线粒体的分离
小鼠线粒体的分离与观察
小鼠肝线粒体的分离与观察生科三班2011/5/2实验目的1 了解提取线粒体的基本原理及其过程，掌握差速离心法分离细胞器。
2 通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态。
3 巩固普通染色步骤及注意事项。
实验原理线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时（如电镜和光镜的观察）可采用从组织培养细胞中提取。
本实验是介绍从小鼠肝细胞中提取线粒体并在光镜下观察的方法。
线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，是能量转换的重要细胞器。
细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心。
在一给定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内食物，由于沉降速度不同将停留在不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可一次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程注意使样品保持4℃，避免酶失活。
本实验用的是Ringer缓冲液作为悬浮介质。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法，詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由此吸引堆积在线粒体膜上，线粒体 cell色素氧化酶，使该料保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
细胞生物学实验手册：细胞核与线粒体的分级分离
实验八细胞核与线粒体的分级分离【实验目的】通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，以了解其原理及过程。
【实验用品】一、材料和标本小白鼠、冰块。
二、器材和仪器玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml 烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。
三、试剂 0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。
【实验内容】一、原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、细胞核的分离提取(一)操作步骤。
分离线粒体蛋白和胞质蛋白
线粒体分离试剂盒说明PMSF一定要在线粒体分离试剂或线粒体裂解液加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF 在水溶液中很快失效。
分离线粒体的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷。
1 准备溶液：室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后立即置于冰上并混匀。
第一次使用时，把1.5ml PMSF(溶剂)加入到PMSF(晶体)中，溶解并混匀，即得到1.5ml 100mM PMSF。
配制好的100mM PMSF溶液-20℃保存。
如果最终目的是制备线粒体蛋白样品，根据样品数量，取适量线粒体分离试剂备用，在线粒体分离试剂加入到细胞样品中前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
取适量线粒体裂解液备用，在线粒体裂解液加入到线粒体样品中前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化细胞，离心收集细胞。
3 洗涤细胞：用冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞600g，4℃离心5分钟沉淀细胞。
弃上清。
4 预处理：加入1-2.5ml临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂至2000-5000万细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置10-15分钟。
5.匀浆：把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆10-30下左右。
6 匀浆效果的鉴定：不同细胞不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。
通常可以在匀浆10次后取约2微升细胞匀浆，加入30-50 微升台盼蓝染色液，混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性( 蓝色) 细胞的比例。
如果阳性细胞比例不足50%，增加5次匀浆。
随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定。
当阳性比例超过50%时即可停止匀浆进入下一步。
请勿过度匀浆，过度匀浆会导致线粒体的机械损伤。
同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。
7.把细胞匀浆在600g，4℃离心10分钟。
细胞器线粒体的分离与观察
细胞器线粒体的分离与观察高熹1120152430（李安一）（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。
关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。
1 引言差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。
细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。
制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。
06实验六--细胞器的分离与观察nj
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4˚C保存。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离， 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三 步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组 成、理化特性及其功能的主要手段。
(1)细胞匀浆(Homogenization)：低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细 胞器及其包含物的匀浆。
洋葱内表皮细胞的线粒体分布
植物根尖液泡的中性红染色
三、材料和试剂
材料：小鼠的肝脏
器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf 管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器
试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、 0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、 甲基绿-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
这样不同大小形态密度的颗粒就会以不同的速度向下移动集中到不同的区域可以分别收细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液因为它比较接近细胞质的分散相在一定程度上能保持细胞器的结构和功能保持酶的活性避免细胞器的聚集
实验六 细胞器的分离与观察
一、细胞核的分离与观察 二、线粒体的分离与观察
一、实验目的
分离线粒体
从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法所需缓冲液：RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液）10mM NaCl（Mr=58.44）2.5mM MgCl2（Mr=203.3）10mM Tris-Cl（PH8.0）调PH值至7.4配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液）525mM甘露醇（Mr=182.17）175mM 蔗糖（Mr=342.3）12.5mM Tris-Cl（PH8.0）2.5mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。
1×MS缓冲液210mM甘露醇70mM 蔗糖5mM Tris-Cl（PH8.0）1mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
注意事项：溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。
从细胞中分离线粒体：1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。
2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。
线粒体的分离与鉴定
三、实验用品
1. 材料 昆明种小白鼠 若干只 2. 器材
冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、200 目尼龙网（通常为铜筛）、玻璃匀浆器、PH计、高压灭 菌锅等。
3. 试剂 ① 0.9%灭菌的生理盐水。 ② 1%詹纳斯绿B染液，用0.9%灭菌的生理盐水配制。
③ 0.25mol/L蔗糖十0.01mo1／L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)： ④ 0.34mol/L蔗糖十0.01mol/L tris-盐酸缓冲液(pH7.4) ⑤ ⑦ 固定液：甲醇：冰醋酸(9:1)
一、实验目的
初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方 法。 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。
二、实验原理
线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的
能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联 磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研 究通常是在离体的线粒体上进行的。
七、作
业
线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行？ 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细 胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。要获得高 活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中 需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项 及改进方法。
分离介质0.25mol/L及0.34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层 有什么作用?
