TUNEL染色-冰冻切片-(TMR Red)
翻译好的罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA 的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
Tunel染色步骤
Tunel染色步骤染色是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以标记和可视化细胞或组织中的特定分子或结构。
TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色技术是一种常用于检测细胞凋亡的方法。
以下是TUNEL染色的步骤：准备工作：1.去离子水：除去离子，避免离子干扰反应。
2. 去氧核酸酶（DNase）的酶标：新鲜制备，如购买的DNase酶标已开封或保存时间较长，需要用氧化热焓（将无水乙酸用过氧化氢气化后灭菌）处理一晚才可以使用。
步骤一：样本固定1.取细胞或组织样本，放入离子缺失的缓冲液中，使其完全被液体覆盖。
2. 加入4%的 paraformaldehyde（或其他细胞或组织固定液），室温下固定10-15分钟。
3.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
4.用细胞色素染色法染色检测固定细胞总蛋白质。
步骤二：处理样本1. 将细胞或组织样本渗透处理：将固定的细胞或组织置于PBS中含有0.5% Triton X-100（或0.1-0.2%的Bis-vinylsulfonyl] ethane等亲水试剂）的溶液中，室温下渗透30分钟。
2.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
3. 用DNase酶标法探测样本中DNA裂解。
步骤三：TUNEL反应1.取TUNEL反应液，根据实验需要，在冷冻时保持在冰上。
2.用比色皿将样本恢复到PBS中，将足量的TUNEL反应液加入标本中，使标本完全浸润，尽量避免气泡。
3.在37℃下孵育1-2小时。
步骤四：反应终止1.将标本移至冷藏，室温下用PBS漂洗3次，每次10分钟。
2.用缓冲液漂洗标本3次，每次10分钟。
步骤五：可视化与分析1.在镜下放置标本。
2.加入螢光抑制剂或DAPI等染料，使用荧光显微镜检测标本。
总结：TUNEL染色技术是一项用于检测细胞凋亡的重要方法。
它通过检测DNA的断裂末端来间接检测细胞凋亡。
整个TUNEL染色过程包括样本固定、样本处理、TUNEL反应、反应终止和可视化与分析等步骤。
TUNEL染色
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡实验原理和方法原理：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
实验方法TUNEL检测对于贴壁细胞或细胞涂片a. PBS或HBSS洗涤一次。
b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
d. 用PBS或HBSS洗涤一次。
e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
f. 转步骤5。
TUNEL检测对于悬浮细胞或细胞悬液a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。
为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。
e. 转步骤5。
TUNEL检测对于石蜡切片a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。
换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。
无水乙醇5分钟。
90%乙醇2分钟。
TUNEL染色
TUNEL染⾊相关疾病：产品名称：罗⽒(Roche)公司Tunel试剂盒英⽂名称：Tunel产品货号：11684817910产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheIn situ cell death detection kit-POD法⼀、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是⽤来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作⽤下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3‘-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者⼜与HRP底物⼆氨基联苯胺（DAB）反应产⽣很强的颜⾊反应（呈深棕⾊），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因⽽在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞⼏乎没有DNA断裂，因⽽没有3?-OH形成，很少能够被染⾊。
本试剂盒适⽤于组织样本（⽯蜡包埋、冰冻和超薄切⽚）和细胞样本（细胞涂⽚）在单细胞⽔平上的凋亡原位检测。
还可应⽤于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双⾊法确定细胞死亡类型和分化阶段。
