景。

总体而言,这些技术都是根据C p G岛特有属性而发展起来的寻找基因组中新的甲基化序列的技术,主要包括限制性标记基因组扫描(restriction landmark genome scanning,R LG S)、甲基化敏感任意引发PCR(methylation2sensitive arbitrarily primed PCR, MS2AP2PCR)、甲基化C p G岛扩增(methylated C p G is2 lands am plification,MC A)、M BD柱层析/SPM技术和DNA甲基化微阵列技术等[12～18]。

R LG S组合应用了MS2RE酶切技术与二维凝胶电泳技术,是一种高通量的DNA甲基化分析技术[12]。

除了比较分析两组基因组之间的R LG S谱(R LG S profiles)差异来发现和寻找某组基因组中异常甲基化的DNA片段外,R LG S另一大优势是当其与其它技术(如PCR或克隆技术)进一步结合时,可以很方便地对异常甲基化的DNA片段进行克隆或测序,从而确定C p G岛的特征以及对其染色体位点进行定位。

MS2AP2PCR是DNA甲基化指纹分析技术[13]。

MS2AP2PCR中的甲基化DNA可克隆测序,或制备成探针而应用于甲基化下游分析。

M BD柱层析/SPM技术可筛选和分离基因组甲基化和非甲基化DNA片段[14]。

其中,利用大鼠MeCP2蛋白的甲基化C p G结合区(methyl2binding dormain,M BD)制备的M BD层析柱对甲基化DNA具有高度亲和力,而部分溶解分子分离(segregation of partly melted m olecules,SPM)是基于变性梯度凝胶电泳(denatur2 ing gradient gel electrophoresis,DGGE)原理从基因组DNA中分离C p G岛的方法,对这些序列进行克隆测序就可得知在某个基因组中甲基化C p G岛序列。

DNA甲基化微阵列是近年发展起来的高通量分析和研究甲基化DNA的技术之一[15～18]。

目前, DNA甲基化微阵列主流技术主要包括基于C p G岛文库和差式甲基化杂交(differential methylation hy2 bridization,DMH)的C p G岛微阵列和基于人工设计C p G二核苷酸位点的甲基化特异性寡核苷(methyla2 tion2specific olig onuleotide,MS O)微阵列[15,16]。

其中,前者类似于mRNA表达谱或cDNA微阵列,后者则类似于寡核苷酸微阵列。

表达C p G岛序列标签(ex2 pressed C p G island sequence tags,ECISTs)微阵列则是一类可同时平行分析DNA甲基化及相应基因表达水平的新型微阵列[17]。

它解决了上述两类微阵列均只能单纯地分析DNA甲基化状态而无法将其与相关基因表达水平进行关联分析的弊端。

甲基化靶向阵列(methylation target array,MT A)则是一类衍生于组织微阵列的可批量检测多种或多个组织样品中某个基因甲基化状态的技术[18]。

