表达载体的构建
基因治疗中的表达载体构建与优化方法
基因治疗中的表达载体构建与优化方法基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过将修饰过的基因导入患者体内，以实现对疾病基因的修复或替代。
在基因治疗中，表达载体的构建和优化是关键的一步，它决定了基因在患者体内的表达效率和稳定性。
本文将介绍基因治疗中常用的表达载体构建与优化方法。
表达载体是将目标基因导入细胞内进行表达的工具。
常见的表达载体主要包括质粒和病毒载体。
质粒是一种双链DNA分子，它可以自主复制和表达携带的基因。
病毒载体是一种利用病毒基因表达机制的表达工具，常见的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和腱病毒等。
表达载体的选择应根据具体的治疗目标、基因大小和细胞类型等因素进行考虑。
表达载体的构建是基因治疗中的关键一步。
首先，需要将目标基因克隆到合适的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后利用限制性内切酶进行酶切，并将目标基因与表达载体连接。
常用的连接方法有限制性内切酶切和连接、PCR聚合、Ligase连接等。
连接完成后，需要进行质粒或病毒载体的复制，以获得足够多的表达载体。
表达载体的优化是为了提高基因在患者体内的表达效率和稳定性。
优化的方法有很多种，下面将介绍几种常见的方法。
首先，可以通过调整启动子和增强子的选择来提高基因表达效率。
启动子是调控基因转录的序列，它的选择可以影响基因的表达水平。
常用的启动子有CMV启动子、EF1α启动子和PGK启动子等。
增强子可以增加基因的表达水平，常用的增强子有CMV增强子、SV40增强子和EF1α增强子等。
通过合理选择启动子和增强子的组合，可以提高基因在细胞内的表达水平。
其次，可以通过改变表达载体的拓扑结构来提高基因表达效率。
常用的方法有线性化质粒和环形质粒之间的选择。
线性化质粒在导入细胞内后，可更容易与细胞内的转录因子结合，从而促进基因的表达。
环形质粒则具有更好的稳定性，在不进一步构建的情况下，可以长期保持在细胞内。
此外，还可以通过引入信号序列来优化基因的靶向表达。
信号序列是一段具有特定功能的氨基酸序列，能够促使基因产物在细胞中的定位和分泌。
表达载体的构建
关于表达载体的构建1.表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。
这类载体既有复制子，更要有强启动子；2.大肠杆菌中的表达载体应含有（1）强启动子（2）在启动子下游区和A TG上游区有一个好的SD序列。
（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。
我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。
3.载体构建的步骤（1）.设计引物1.引物的长度用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。
2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。
引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)4. 引物的GC含量引物中GC含量应占到45％一60％左右。
在引物设计时应尽量避免引物二聚体和发卡结构，尤其是在引物3，端不应有互补结构。
引物3，端应与目的片段完全配匹，而其5’端碱基可不与模板配匹，故在引物设计时可在其5，端加上限制酶位点或其他短的序列，这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循环中将被带到双链DNA中去，这样反应产物不仅含有目的序列，同时在目的基因的两侧又有了新的限制酶位点，用相应的限制酶切割后即可将PCR产物定向克隆到载体中。