⼆、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、⼩型染⾊缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻⽚或封⼝膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；⾃备试剂：PBS、双蒸⽔、⼆甲苯、梯度⼄醇（100、95、90、80、70%）、DAB⼯作液（临⽤前配制，5 µl 20×DAB+1µL 30%H2O2+94 µl PBS）、Proteinase K⼯作液（10-20µg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临⽤前配制）、苏⽊素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
细胞tunel染色步骤
细胞tunel染色步骤细胞 Tunnel 染色步骤细胞Tunnel 染色是一种常用的细胞凋亡检测方法，通过染色分析可以定量评估细胞凋亡的程度。
本文将介绍细胞Tunnel 染色的步骤。
1. 固定细胞需要将待检测的细胞固定在载玻片上。
固定可使用4%的无水乙醇或4%的甲醛进行，固定时间一般为10-30分钟。
2. 透化细胞固定后的细胞需要进行透化处理，以便Tunnel 酶能够进入细胞内部。
透化可使用0.1%的Triton X-100进行，透化时间一般为5-10分钟。
3. 准备 TUNEL 反应液TUNEL 反应液是细胞Tunnel 染色的核心。
一般来说，TUNEL 反应液包含 Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 酶和标记有荧光或酶的dUTP。
根据实验需求，可以选择不同的标记物，如荧光染料FITC、Rhodamine 或者酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）。
4. 进行 TUNEL 反应将TUNEL 反应液加到透化后的细胞上，尽量覆盖整个玻片表面。
然后，将玻片置于湿度高的环境中，如湿箱或湿化瓶中，温度为37°C。
反应时间一般为1-2小时。
5. 停止反应反应结束后，需要停止TUNEL 反应，以保证结果的准确性。
停止反应可使用缓冲液，如PBS缓冲液或甘氨酸缓冲液，反应时间一般为10分钟。
6. 染色在停止反应后，需要对细胞进行染色，以便观察和分析。
染色可使用荧光显微镜或透射电子显微镜进行观察。
如果使用荧光显微镜，可以直接观察细胞的荧光信号。
如果使用透射电子显微镜，需要进行金粒子染色，将金粒子标记的抗体与TUNEL 反应产物结合，形成可见的电子密度。
7. 细胞计数和分析对染色后的细胞进行计数和分析。
可以使用图像处理软件对细胞进行定量分析，评估细胞凋亡的程度。
可以通过测量染色阳性细胞的数量，计算细胞凋亡指数（Apoptosis Index）。
细胞Tunnel 染色是一种简单而有效的细胞凋亡检测方法，可以广泛应用于生物医学研究中。
tunel染色 作用
tunel染色作用Tunel染色的作用什么是Tunel染色？Tunel染色是一种常用的细胞和组织样本检测方法，用于检测细胞凋亡的发生与程度。
Tunel是”Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling”的缩写，即末端脱氧核苷酸转移酶-去氧尿嘧啶核苷酸末端标记法。
这种染色技术通过标记DNA断裂末端的dUTP来检测细胞凋亡。
Tunel染色的原理Tunel染色的原理基于细胞凋亡时DNA断裂的现象。
在细胞凋亡发生时，DNA会断裂并形成自由的断裂末端。
Tunel染色利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在这些断裂末端上加入标记的dUTP。
通过连接这些标记的dUTP，我们可以利用荧光或颜色物质的发射来显示细胞凋亡的发生和程度。
Tunel染色的应用Tunel染色在生物医学领域中具有广泛的应用。
以下是一些Tunel 染色的主要应用：•细胞凋亡研究：Tunel染色可以帮助科学家们研究各种生理和病理条件下细胞凋亡的发生机制、调控因子以及凋亡信号通路。
•药物研发：许多抗癌药物通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤生长。
Tunel染色可以评估药物对细胞的作用，并帮助科学家们筛选和优化药物候选物。
•疾病诊断：凋亡在许多疾病的发展中起着重要作用。
Tunel染色可以用于检测和诊断与细胞凋亡相关的疾病，如癌症、神经系统疾病和心血管疾病等。
Tunel染色的优点Tunel染色作为一种检测细胞凋亡的方法，具有以下几点优点：•高灵敏度：Tunel染色能够检测到细胞凋亡的微弱信号，可以提供准确的凋亡检测结果。
•易于操作：相比其他凋亡检测方法，Tunel染色的操作相对简单且迅速，可广泛应用于实验室和临床领域。
•可定量化：Tunel染色结果可以通过计算染色阳性细胞百分比或强度来量化细胞凋亡的程度，提供定量化的数据支持。
•多重应用：Tunel染色可以与其他染色方法相结合，如免疫组化染色、细胞形态学分析等，扩展其应用领域。
免疫荧光双染
免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
TUNEL染色
相关疾病：•脱水产品名称：罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒英文名称：Tunel产品货号：11684817910产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheIn situ cell death detection kit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
tunel 染色原理
tunel 染色原理
引言概述：
Tunel染色是一种常用的细胞学技术，用于检测细胞凋亡。
通过检测DNA断裂末端的3'-OH基团，Tunel染色可以准确地识别凋亡细胞，并在细胞核内形成明亮的荧光信号。
