TUNEL染色-冰冻切片-(TMR Red)

TUNEL染色（TMR Red）

一、实验原理：

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。

二、相关试剂：

1、酶缓冲液：vial 1: Enzyme Solution

2、标记液：vial 2: Label Solution

3、固定液：4%多聚甲醛

4、清理液：PBS（pH 7.4）

5、透性处理液（Permeabilisation solution）：含0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠的缓冲液，新鲜配制

三、其他设备：

1、湿盒

2、荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）

四、染色步骤：

1、标本预处理：

（1）用4%多聚甲醛固定组织20分钟（15-20℃）；

（2）PBS清洗30min；

（3）置于透性处理液（0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠）中冰上孵育2min（2-8℃）2、TUNEL反应液：

（1）从标记液（vial 2: Label Solution）中吸出100ul用于2个阴性对照（50ul/个）；

（2）将50ul酶缓冲液（vial 1: Enzyme Solution）加入到剩余450ul的标记液中充分混合均匀，得到500ulTUNEL反应液（50ul/样本，检测10个样本）。

3、标记：

（1）PBS清洗3min，3次；

（2）吸干样品周围的液体；

（3）往组织切片上滴加TUNEL反应液（覆盖整个切片），阴性对照加标记液；

（4）湿盒中避光孵育60min，注意避光；

（5）PBS清洗3min，3次；

（6）抗荧光淬灭封片液封片，用荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）检测（激发波长520-560nm，最大540nm，绿光；检测波长570-620nm，最大580nm，红光