以基因GhAGP31为例说明，以下是GhAGP31的ORF序列：ATGGGGTTTGCTGTAATAGTACTAGTAGTTAAAGCTGCTTTGCTTGTGCAGCTTTCACT GTTGTTACTGAGCACCTTCACTGTCTCTGCTCCCATTTGGCCTCAGGCTTCTCCTCCTC ATTACCATGCTGTTTCACCTGTAGTCCCGCCTACTCACCCACCAACCCACCACCATCAC CACCACCCTCACCCTCACCCTCACCCCCATCCTCATCCACCCACTAAGCCCCCAACCC CCACTCCTCCTCCAGTTCA TCCACCACCCAAGGCGCCAGTGCAACCACCAACCAAGC CACCAGTTCACCCACCACCCAAGCCACCAGTTCAACCTCCAACTAAGCCACCAACCA AACCTCCAACTCAACCCCCGACTAAGCCACCAACTCAGCCCCCGACTAAGCCACCAA CCAAGCCTCCAACTCAGCCCCCGACGAAGCCACCAACACACCCACCATCTCATCCTC CGGCCAAGCCACCTAAA TCGAGCCAGGTGGCAGTGCAGGGCGTTGTTTATTGCAAGT CA TGCAAGTACGCCGGAGTCGACACCCTTTTGGGAGCTAAACCAATTCTTAGTGCCAC CGTAAGGCTGACA TGCAAAGACGCTAAAAACGAATTAACGGTCCAGTTCAAGACTGA CAAGAATGGTTA TTTCTTCCTGCAAGCACCAATTACCATCTACAATTTTGATCTCCACA ATTGCAGCGTCTCCCTCGTATCTTCACCATTGAAAGCATGCAGCAAGCCA TCTAATCTA AACGGTGGATTGAAGGGCGCCCCCTTGAAGCCTGAGAAACCATCTACTTCAAAGAAG CTCCCATATGTTCTCTACAGCGTTGGGCCCTTCGCTTTCGAACCCACATGTCACAAGAA CTAGGhAGP31Up1: 5’>CTTGGA TCCATGGGGTTTGCTGTAATAGTAC<3’BamHI GhAGP31Dn1: 5’>CTTTCTAGAGTTCTTGTGACA TGTGGGTTCG<3’XbaI 两条引物都有CTT作为保护碱基，同时平衡引物中的G+C含量。
融合蛋白表达载体的构建
融合蛋白表达载体的构建一、概述融合蛋白是把一个蛋白与其他物质混合在一起形成新的融合蛋白。
它们可以用于改善药物的药理学性质，广泛用于药物研究，疾病诊断，以及在医学和生物技术领域的应用。
为了有效地进行融合蛋白表达，科学家们需要设计一种质粒，它既能携带融合蛋白的基因信息，又能使表达的融合蛋白具有理想的性质，因此，构建融合蛋白表达载体就成为了研究者们的重要内容。
二、融合蛋白表达载体的构建1.质粒设计质粒设计是融合蛋白表达载体的核心部分，它能够携带融合蛋白的基因信息，并控制融合蛋白的表达。
一般而言，融合蛋白表达质粒包括表达调控基因、融合基因、保守克隆基因等几部分，其中表达调控基因以及保守克隆基因部分主要用于控制融合蛋白的表达，而融合基因部分则用于携带融合蛋白的基因信息，使其能够表达出想要获得的性质。
2.质粒的合成质粒设计完成之后，下一步就是将其合成成一种可用于融合蛋白表达的质粒。
一般而言，此步骤可以通过化学合成或者基因重组技术完成。
化学合成方法可以可靠地合成出想要获得的质粒，而基因重组技术则可以以更快的速度构建出相似的质粒。
3.表达测试表达测试是质粒构建过程中不可或缺的一部分，它能够检测融合蛋白是否能够正确表达，从而确定质粒是否构建成功并具有较好的表达能力。
表达测试通常包括定量PCR法、流式细胞仪法以及免疫印迹法等几种常见技术，这些技术都可以帮助科学家们及时发现融合蛋白表达存在的问题，从而指导科学家改进构建融合蛋白表达载体的工作。
三、结论融合蛋白表达载体的构建是科学家们针对融合蛋白表达问题所付出的努力，它包括质粒设计、质粒合成以及表达测试等几个步骤，有助于融合蛋白表达的安全、稳定和高效，并且可以提供药物及其他生物技术应用的理想基础。
实验十五、、表达载体的构建
三种不同阅读框架图例
PinPoint Xa-1 图谱
目的基因的表达产物检测
A．重组载体的构建：将目的DNA片段与表达载 重组载体的构建： 重组载体的构建 体连接，产生阅读框架对应的融合. B ． 转 化 ： 将 重 组 后 pGEMEX-1 载 体 转 化 E.coli JMl09，然后涂布于含氨苄青霉素 (100µg/m1) 的LB平板上，在37℃下培养过夜。筛选能在平 板上生长的转化子。 C．转化子鉴定 将转化子挑出后，小批量培养， 转化子鉴定: 转化子鉴定 抽提质粒进行酶切鉴定或者PCR鉴定，确证克 隆片段确为所需目的片段后，进行诱导表达。 D．诱导表达：将含有重组质粒的JM109接入5ml 诱导表达： 诱导表达 含100ug/m1 Amp的LB培养基中培养过夜，第 二 天 取 50ul 培 养 液 接 种 到 另 一 5ml LB( 内 含