本文将详细介绍Tunel染色的原理，包括染色步骤、染色反应的机理、染色结果的解读以及其在研究中的应用。
正文内容：
1. Tunel染色的步骤
1.1 细胞固定和透化
1.2 凋亡诱导
1.3 染色反应
1.4 洗涤和封片
1.5 观察和分析
2. Tunel染色的机理
2.1 DNA断裂
2.2 TdT酶介导的标记
2.3 荧光探针的结合
2.4 染色信号的放大
2.5 荧光显微镜观察
3. Tunel染色结果的解读
3.1 正常细胞
3.2 凋亡细胞
3.3 背景噪声
3.4 阳性对照和阴性对照
3.5 图像分析和数据统计
4. Tunel染色在研究中的应用
4.1 细胞凋亡机制研究
4.2 肿瘤治疗效果评估
4.3 神经退行性疾病研究
4.4 肝脏损伤评估
4.5 胚胎发育研究
总结：
Tunel染色是一种可靠而广泛应用的细胞学技术，通过检测细胞凋亡的DNA断裂末端，可以准确地识别凋亡细胞。
在实验中，正确的染色步骤和机理的理解对于获得准确的结果至关重要。
Tunel染色在细胞凋亡机制研究、肿瘤治疗效果评估、神经退行性疾病研究、肝脏损伤评估以及胚胎发育研究等领域都具有重要的应用价值。
通过深入了解和熟练掌握Tunel染色的原理和操作技巧，我们可以更好地应用这一技术来推动相关领域的研究进展。
如何用Tunel法搞定石蜡切片冰冻切片细胞涂片的凋亡检测
如何用Tunel法搞定石蜡切片冰冻切片细胞涂片的凋亡检测Tunel法常用于检测细胞凋亡，其原理为细胞凋亡发生时，相关DNA内切酶会被激活，从而切断核小体间的DNA。
在细胞凋亡晚期，DNA会被降解为180-200 bp的片段。
TdT介导的dUTP末端标记法（TUNEL）是在TdT的催化下将荧光素标记的dUTP与断裂DNA暴露的3'-OH聚合，延伸后的DNA可通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
Tunel试剂盒适用于组织样本（石蜡切片、冰冻切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
今天就为大家介绍三种样品的处理方法：一.石蜡切片1）脱蜡与水化：将切片依次放入二甲苯I（15min）→二甲苯II （15min）→100％乙醇（5min）→95％乙醇（5min）→90％乙醇（5min）→85％乙醇（5min）→80％乙醇（5min）→70％乙醇（5min）→ddH2O冲洗5min，重复3次；2）用组化笔圈好组织，在每个样品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用15-30min；3）1×PBS洗5min，3次，洗净PK；二.冰冻切片1）1×PBS洗5min，3次。
2）用组化笔圈好组织，在每个样品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用15-30min；3）1×PBS洗5min，3次，洗净PK；三.细胞涂片：1）固定细胞，将载玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min。
2）洗涤载玻片，将其浸入PBS中，室温放置5min。
重复用PBS 洗一次。
动作要轻柔，防止细胞脱片。
3）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。
4）每个样本上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用5min；5）1×PBS洗5min，3次，洗净PK；三种样品处理的方法略有不同，最关键的差别在于蛋白酶(PK）的处理时间，一般组织样品处理的时间略长，细胞处理时间最好控制在几分钟内，防止样品通透过度，造成组织或细胞脱片。
TUNEL 与 ELISA 检测凋亡的方法比较
TUNEL 与 ELISA 检测凋亡的方法比较TUNEL法细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'‐OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'‐末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal ‐deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'‐OH形成，很少能够被染色。
TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.ELISA法测细胞凋亡细胞凋亡时，Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡合苷酸小体，各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。
主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。
◆ 几种检测凋亡的方法一、形态学观察方法1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。
也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗，5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
石蜡切片免疫组化染色步骤三步法（以SP试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
(完整版)TUNEL实验步骤