心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降 在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞 核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分 离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散 相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操 作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
细胞核与线粒体的分离
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。
• 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀；
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/2100水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。
一种从梨花粉管中分离纯化线粒体的方法[发明专利]
![一种从梨花粉管中分离纯化线粒体的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/eb774a81a45177232e60a240.png)
专利名称：一种从梨花粉管中分离纯化线粒体的方法专利类型：发明专利
发明人：张绍铃,王春雷,陈功,吴俊,吴华清
申请号：CN200810023305.9
申请日：20080408
公开号：CN101265461A
公开日：
20080917
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种梨花粉管中分离和纯化线粒体的方法，属于生物技术领域。
包括花粉的采集、培养，线粒体提取液的配制、清洗液的配制、Percoll梯度的配制以及花粉管线粒体分离过程，将培养好的花粉管用细胞筛过滤，添加线粒体提取液研磨，获得细胞质液体，振荡离心后，用Percoll梯度液纯化、清洗获得线粒体。
采用本方法获得完整的具有活力的花粉管的线粒体，提高了线粒体分离纯化效率。
这种从微量花粉管中分离纯化线粒体技术，适合于作为花粉管的生理生化及细胞遗传等实验材料。
对于研究开发花粉管的快速生长、以及不亲和花粉管的生长抑制技术将具有重要意义。
申请人：南京农业大学
地址：210095 江苏省南京市卫岗1号南京农业大学科技处钱宝英
国籍：CN
代理机构：南京经纬专利商标代理有限公司
代理人：张素卿
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细胞核与线粒体的分离
细胞器鉴定
细胞破碎的注意事项：
1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液 （0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有 足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小， 在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。
2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中
去血蛙肝2克+10ml匀浆液
剪碎+组织匀浆
匀浆液 1500rpm 离心 1min (2次 去除大组织块）
每人1个1.5ml离心管（ 0.5ml匀浆缓冲液+ 0.5ml肝组织匀浆液）
2700rpm离心10min
注意：沉淀与上清液从离 心机取出后均需置于冰上。
沉淀（细胞核及碎片）
重悬沉淀,2700rpm离心10min 吸取1小滴沉淀制一张涂片
(2) 线粒体：取线粒体沉淀涂片，注意勿太浓密，不待干即 滴加1/5000稀释的詹纳斯绿B染液染色20min，盖上盖玻片，镜检。
结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
2.作业 1）分别绘图描绘你所观察到的典型细胞核和线粒体的形态。 2）比较差速离心与密度梯度离心方法分离出的线粒体的差异.