一、基因来源： 基因来源： 原核生物 真核生物 二、原核表达系统 原核表达系统： 1、原核表达系统： 遗传背景清楚，易改造，培养容易，费用 低，蛋白质表达水平高。但在原核中表达后所合 成的蛋白无自我修饰如糖基化等，或因折叠的方 式不正确或折叠效率的低下，最后产生的蛋白质 其生物活性很低。 2、真核表达系统
原核表达载体 克隆载体: 克隆载体
通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标 记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。
表达载体: 表达载体:
除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位 点(核糖体结合位点,又称SD序列，它是指mRNA分子中核糖 体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面3～12个碱基， 该序列与16S rRNA的互补)、转录起始信号、转录信号、翻 译起始密码子(ATG)和终止密码子等一系列调控序列。
基因表达载体的构建方法
基因表达载体的构建方法基因表达载体是一种用来携带外源基因并将其表达的工具，它可以被用于基因工程、基因治疗、蛋白质表达等领域。
构建一个高效的基因表达载体对于生物学研究和应用具有重要意义。
下面将介绍基因表达载体的构建方法。
首先，选择合适的表达载体。
常用的表达载体包括质粒、病毒、原核生物和真核生物等。
质粒是最常见的表达载体，它具有稳定性高、易于操作等优点。
而病毒载体则可以实现高效的基因传递和表达。
根据实验需要和研究对象的特点，选择合适的表达载体非常重要。
其次，设计基因的插入序列。
在构建基因表达载体时，需要将目标基因插入到载体中，并确保基因的正确表达。
为了实现这一目标，需要设计合适的引物，并利用PCR技术扩增目标基因。
此外，还需要考虑基因的启动子、终止子、信使RNA等序列的设计，以确保基因在宿主细胞中能够得到正确的表达。
然后，将目标基因插入载体。
一般来说，可以利用限制性内切酶将目标基因和表达载体进行酶切，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。
此外，还可以利用基因克隆技术将目标基因插入到表达载体中。
在这一步骤中，需要注意选择合适的酶切位点、连接方式和连接效率，以确保插入的基因能够稳定地存在于载体中。
接着，进行载体的转化和筛选。
将构建好的基因表达载体导入到宿主细胞中，然后利用抗生素筛选、荧光筛选等方法，筛选出带有目标基因的阳性克隆。
这一步骤需要注意转化效率、筛选条件和筛选方法的选择，以确保获得高效的表达载体。
最后，验证基因表达载体的功能。
构建好基因表达载体后，需要进行功能验证，包括基因的表达水平、蛋白质的表达情况、生物学活性等方面。
通过Western blot、荧光显微镜、活性测定等方法，验证基因表达载体的功能和稳定性，为后续的研究和应用奠定基础。
总之，构建基因表达载体是一个复杂而又关键的过程，需要综合考虑载体的选择、基因的设计、插入、转化和验证等多个环节。
只有在每一个环节都做到严谨和细致，才能获得高效、稳定的基因表达载体，为生物学研究和应用提供有力支持。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤【1】一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的主要步骤包括：
1.目的基因的获得：即使用限制性核酸内切酶切割质粒，露出黏性末端，再用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。
2.载体和目的基因的限制性酶切：用相同的限制性酶酶切载体和目的基因，使它们产生相同的黏性末端。
3.连接转化：将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键。
4.加入适量的DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。
常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。