DeadEnd TM Colormetric TUNEL System1.概述 (1)2.产物成分及贮存条件 (3)3.测定法规程 (4)A．规程文献 (4)B．组织片段中细胞凋亡的分析步骤 (5)C．细胞培养中细胞凋亡的检测步骤 (7)D．阳性对照（随机）进行 (9)E．采用茴香霉素诱导的HL-60细胞凋亡的步骤 (9)4.故障循迹 (10)5.缓冲液和溶液的成分组成 (10)6.相关产物 (10)7.参考文献 (12)1.概述DeadEnd TM Colormetric TUNEL System 是一种非放射性系统，用于单个细胞水平上的平上的原位地简单、准确、快速的检测凋亡细胞。
TUNEL通过测量DNA的断裂片段（DNA断裂片段可以作为许多细胞类型的细胞凋亡的重要的生物化学指示因子），以此测定组织片段和培养细胞的凋亡死亡细胞。
高等真核生物的绝大多数细胞都能够通过一种内在细胞间的自杀程序（例如程序性细胞死亡和细胞凋亡）来进行自我灭亡。
细胞凋亡对于生物发育、内稳态和一些疾病十分重要。
细胞凋亡具有一些特定的形态学特征，包括泡状膜、细胞核和细胞质皱缩、染色体凝集。
细胞凋亡产生的细胞碎片通过胞膜联合形成凋亡小体，凋亡小体易被巨噬细胞和周围细胞吞噬和消化，并且不产生炎症反应。
这与类似细胞坏死的细胞死亡恰恰相反，其特征为细胞膨胀、染色体絮凝、膜完整性的缺失、细胞溶解和局部的炎症反应。
凋亡细胞中，在内源性核酸内切酶的作用下产生了DNA断裂片段，因此其细胞核中发生了形态学变化。
最具代表性地是，凋亡细胞的DNA被分为以180~200bp为单位长度的多聚体片段，这些片段易在琼脂糖凝胶形成梯度。
在外侧膝体核（LGN）、Fas抗体处理后的Jurkat细胞系(急性T细胞白血病细胞系)和茴香霉素处理后的HL-60细胞系中，采用轴突切断术诱导大鼠脑组织的神经死亡，并在振动切片机上切为组织片段，清晰地标记出凋亡细胞。
DeadEnd TM Colormetric TUNEL System在原位标记DNA断裂片段，并在所有系统中经过了证实。
TUNEL 法测凋亡操作步骤
TUNEL 法测凋亡操作步骤一、TUNEL检测原理TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl TransferaseBiotin-dUTP Nick End Labeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。
二、试剂盒组份组份10 assays25 assays 储存条件A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 ℃B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 μL 25 μL -20 ℃C：TdT Enzyme 10 μL 25 μL -20 ℃D：500×Proteinase K 10 μL 25 μL -20 ℃20×SSC 15 mL 38mL 4 ℃E：Streptavidin-HRP 10 μL 25 μL 4 ℃F：20×DAB Substrate Buffer 50 μL 125 μL 4 ℃G：20×DAB Chromogen 50 μL 125 μL 4 ℃H：20×Hydrogen Peroxide 50 μL 125 μL4 ℃三、操作流程1.操作流程概览2.细胞样本制备准备：● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。
tunel染色原理
tunel染色原理Tunel染色原理（ TUNEL技术，简称TUNEL），又称多核苷酸链断裂检测（Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick-end Labeling）技术，是一种定量的检测细胞凋亡的一种重要的技术，它可以检测细胞凋亡的碱基链断裂，主要应用于细胞学及免疫学研究和药物筛选。
TUNEL技术基本原理是采用编码表观遗传信号的DNA用作靶点来定量检测细胞凋亡。
这种技术采用了核苷酸链断裂的去脱基转移反应技术，利用了终端脱氧核苷酸去脱基反应酶（Terminal deoxynucleotidyltransferase， TdT）的特殊功能，将有机染料缀合到DNA上，从而检测出细胞凋亡。
TUNEL技术的过程是这样的：首先，样品中所有细胞形态被固定，然后将其渗染成开放链状；然后，细胞核内DNA以3\ '-OH端作为反应位点，利用免疫化学方法将TdT这种特定核酸酶配以可溶性二聚体DNA-聚变素；之后，将缀有聚变素的TdT添加到细胞核；当添加了可连接少数脱氧基团的含有模板的dNTP（嵌入式的核苷酸缩写）（如dUTP）后，TdT会在每个DNA断链的3' -OH羧基端，捕获并将dNTP扩展到DNA的另一个头部，而这种dNTP又有能够与特定染色剂结合的基团；最后，经由流式细胞仪技术和对比染色，检测渗染得到特定染料缀合在核苷酸链缝合端的细胞，就可以检测出细胞凋亡。
TUNEL技术不但可以用来检测细胞死亡，还可以用来确定细胞凋亡途径及其分子机制，从而定位相应的药物作用点，是药物筛选中不可或缺的重要技术和工具。
TUNEL技术也可以用作细胞自噬的检测工具，其特殊的装置体系，可以检测不同类型的细胞自噬事件，其真实性、灵敏性等指标有一定的改善。
组织切片tunel荧光-概述说明以及解释
组织切片tunel荧光-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述:组织切片是一种常用的实验方法，用于研究组织结构、功能以及病理变化。
Tunel荧光技术是一种常见的检测DNA断裂的方法，通过检测DNA 断裂可以了解细胞凋亡的情况。
本文将介绍组织切片和Tunel荧光技术的概念，以及它们在组织研究中的应用。
通过这些内容，希望读者可以更全面地了解组织切片和Tunel荧光技术，以及它们在科研领域中的重要性和应用前景。
文章结构部分主要包括了整篇文章的框架和组织方式。
