植物转基因沉默的机制、对策

转录后水平的基因沉默(PTGS)
这是RNA-RNA的关系，基因的启动子（promoter ）是活跃 的，基因能转录，但转录产物不能积累。
转基因和内源基因有很大程度的同源性 ,而抑制了转基因 和内源基因的表达，这一现象在植物中称共抑制（cosuppression ），又称RNA干扰（RNA interference, RNAi）。
植物转基因沉默的机制、 对策与应用
一、 植物转基因的现状与应用前景
1984年第一例转基因烟草诞生以来，转基 因技术在植物育种中的应用正受到各国植物 遗传育种家的普遍重视和广泛研究，在主要 作物中转入抗虫基因、抗除草剂基因、抗病 基因、有关生理代谢调控基因、品质基因已 获得成功，育成的遗传改良品种已在生产上 大面积推广应用，取得了常规育种方法难以 获得的成就。


RNAi广泛存在于自然界

随后， RNAi 现象被广泛地 发现于真菌、拟南芥、水 螅、涡虫、锥虫、斑马鱼 等大多数真核生物中。 这种存在揭示了 RNAi 很可 能是出现于生命进化的早 期阶段。 随着研究的不断深入， RNAi 的机制正在被逐步阐 明，而同时作为功能基因 组研究领域中的有力工具， RNAi 也越来越为人们所重 视。
RNAi 发现历程：
1990年，Napoli等将1个查尔酮合成酶基因（chs）置于1 个强启动子后导入矮牵牛，试图加深花朵的紫颜色。但
意想不到的事发生了：结果部分花的颜色并非期待中
的深紫色，而是花瓣形成了花斑状甚至白色，而且这种 性状可以遗传。
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1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫(C.elegans)为消除线虫第 一次分裂的不对称性的研究中，利用反义RNA技术抑制par-1 的表达，同时也注入正义RNA（对照）。结果两种方法都抑 制par-1基因。 该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。


转录水平的基因沉默 (TGS)

转录水平的基因沉默是由于DNA甲基化、异染色质化及位臵效应等造 成DNA无法转录成RNA，故表达受抑制。 从目前报道来看，几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子 的甲基化有关，DNA甲基化都是从启动子区域开始的，主要发生在基 因 5’ 端启动子区域，甲基化通常发生在 DNA 的 GC 和 CNG 序列的 C 碱 基上，阻碍转录因子与启动子的结合，直接干扰转录因子和启动子识 别位点的结合，从而引起转录抑制。


DNA修饰与组蛋白乙酰化程度
生物的保护性修饰以及基因的过度转录等 …… 双链RNA（dsRNA）作为启动因素或中间体为不同 生物基因沉默所共有

转基因沉默主要分为两类

转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing， TGS），发生在核内。
转录后水平上的基因沉默（Posttranscriptional gene silencing，PTGS）则发生在细胞质中。 不同的机制归结到一起就是核酸的相互作用，即 DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA。
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2015/12/20


重 复 诱 导 DNA 甲 基 化 （ repeat-induced DNA methylation）
正常细胞基因组DNA中不同位点的甲基化程度存在某种平 衡，并形成一定的空间结构特点。
生物体细胞核内的DNA串联重复或反向串联重复（多拷贝 转基因、转座子或基因突变等）转录产生dsRNA，细胞核 内的 dsRNA 被RNaseⅢ 型酶切割成小分子干扰 RNA （small interfering RNA,siRNA），引起与其同源的DNA 序列甲基 化，同时siRNA或dsRNA也可直接与同源的 DNA配对，产 生RNA-DNA复合物或产生RNA-DNA多链结构，从而破坏 细胞核基因组的平衡及空间结构特征，这种破坏后的结构 便成为宿主基因组防御系统识别的信，于是这种不正常的 结构被从头甲基化转移酶识别并使之甲基化，从而产生了 转录水平上的基因沉默。 因重复会导致甲基化，通常在一个位点内拷贝数愈高，失 活愈严重。

转录水平的基因失活就常与启动子严重甲基化有关，而在DNA其他部 分的甲基化相对而言对基因的转录影响较小。
DNA甲基化引起的外源基因沉默可以被逆转，利用去甲基化试剂可以 恢复外源基因的表达。





1．DNA的拷贝数 为DNA-DNA相互作用， 转基因沉默与转基因的 拷贝数和其构型有关。 在一些研究报道中认为，多拷贝的整合方式并未使 基因表达水平有所增加，反而使DNA发生甲基化或 其他原因引起基因失活。 农杆菌介导的转化方法比DNA 直接转化法所产生 的拷贝数低或仅为单拷贝。外源基因的拷贝数低也 并不一定能导致基因的充分表达，所以转基因拷贝 数的多少对基因表达有不同的结果报道。 倾向于多拷贝导致基因沉默。
RNAi的提出

直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。 他们将体外转录得到的单链 RNA纯化后注射线虫时发现，基 因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链 RNA却正好相 反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。 他们证实，Guo 等遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以 及过去的反义 RNA 技术对基因表达的阻断，都是由于体外转 录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 首次将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， RNAi）。
1990年， Napoli和其同事在研究转查 尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）基 因chs的矮牵牛植株中，发现一种转基因 同时抑制相应内源基因及自身表达的共抑 制现象，即chs基因和内源基因同时被抑 制，称为“共抑制”（co-suppression）。
最重要的科学发现之一－RNAi