2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。
可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。
3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。
这些序列将调控基因的表达方式和水平。
4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。
5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。
6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。
7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。
8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。
需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。
在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。
蛋白表达 载体构建
蛋白表达载体构建
蛋白表达是指通过转基因技术将感兴趣的蛋白基因导入到宿主细胞中，并使其在细胞中高效地表达出来。
载体构建是实现蛋白表达的关键步骤之一。
载体是指在转基因技术中承载外源基因并将其导入宿主细胞中的一种DNA分子。
常见的载体有质粒和病毒等。
载体构建主要包括以下几个步骤：
1. 选择合适的载体：根据蛋白表达的要求选择合适的载体，常用的质粒载体有pET、pGEX、pcDNA等，常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒等。
2. 提取载体：从细菌或其他适当的宿主中提取合适的载体，通常通过菌落PCR 或限制性内切酶切割等方法获得目的载体。
3. 构建目的载体：将目的基因插入到载体的适当位点上，并将其连接起来。
此步骤可以通过PCR扩增得到目的基因片段，再经过连接酶作用与载体连接。
4. 归一化载体：经过构建后的载体需要通过测序和限制性内切酶切割等方法验证其正确性，确保目的基因已经成功插入到载体中。
5. 转化宿主细胞：将构建好的载体导入到宿主细胞中，可以通过化学方法、电穿孔、电转化等手段完成。
6. 选择和筛选：经过转化后的宿主细胞进行培养和筛选，通常使用抗性标记和报告基因等方法来筛选带有目的基因载体的细胞。
7. 表达和纯化：经过筛选后的细胞进行大规模培养，使目的基因在细胞中高效表达。
随后可以通过蛋白纯化的方法获得目的蛋白。
总的来说，载体构建是实现蛋白表达的重要步骤，通过合适的载体选择、目的基因插入和转化宿主细胞等步骤，能够实现外源基因的高效表达。
基因表达载体的构建
基因枪法 花粉管通道法
.
1）土壤农杆菌法
.
2）基因枪法
.
3）花粉管通道法
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2、受体细胞是动物细胞
显微注射法 注入动物受精卵
.
1982年，世界上第一例体型比普通 小鼠大1.8倍的转基因超级小鼠诞生物的好处是什么？ 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 要想使重组DNA顺利进入细菌细胞内，最
二、基因表达载体的构建（核心步 骤）
.
先用同一种限制 酶分别切割目的 基因和质粒，再 用DNA连接酶将 二者连接，形成 重组DNA分子。
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三、将目的基因导入受体细胞（转化）
常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物
细胞等。
.
1、受体细胞是植物细胞
农杆菌转化法：主要侵染双子叶植物（伤
.
2、检测mRNA
分子杂交技术
.
4、检测性状
.
大的难题是什么？ 一般用CaCl2处理，改变细胞膜的通透性，
使得重组DNA能够进入细胞。
.
四、目的基因的检测与鉴定
分子 水平
检测转基因生物的DNA是否插入目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质
个体水平 检测性状
.