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮
密度梯度离心分离线粒体（一位同学完成） (4) 去一支1.5ml离心管，先加入0.4ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液， 然后小心地在 1.5 mol/L 的蔗糖溶液上加0.4ml 1.0 mol/L 的蔗 糖溶液，随后将(2)中获得的上清液0.5ml轻轻地加在蔗糖溶液 上，60000 g（21000 r/min左右，五楼实验室）离心 20 分钟。 线粒体会在 1 mol/L 和 1.5 mol/L 蔗糖界面处形成一薄层。
线粒体分离试方法
线粒体分离试方法线粒体的分离实验方法有多种，以下是其中两种常见的方法：方法一：1.取苗约5克，加三倍体积0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。
2.8层纱布过滤，滤液经3000 g 4℃离心10 min，去除杂质。
3.上清液再用10000 g 4℃离心10 min，沉淀为线粒体。
4.沉淀用2ml 0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一次，弃上清。
5.线粒体沉淀保存用0.3 M甘露醇重新悬浮。
6.吸滴线粒体重悬液于载波片上，再加滴詹纳斯绿染色液，室温下静置染色15 min，用显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
方法二：1.将过夜酵母培养物无菌转移到两个15ml离心管中。
2.在4℃下以500g离心10分钟。
3.小心去除上清液，不要干扰沉淀。
4.使用微量移液器在1ml氯化钠（0.9%）中小心冲洗沉淀。
5.使用微量移液器丢弃离心管中的氯化钠。
6.将沉淀重悬于1ml冰冷的裂解缓冲液中，并使用微量移液器充分混合。
7.在4℃的摇床上孵育10分钟。
8.在4℃下以1000g离心10分钟，小心去除上清液。
9.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中，并使用针头的钝端完成细胞破碎。
10.将裂解物在4℃下以1000g离心10分钟。
11.将上清液转移到新鲜的15mL管中，并混合从步骤7中获得的上清液。
12.在4℃下以6000g离心10分钟并弃去上清液。
13.用线粒体储存缓冲液清洗颗粒。
14.在4℃下以6000g离心20分钟。
这两种方法的主要步骤包括细胞或组织的匀浆、离心、去除杂质和线粒体的沉淀及重悬等。
在实际操作时，可以根据实验的具体需求和条件选择合适的方法，并严格按照步骤进行操作，以获得高质量的线粒体样本。
线粒体dna分离试剂盒原理
线粒体dna分离试剂盒原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：线粒体DNA分离试剂盒原理是通过一系列化学反应和物理方法将细胞中的线粒体成功分离出来，进而提取其中的DNA。
线粒体DNA是细胞中的一个重要组成部分，它负责细胞能量代谢的调控，对细胞的正常功能发挥起着至关重要的作用。
分离线粒体DNA对于研究细胞的功能及疾病的发生机制具有重要意义。
线粒体DNA分离试剂盒原理主要包括以下几个步骤：细胞溶解。
在进行线粒体DNA的分离之前，首先需要将细胞溶解，使得线粒体能够从细胞内部被释放出来。
通常使用含有细胞膜破裂酶的缓冲液进行细胞溶解，破坏细胞膜结构，释放出细胞内的线粒体。
线粒体富集。
在细胞溶解后，线粒体和其他细胞器混合在一起，需要通过质量差异将线粒体富集起来。
这一步可以利用超速离心对细胞提取物进行离心分离，线粒体在特定离心速度下沉降速度比较快，因此可以富集到下沉的沉淀物中。
然后，DNA提取。
在线粒体获得富集后，接下来需要进行DNA的提取。
通过添加蛋白酶、盐溶液等进行线粒体膜的破裂，释放出线粒体内的DNA。
然后使用乙醇沉淀法或硅胶柱法将DNA分离出来，并通过离心将DNA沉淀下来。
纯化和检测。
分离出的线粒体DNA往往还会存在一定程度的杂质，需要进行纯化处理。
通过特定的柱式层析或凝胶电泳等方法进行DNA 的纯化，去除掉余留的蛋白质、RNA等杂质。
通过比色法或荧光定量等方法检测DNA的浓度和纯度，以确保获得的线粒体DNA能够用于后续的实验研究或分析。
线粒体DNA分离试剂盒原理是通过一系列化学反应和物理方法将细胞中的线粒体成功分离出来，提取其中的DNA，并进行纯化和检测，为后续的研究工作提供可靠的实验材料。
通过这一技术手段，研究人员可以更加深入地了解细胞内线粒体的功能及其在疾病发生中的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的理论依据。
【2000字】第二篇示例：线粒体DNA（mitochondrial DNA，简称mtDNA）是线粒体内含有的一种特殊的DNA，其具有独特的特性和功能。
线粒体dna分离试剂盒原理
线粒体dna分离试剂盒原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：线粒体DNA（mtDNA）是细胞内的一种特殊DNA，主要存在于细胞的线粒体中。
它是由母亲遗传给子代的，与细胞核DNA有着不同的特征和功能。
线粒体DNA在细胞的能量产生过程中起到关键作用，因此对其进行研究对于理解细胞功能和疾病的发生具有重要意义。
为了研究线粒体DNA，需要将其从细胞中分离出来。
而线粒体DNA分离试剂盒就是为了这个目的而设计的。
它包含了借助化学试剂和特殊操作步骤将线粒体DNA从细胞中提取出来的各种试剂和工具。
线粒体DNA分离试剂盒的原理主要可以分为以下几个步骤：第一步：细胞裂解细胞裂解是线粒体DNA分离过程中的第一步。
通过加入裂解缓冲液和蛋白酶，使细胞膜和细胞核膜失去完整性，从而释放出细胞内的线粒体和线粒体DNA。
第二步：线粒体分离在细胞裂解后，线粒体需要从细胞中分离出来。
这一步通常需要使用离心过程，通过调节不同离心速度和时间来沉淀线粒体，从而与其他细胞器分离。
第三步：DNA提取在成功分离出纯净的线粒体后，就需要进行DNA提取。
通过加入相应的试剂和离心操作，将线粒体DNA从线粒体中提取出来。
这一步需要注意避免DNA的降解和污染。
第四步：DNA纯化提取出的线粒体DNA可能还含有其他杂质，需要进行纯化操作。
通过加入适当的试剂和离心操作，将线粒体DNA纯化成较纯的形式，以便后续的实验操作。
线粒体DNA分离试剂盒的原理就是通过上述步骤将线粒体DNA 从细胞中提取出来，并经过分离、提取和纯化等操作得到纯净的线粒体DNA样品，以供进一步的实验研究。
线粒体DNA在人类疾病的研究中具有重要的应用价值。
许多遗传性疾病和退行性疾病都与线粒体DNA的突变和功能异常有关，因此通过研究线粒体DNA可以更好地理解这些疾病的发生机制，并为临床诊断和治疗提供新的思路和方法。
总的来说，线粒体DNA分离试剂盒的原理是通过一系列化学试剂和操作步骤将线粒体DNA从细胞中提取出来并进行纯化，为线粒体DNA的研究提供了重要的技术支持和工具。
动植物细胞器离心法分离
（2）保存液：0.3mol/L甘露醇(pH7.4)
（3）20％次氯酸钠(NaClO)溶液。
（4）1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配 制。
2．器材：温箱、冰箱、纱布、瓷研钵、冷 冻控温高速离心机。
【实验步骤】
1．玉米种子用20％次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水 冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱 布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培育2~3d。 待芽长到1~2cm长时剪下约15g，放0~4℃1h。