作者简介:黄庆,男,32岁,讲师,博士,研究方向:肿瘤表现遗传学。

参考文献:
[1]黄　庆,郭　颖,府伟灵.生命的化学[J].人类表观基因组计划,
2004,24(2):101.
[2]Fraga MF,Esteller M.DNA methylation:a profile of methods and appli2
cations[J].Biotechniques,2002,33(3):632,634,649.
[3]Fruhwald MC,Plass C.G lobal and gene2specific methylation patterns in
cancer:aspects of tum or biology and clinical potential[J].M ol G enet M etab,2002,75(1):1.
[4]P ogribny I,Y i P,James S J.A sensitive new method for rapid detection
of abnormal methylation patterns in global DNA and within C p G islands [J].Biochem Biophys Res C ommun,1999,262(3):624.
[5]Frommer M,M cD onald LE,M illar DS,et al.A genomic sequencing
protocol that yields a positive display of52methylcytosine residues in indi2 vidual DNA strands[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1992,89(5):1827.
[6]Herman J G,G raff JR,M y ohanen S,et al.M ethylation2specific PCR:a
novel PCR assay for methylation status of C p G islands[J].Proc Natl A2 cad Sci U S A,1996,93(18):9821.
—
5
3
—
中国实验诊断学　2005年4月　第9卷　第2期
[7]Muller2T idow C,Bornemann C,Diederichs S,et al.Analyses of the ge2
nomic methylation status of the human cyclin A1prom oter by a novel real2 time PCR2based methodology[J].FE BS Lett,2001,490(1-2):75. [8]G onzalg o M L,Jones PA.Rapid quantitation of methylation differences at
specific sites using methylation2sensitive single nucleotide primer exten2 sion(Ms2S NuPE)[J].Nucleic Acids Res,1997,25(12):2529.
[9]X iong Z,Laird PW.COBRA:a sensitive and quantitative DNA methyla2
tion assay[J].Nucleic Acids Res,1997,25(12):2532.
[10]Ushijima T,M orimura K,H os oya Y,et al.Establishment of methyla2
tion2sensitive2representational difference analysis and is olation of hypo2 and hypermethylated genomic fragments in m ouse liver tum ors[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(6):2284.
[11]T aron M,R osell R,Felip E,et al.BRCA1mRNA expression levels as
an indicator of chem oresistance in lung cancer[J].Hum M ol G enet, 2004,13(20):2443.
[12]Rush L,Plass C.Restriction landmark genomic scanning for DNA
methylation in cancer:past,present,and future applications[J].Anal Biochem,2002,307(2):191.
[13]K ohno T,K awanishi M,Inazawa J,et al.Identification of C p G islands
hypermethylated in human lung cancer by the arbitrarily primed2PCR method[J].Hum G enet,1998,102(3):258.
[14]Shiraishi M,Chuu Y H,Sekiya T.Is olation of DNA fragments ass ociated
with methylated C p Gislands in human adenocarcinomas of the lung using
a methylated DNA binding column and denaturing gradient gel elec2
trophoresis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(6):2913. [15]Huang TH,Perry MR,Laux DE.M ethylation profiling of C p G islands
in human breast cancer cells[J].Hum M ol G enet,1999,8(3):459. [16]G itan RS,Shi H,Chen C M,et al.M ethylation2specific olig onucleotide
microarray:a new potential for high2throughput methylation analysis[J].
G enome Res,2002,12(1):158.
[17]Shi H,W ei SH,Leu Y W,et al.T riple analysis of the cancer
epigenome:an integrated microarray system for assessing gene expres2 sion,DNA methylation,and histone acetylation[J].Cancer Res,2003, 63(9):2164.
[18]Chen C M,Chen H L,Hsiau TH,et al.M ethylation target array for
rapid analysis of C p G island hypermethylation in multiple tissue genomes [J].Am J Pathol,2003,163(1):37.
(收稿日期:2005-02-01)
胰岛素瘤1例误诊分析
乔建文
(河北省宣化县人民医院,河北宣化075100)
1　临床资料
男性,39岁,因发作性头晕、行为失常2年、突发昏迷、肢瘫1次于1992年3月2日就诊。

患者2年前在劳累或空腹时出现头晕、心悸,伴有行为失常(如倒骑摩托车),约每2～3个月发作一次,每次经休息或输液治疗后好转。

因此将工作岗位由以体力劳动为主调整到以脑力劳动为主,但发作次数并未减少。

就诊前1天晚饭前(约20:00)突然神志不清,呼之不能应,左下肢不能活动,疑为急性脑血管病,给予10%葡萄糖500ml加维脑路通静点,约5min 后清醒,左下肢肌力恢复。

发病过程中无抽搐、无尿便失禁。

既往无头颅外伤、无一氧化碳中毒、无慢性肝病、肾病、无糖尿病、无脑膜炎等病史。

曾在我院多次查脑电图未发现异常,肝胆胰脾肾B超、心电图、胸片、血尿例规、肝功能均正常。

门诊诊断为一过性脑缺血,排除癫痫,但不能解释其精神症状。

因诊断不明,再次就诊。

病程中发现:①患者每次发病,经休息或输液治疗后都可好转,每次输的液体均为10%葡萄糖,除最近一次用维脑路通外,以前全用能量合剂和维生素C。

②发病时间:多在二餐之间,以清晨吃早点前和晚饭前较多。

③患者偏爱吃白糖,自认为多吃糖不犯病。

患者全家年消耗白糖达15kg左右,联系到患者发病时以神经精神症状为主,判断可能为低血糖症。

次日血糖结果报告为212mm ol/L,第3天复查仍为211mm ol/L。

疑为胰岛素瘤,转到北京协和医院确诊。

2　讨论
胰岛素瘤是少见疾病,易造成误诊。

有误诊长达20年者[1]。

本病例提示造成误诊的主要原因在于接诊医生询问病史不详细,忽略了进食后或输糖后数分钟内好转的特点,没有将临床上表现的低血糖症群与病史联系起来进行分析。

病史和体格检查是正确诊断的基础,60%～70%[2]的病例可以通过病史和体格检查得出正确的结论。

参考文献:
[1]王雪梅,刘玉兰,王智峰,等.糖尿病合并胰岛素瘤1例并文献复
习[J].中国实用内科学杂志,2002,22(9):559.
[2]范洪伟,纪宝华.降低误诊率还要靠基本功[J].中国实验诊断学,
1997,1(6):5.
(收稿日期:2004-12-12)
—
6
3
—Chin J Lab Diagn,April,2005,V ol9,N o.2。