1、检测目的基因
DNA分子杂交技术 提取转基因生物的DNA 制作分子探针（目的基因的一段单链序列） 进行分子杂交
基因表达载体构建
谢谢大家！
三 将目的基因导入受体细胞
基因导入受体细胞的标志是什么？
1目的基因与载体在受体细胞共同复制、遗 传和表达。或目的基因插入细胞染色体上DNA分 子之中，随同受体细胞DNA分子复制、遗传和表 达。
2 实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部 分，这种现象叫做转化。
2 目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？ 通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。
（2）启动子——位于编码蛋白质结构基因之首一段殊结 构的DNA片段，RNA聚合酶的识别部位和结合部位。
（3）终止子——位于编码蛋白质结构基因末端一段特殊 结构的DNA片段，具有终止基因转录过程的作用。
（4）复制原点——能够自我复制保证目的基因在受体细 胞中复制遗传和表达。
（5）遗传标记基因——检测受体细胞中是否含有目的基 因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
宫或输卵管发育成具备新性状的动物。 2 实例
世界上第一例体型比普通小鼠大1.8 倍的转 基因“超级小鼠”就是用显微注射技术获得成
（三） 将目的基因导入微生物细胞
目的基因导入大肠杆菌最常用的转化方法是：
1 用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于能 够 吸收环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称 为感受态细胞。 2 用大肠杆菌质粒与目的基因进行重组形成基 因——质粒重组DNA分子。 3 将基因——质粒重组DNA分子与感受态细胞 混合，在一定温度下，感受态细胞吸收周围重 组DNA分子，完成转化过程。
请你以质粒作载体构建基因表达载体之模式图
启动子Leabharlann 插入目的基因基因基因表表达达载载体体
终止子
复制原点
遗传标记基因
4 建构基因表达载体方法
（1）用某种限制酶如EcoRI限制酶，在基因插 入位点切割质粒，使质粒出现一个切口， 露出两个黏性末端。
构建表达载体的实验流程及其注意事项
质粒纯化：
1、PEG纯化
缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多 优点：质粒纯度高（不含线状DNA）
浓度大
2、过柱法：
缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA） 优点：省时省力
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质粒的电泳
Marker是酶切片段； 质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。
30
质粒验证
1、酶切验证
一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？ 如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
12
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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基因工程所用的酶
限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息
EcoR I
Pst I
GAATTC CTTAAG
CTGCAG GACGTC
验证每步产物，设置对照以检查每一反 应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自 如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉 及的实验原理。
——第一版前言（p11）
《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社
2
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
质粒提取：碱裂解法
收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。
溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS
冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切
溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸 迅速颠倒3次混匀后，置于冰上
表达载体构建
表达载体构建1. 背景介绍表达载体是在分子生物学领域中广泛使用的工具，用于将目标基因导入宿主细胞中并使其表达。
构建高效的表达载体对于基因功能研究和基因工程应用具有重要意义。
本文将介绍表达载体的构建方法及其在基因表达中的应用。
2. 表达载体的构建方法构建表达载体的一般步骤包括选择合适的载体骨架、选择适当的启动子和终止子、插入目标基因序列以及进行转染或转化等操作。
下面将详细介绍表达载体的构建方法。
2.1 选择合适的载体骨架常用的载体骨架包括质粒和病毒载体。
质粒是可以在细菌中复制的DNA分子，通常由起始位点、选择标记和多个限制酶切位点组成。
病毒载体包括腺病毒、慢病毒等，具有高效转染特性。
选择适合自己研究的载体骨架是表达载体构建的第一步。
2.2 选择适当的启动子和终止子启动子是基因表达的起始信号，终止子是基因表达的终止信号。
启动子的选择应根据目标基因的表达需求和宿主细胞的特性进行。
常用的启动子包括强启动子（如CMV启动子）、组织特异性启动子等。
终止子则可以选择常规的转录终止信号。
2.3 插入目标基因序列选择合适的酶切位点，在载体DNA上进行限制性内切酶切割，并将目标基因序列与载体连接。
连接的方法可以是经典的限制性酶切连接、PCR扩增连接、Ligase连接等。
连接完成后，应进行酶切鉴定和测序验证，确保目标基因序列插入准确。
2.4 进行转染或转化将构建好的表达载体导入宿主细胞中，实现基因表达。
转染方法包括化学转染、电穿孔转染、病毒介导转染等，转化方法包括细菌的电转化、植物的农杆菌介导转化等。
3. 表达载体的应用表达载体广泛应用于基因功能研究和基因工程应用，具有重要的实验意义和应用前景。
3.1 基因功能研究通过表达载体，可以实现外源基因的高效表达，进而研究基因的功能、调控机制等。
比如可以通过表达载体将目标基因在细胞中过度表达或进行基因敲除等，来研究该基因在细胞或生物体中的功能。
3.2 基因治疗表达载体在基因治疗中具有重要的应用价值。
基因工程-基因表达载体构建(2)