沉淀(细胞核及质膜碎片) 清(1)合并
上清液(2)→与上
分离线粒体：
混合上清液10000×g离心10 min
沉淀(线粒体)
上清液(弃去)
洗涤
加预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液10 mL， 10000×g离心10 min
沉淀(纯化的线粒体)
上清液(弃去)
3．活性鉴定：
(1) 细胞核：取核沉淀1滴涂于载玻片，加入 Carnoy固定液15 min，晾干。Giemsa染液染 10 min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用 显微镜(40×)检查，细胞核呈紫红色，混杂的 胞质为浅蓝色碎片。
将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中 用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的 离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒 的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质 的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间， 组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉 降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增 加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其 大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批 收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、 溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。
(2) 0.34 mol／L蔗糖+0.01 mol／L Tris一盐酸缓冲液 (pH7.4)，配法同上。
实验五 线粒体的分离与观察
（二）密度梯度离心
（density gradient centrifugation）
A等速度沉降，B等密度沉降
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度 梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
密度梯度离心法是用密度具有梯度的介质来替换 离心管中的密度均一的介质，使介质分为不同的 层次，浓度的低的在上层，浓度高的在底层。将 细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大 小、形态、密度的颗粒就会以不同的速度向下移 动，集中到不同的区域，可以分别收集。
差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使 较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速 将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来 ，从而使各种亚细胞组分得以分离。
但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心 十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离 得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需 经反复悬浮和离心加以纯化。
F 105000g x 20min
内容物 完整细胞 细胞核，细胞碎片 叶绿体 线粒体、溶酶体、微体 微粒体 0.26%脱氧胆酸纳 核糖体
三、实验材料、用品 1.器材： 剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微
镜，冷冻高速离心机等。 2. 材料： 玉米黄化苗
四、玉米线粒体及细胞核的分离 从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能
细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗 糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一 定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶 的活性，避免细胞器的聚集。
沉淀
转速x时间
A 150g x 20min
B 1000g x 20min
C 3000g x 6min
差速离心分离线粒体
差速离⼼分离线粒体差速离⼼法分离线粒体课程名称：细胞⽣物学指导⽼师：成绩：__________________ 实验名称：差速离⼼法分离线粒体同组学⽣姓名：喻⼉⼀、实验⽬的和要求（必填）⼆、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作⽅法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）⼋、讨论、⼼得⼀、实验⽬的1.学会差速离⼼⽅法及活体染⾊⼀般⽅法。
2.掌握⿏肝线粒体的分离与鉴定⽅法⼆、实验原理1.差速离⼼法:在⼀定的离⼼场中，⼤⼩不⼀的颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在⼀个均匀悬浮介质中离⼼⼀定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同⽽停留在⾼低不同的位置。
依次增加离⼼⼒和离⼼时间，就能够使这些颗粒按其⼤⼩、轻重分批沉降在离⼼管底部，从⽽分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和⼤分⼦可依次再分离。
2.悬浮介质的选择：通常⽤缓冲的蔗糖溶液，它⽐较接近细胞质的分散相，在⼀定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
离⼼⼒ RCF=1.119 ? 10-5 ? r ? n2 （单位：重⼒常数 g ； r 离⼼场半径；n 转速）3. 詹纳斯绿活染法鉴定线粒体：线粒体内的细胞⾊素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态⽽呈现蓝⾊；⽽在周围的细胞质内，这些染料被还原成为⽆⾊。
在进⾏线粒体的体外染⾊时，⾄少要使材料在詹纳斯绿染液中染⾊15min 以上，才能放上盖玻⽚，以便材料经过氧化（即与空⽓接触）后，线粒体被染⾊。
活性样品检测的关键环节：整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