在这篇名为“组织切片tunel荧光”的长文中，我们会按照以下结构来呈现内容：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 组织切片的概念2.2 Tunel荧光技术介绍2.3 Tunel荧光在组织切片中的应用3. 结论3.1 总结3.2 展望3.3 结论通过以上结构，我们将会先在引言部分对文章的主题进行概述，然后介绍整篇文章的内容架构和目的。
在正文部分，我们将详细讨论组织切片的概念、Tunel荧光技术介绍以及其在组织切片中的应用。
最后，在结论部分，我们会对整篇文章进行总结，展望未来研究方向，并得出结论。
这种结构清晰、有序，使读者能够更好地理解文章的内容，并按部就班地阅读下去。
1.3 目的:本文旨在探讨组织切片和Tunel荧光技术的相关概念以及它们在生物医学领域中的应用。
通过对组织切片和Tunel荧光技术的介绍和分析，希望读者能够更深入地了解这两种技术在细胞生物学研究中的重要性和应用价值。
同时，本文还将探讨Tunel荧光在组织切片中的具体应用，帮助读者更好地理解这一技术在疾病诊断和治疗中的作用。
通过本文的阐述，读者能够加深对组织切片和Tunel荧光技术的认识，为相关领域的研究和实践提供一定的参考和指导。
2.正文2.1 组织切片的概念在生物学和医学领域中，组织切片被广泛应用于研究和诊断工作中。
组织切片是指将组织样本切割成极薄的切片，通常在微米级别，以便进行显微镜下的观察和分析。
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方式
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方式细胞凋亡中染色体的断裂是个渐进的分阶段的进程，染色体首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体在Ca²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体多聚体。
双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列的3’-OH结尾可在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这种方式一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有的断裂，因此没有3’-OH形成，很少能够被染色。
低分子量的分离后，也可利用聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的标记或染色，然后分析凋亡细胞。
TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培育的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被普遍采用。
一、过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链的3-OH结尾，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。
在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反映，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因此可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。
在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。
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TUNEL染色（TMR Red）
一、实验原理：
细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
二、相关试剂：
1、酶缓冲液：vial 1: Enzyme Solution
2、标记液：vial 2: Label Solution
3、固定液：4%多聚甲醛
4、清理液：PBS（pH 7.4）
5、透性处理液（Permeabilisation solution）：含0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠的缓冲液，新鲜配制
三、其他设备：
1、湿盒
2、荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）
四、染色步骤：
1、标本预处理：
（1）用4%多聚甲醛固定组织20分钟（15-20℃）；
（2）PBS清洗30min；
（3）置于透性处理液（0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠）中冰上孵育2min（2-8℃）2、TUNEL反应液：
（1）从标记液（vial 2: Label Solution）中吸出100ul用于2个阴性对照（50ul/个）；
（2）将50ul酶缓冲液（vial 1: Enzyme Solution）加入到剩余450ul的标记液中充分混合均匀，得到500ulTUNEL反应液（50ul/样本，检测10个样本）。
3、标记：
（1）PBS清洗3min，3次；
（2）吸干样品周围的液体；
（3）往组织切片上滴加TUNEL反应液（覆盖整个切片），阴性对照加标记液；
（4）湿盒中避光孵育60min，注意避光；
（5）PBS清洗3min，3次；
（6）抗荧光淬灭封片液封片，用荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）检测（激发波长520-560nm，最大540nm，绿光；检测波长570-620nm，最大580nm，红光。