2006年的诺贝尔生理学奖获得者：
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
dsRNAs ：Long double-stranded RNAs ( >200 nt)
有关转基因马铃薯饲喂小鼠的实验认 为专食转基因马铃薯的小鼠的免疫机能下 降，尽管后继研究未能重复此结果，但该 研究结果的发表引起了世界范围的人们对 转基因生物安全wenku.baidu.com的极大关注。
抗除草剂基因从转基因植株向同种或亲缘关系较 近的物种发生转移将会产生抗除草剂的杂草； 外源基因的进入对植物本身遗传体系和生理代谢系 统将会有哪些潜在的影响？ 多种转基因植物在自然界的释放对自然界生态平衡 、生物多样性将产生什么影响？ 诸如此类的问题，引起了科学家、社会学家、管理 部门和普通百姓就转基因工作的广泛争论。
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The root tips for each transgenic barley line
4．DNA甲基化
DNA 发生甲基化可以关闭某些基因的活性，一 旦去甲基化后又可以重新诱导基因的活性表达。 是植物发育分化过程中调控基因表达的手段之一 ，利用这一途径来调控基因在时空上的表达。 DNA甲基化也是植物细胞最常用的防御外来遗传 物质入侵的现象，它可以识别与植物基因组DNA 序列组成不同的外源基因并对其甲基化，引起基 因沉默。
在多种生物中，外源或内源性的双链 RNA(double－stranded RNA dsRNA)导入细胞中， 与 dsRNA 同 源 的 mRNA 则 受 到 降 解 ， 因 而 mRNA中相应的基因受到抑制，由于这是一种在 RNA 水平的基因表达抑制，故称为 RNA 干扰 (RNA interference RNAi)。 RNAi是生物普遍存 在的 RNA水平上调节基因表达的方式，对于细 胞防御病毒的感染、以及调节正常基因的功能 具有重要作用。

3．位臵效应
目前的转基因方法整合到基因组中的位臵是随机 的，因基因组中染色质的分布不均衡，外源基因 整合到目的基因组即染色体的物理位臵就直接决 定着外源基因的表达，这种情况称为位臵效应 （position effect）



（ 1 ）外源基因插入染色体中高度甲基化的区 域或异染色质区，外源基因的甲基化而导致基 因沉默。 （ 2 ）外源基因的碱基组成与整合区域的不同 而被受体细胞的防御系统所识别，不进行转录 使基因沉默，这两种情况都属于转录水平上调 控的转基因沉默。
转基因植物的生产
抗除草剂作物
抗虫玉米
抗虫棉花
转查尔酮合成酶矮牵牛花
抗CMV病毒转基因番茄
抗CMV病毒转基因甜椒
bacterial speck disease(细菌斑点病）. Plant on left has been genetically engineered with a gene for resistance to the disease, and plant on right is a susceptible, nonengineered variety.
Decaffeinated coffee is now made by treating coffee beans to remove the caffeine. （去咖啡因）
转基因植物的发展趋势
1. 抗逆基因及抗逆分子育种
2. 提高作物品质：高含油、低饱和脂
肪酸、高必需氨基酸、高营养（营
养功能基因，维生素E ）





2、外源基因在受体中的构型 外源基因在目的基因组中的构型是指多拷贝的外源基因以 正向或反向串联的形式整合在植物基因组中，这些构型导致 外源基因不同程度的失活。 （1） 顺式失活（cis-inactivation），当一个或多拷贝基因整 合进入或接近高甲基化基因组序列时，转基因的顺式失活就 可能发生。常是指紧密连锁的多拷贝的转基因以正向或反向 相互串联而使基因失活。这种构型在DNA直接导入中常见， 多以甲基化的方式发生。 （2）反式失活（trans-inactivation），转录反式失活实际上 顺式失活的一种复杂形式。是指转基因以顺式方式插入并作 为一个沉默子（silencer）发生失活，是引起不同DNA分子上 同源的等位或非等位的目标基因失活。它们在对目标基因产 生沉默时其本身没有变化。

二、转基因沉默的可能机制
基因沉默并不是所转化的基因发生了丢失或 突变，而是整合进植物基因组的外源基因在 转化体的当代或其后代中出现了基因失活的 现象，其表达受到抑制。

基因沉默的主要原因

转基因的拷贝数和构型
转基因在基因组中的整合位点（位臵效应）
转基因的转录水平和翻译水平 环境因子与发育因子

植物基因工程的一个实质性障碍。对于基因表达的理 论研究来说，转基因植株的建成为研究目的基因的表 达调控提供了优良的材料。通过深入研究可加深理解 自然植物在DNA水平上利用同源或互补的核苷酸序列 来调控基因的表达，或在细胞质中通过mRNA水平来 调控基因的表达。
2．转基因植物对生态环境的影响和转基因 食品的安全性
Papaya is a tropical fruit rich in Vitamins A and C, but susceptible to a number of serious pests and diseases. The transgenic variety UH Rainbow, resistant to the papaya ringspot virus, is currently in production in Hawaii.
3. 生物反应器－含疫苗的农作物 4. 清除重金属作物等
植物转基因存在的问题：
1 、转基因的沉默 , 技术和科学问题， 涉及到转基因的应用。
转基因沉默的概念


外源基因在转化植株的当代和子代要稳定地遗传 和高表达，从而达到转基因的目的。 研究发现，有些外源基因转入植物宿主并与受体 基因组整合，但该基因不表达或表达水平降低， 也包括与外源基因同源的内源基因。或者转基因 的遗传特性随着自身的繁殖在后代中又消失，人 们 将 这 种 现 象 称 之 为 转 基 因 沉 默 （ transgene silencing）或转基因失活（transgene inactivation）。