三、实验材料与试剂材料：⼩⽩⿏肝脏器材：玻璃匀浆器，⾼速冷冻离⼼机，普通离⼼机，剪⼑，镊⼦，⼩烧杯，离⼼管，载玻⽚，盖玻⽚，滴管，普通光学显微镜，试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染⾊液四、实验步骤I 差速离⼼法分离线粒体1．⼩⽩⿏断颈致死，⽤75%⼄醇消毒外部⽪肤后，剖腹取肝；2．⽤预冷⾄0℃的匀浆介质洗肝，⼲净滤纸吸⼲⽔分后称重；3．往平⽫中先加⼊适量匀浆介质，将肝剪碎，按每克肝组织加8mL 匀浆介质，加⾄10mL 玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆；4．待肝组织基本碎裂后，将匀浆液移⾄10mL 离⼼管中，平衡后， 4℃下4800rpm 离⼼15min ，吸取上清液；（染⾊观察）；5.将1mL 上清液转移⾄Eppendorf (EP)管中，4℃，11000rpm(10000g)离⼼ 20min ；(位置)6．转移上清液⾄新EP 管中；7．沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬浮液。
线粒体的分离与鉴定
线粒体的分离与鉴定
实验简介
线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器，人体内95%
的ATP是由线粒体中的呼吸链所产生的，因此线粒体是细胞
内的“能量加工厂”，线粒体通过氧化磷酸化作用，进行能量 转换，为细胞进行各种生命活动提供能量。
本实验以小鼠肝组织为实验材料，通过对肝组织匀浆液悬浮
在蔗糖介质中进行差速离心法制备线粒体样本，然后通过詹 纳斯绿活染法进行显微镜观察线粒体的形态。 实验学时3个。
四、实验操作
速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷 到0～4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0～4℃条件下，
制备小鼠肝细胞匀浆：实验前小鼠空腹12h，拉颈处死，剖腹取肝，迅
按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液 应分数次添加。匀浆液用200目铜筛过滤备用。 离心：先将9ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心
六、注意事项
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程 不宜过长，以保持组分的生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中 进行。 将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离 心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层 效果。 姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应 用液不可使用。
地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻高速离心机按下图顺序进行 差速离心。 差速离心提取鼠肝线粒体流程见下图。
差 速 离 心 提 取 鼠 肝 线 粒 体 流 程 图
沉淀 （细胞核及质膜碎 片） 沉淀
取5g 鼠肝
先用生理盐水洗净血水，滤纸吸干，然后 用预冷的0.25M蔗糖溶液洗3次。
洁净的肝组织
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的 25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内惟一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今向来是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或者万转/分离心机。
2.组织捣碎机或者匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布(尼龙布)、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器(氧极普测试系统)。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl (0.05M，pH7.2)缓冲液。
3.磷酸缓冲液(0.2M，Ph7.2)。
4.提取洗涤液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇 (0.35M)、牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml)，EDTA (0.001M)，TriS-HCl (0.01M，pH7.2)缓冲液。
5.悬浮液(同试剂 4，但不加 BSA)。
6.反应液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇(0.35M)、蔗糖(0.25M)、KCl (10ml，pH7.2)、EDTA (0.2mM)、MgCl2 (5mM)、TriS-HCl (10mM，pH7.2)。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素 (物理和化学的)作用而失活，特殊是膜的完整性极其重要，因为惟独完整的线粒体才干进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下(0-4 o C)进行。
[2].要注意分离介质的 pH 值， pH 值应和被采用的材料一致。
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线粒体的分离————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：实验三线粒体的分离、超活染色与观察一、实验目的1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。
2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
3、学习细胞器的超活染色技术。
二、实验原理利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。
离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。
体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
三、实验材料与方法1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。
2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。
温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。
四、实验方法（一）大鼠肝线粒体的分离1、制备大鼠肝细胞匀浆。
实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。
称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。
然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2、差速离心。
先将3ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入3ml肝匀浆使其覆盖于上层。
用冷冻控温高速离心机按图7-1顺序进行差速离心。
3、分离物鉴定。
(1)细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液（原液10－20倍稀释）染色10min。
自来水冲洗，吹干，镜检。
结果：细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。
(2)线粒体：取线粒体沉淀涂片（注意勿太浓密），不待干即滴加1%詹纳斯绿B染液染20min，覆上盖玻片，镜检。
线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
分离细胞核鼠肝1克匀浆↓匀浆过滤↓滤液（制涂片一张①）↓将滤液3mL覆盖于相同容积的0.34mo l/L蔗糖溶液上↓700×g离心10mi n↓↓↓沉淀（细胞核及碎片）上清液1(制一张涂片②,自然干燥)↓洗涤（0.25mol/L预冷蔗糖溶液3mL洗涤两次）每次1000×g离心15min↓↓↓沉淀（细胞核）上清液2(与上清液1合并)分离线粒体混合上清液10000×g离心10↓↓↓沉淀（线粒体）上清液（弃去）↓洗涤，加0.25mol/L预冷蔗糖溶液6mL ,10000×g离心10min,重复洗涤两次↓↓↓沉淀（线粒体）上清液（制一张涂片，后弃去）（二）玉米线粒体的分离1、玉米种子用20%次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。
将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培育2－3d。
待芽长到1－2cm长时剪下下约15g，放0－4℃ 1h。
2、加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。
3、用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min。
除去核和杂质沉淀。
4、取上清液10000×g离心10min，沉淀为线粒体。
再同上离心洗涤一次。
5、沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中，注意以上匀浆化及离心均控制在0－4℃进行。
6、线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1%詹纳斯绿B 染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。
（三）人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察1、取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。
2、实验者用牙签钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10－15min（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。
3、在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。
可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。
（四）洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察1、用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10－15min。
2、用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展开，盖上盖玻片进行观察。
3、在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。
仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。
五、作业与思考：1、将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。
2、分离介质0.25mol/L及0.34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层？有什么作用？3、绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布。
4、用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体等多种细胞器？【资料】1、1%詹纳斯绿B染液：称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热（30－40℃），使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
取1%原液1ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。
最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。
2、0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)：0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）10ml；0.1mol/L盐酸8.4ml；加重蒸水到100ml；再加蔗糖使浓度为0.25mol/L；蔗糖为密度梯度离心用D（＋）蔗糖3、0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)：配方与前类似4、固定液：甲醇-冰醋酸（9：1）5、姬姆萨染液：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，纯甲醇33ml。
先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵内钵磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2h令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。
用时吸出少量用1/15 mol/L磷酸盐缓冲液作10－20倍稀释6、1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）：1/15mol/L KH2PO4 50ml＋1/15mol/L Na2HPO4 50ml7、分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）、3mmol/L EDTA、0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA）8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tirs）溶液与42ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml9、、Ringer 溶液氯化钠0.85(变温动物用0.65g)氯化钾0.25g氯化钙0.03g蒸馏水100ml10、10%、1/3000中性红溶液称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热（30－40℃）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。
临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。