（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用 DNA分子杂交 方法，用 DNA与RNA杂交 方法检测目的基因是否转录，用 免疫（ 抗原抗体反应 ）法检测目的基因是否表达。另外也 让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态。 可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因 DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是脱 ；
（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞 受精卵 等。动物常把 细胞作为受体细胞。导入植物细胞的 方法有 等；农杆菌转化 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 染色体DNA 法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的 显微注射法 上，导入动物细胞的方法有 ；如果运载体是质 CaCl2 处理，以增大细菌 细胞壁 粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用 的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的 基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制， 由于 细菌繁殖的速度非常 ，在很短的时间内就能够获 快 得大量的目的基因。
途径 方法
供体细胞中的DNA 中直接分离基因 鸟枪法
供体细胞中的DNA ↓限制酶 许多DNA片段 ↓载入 运载体 ↓导入 受体细胞 ↓ 外源DNA扩增, 产生特定性状 ↓分离 目的基因
人工合成基因（真核细胞） 反转录法
目的基因mRNA ↓反转录 单链DNA ↓合成 双链DNA(即目的基因)
根据已知氨基酸 序列合成DNA
氧核苷酸且遵循碱基互不配对原则
转基因表达成功的原因是生物 共用一套遗传密码 。 基因工程的意义： 。 目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍。
实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺 中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可 想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。
利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。
本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。
一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。
选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。
2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。
3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。
可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。
4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。
通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。
二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。
这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。
2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。
通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。
3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。
通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。
4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。
将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。
5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。
通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。
实验十五、、表达载体的构建
在实验过程中，我们对实验条件进行了优化，提高了实验 的效率和成功率，为今后的实验提供了有益的参考。
研究展望
拓展应用领域
未来可以将该表达载体应用于更多的基因治疗和基因功能研究领域， 为相关领域的发展提供有力支持。
改进表达载体
针对本次实验中存在的不足，可以对表达载体进行进一步的优化和 改进，提高其转染效率和稳定性，以适应更多不同类型细胞的需求。
控机制，为基因治疗和基因功能研究提供更加坚实的基础。
03
拓展应用范围
在未来的研究中，可以尝试将该表达载体应用于动物模型和临床试验中，
以验证其在不同生物体内的应用效果和安全性。
THANKS
感谢您的观看
表达载体通常由质粒或病毒DNA改造而来，它们能够将外源基因带入宿主细胞，并 在其中进行复制和表达。
通过构建不同的表达载体，科学家们可以实现基因的异源表达、高表达和定向进化 等目的，为生物制药、农业和工业生产等领域提供有力支持。
02
表达载体的基础知
识
表达载体的定义
表达载体是用于在宿主细胞中复制和 表达外源基因的运载体，它能够将目 的基因导入细胞并使其稳定遗传。
实验十五：表达载体 的构建
目录
CONTENTS
• 引言 • 表达载体的基础知识 • 实验材料与方法 • 实验结果与分析 • 结论与展望
01
引言
实验目的
了解表达载体在基因工程中的应 用。
学会设计并构建基因表达载体。
掌握表达载体构建的基本原理。
01
03 02
实验背景
表达载体构建是基因工程中的关键技术之一，它涉及到将目的基因插入到载体DNA 中，以便在宿主细胞中进行表达。
表达载体是基因工程中的重要工具， 它能够将外源基因在宿主细胞中进行 有效表达，产生所需的蛋白质或代谢 产物。
融合蛋白表达载体的构建
融合蛋白表达载体的构建融合蛋白表达载体的构建1、综述融合蛋白表达载体（fusion protein expression vector）是指将有特定功能的蛋白与启动子和响应元件结合到一起，然后构建在多肽片段表达载体上进行表达的载体。
融合蛋白表达载体可以帮助抗体和酶表达，它们也可能为蛋白定位，更好地控制蛋白表达提供帮助，更容易地把蛋白植入细胞内的膜，改善蛋白的结构并实现更高的表达水平。
2、融合蛋白的构建步骤一：准备载体融合蛋白表达载体的设计首先需要准备一个载体，载体可以是基因组DNA，基因的cDNA或者是其他可以表达目标基因的DNA片段，如遗传可变的质粒。
步骤二：确定编码区需要从基因组DNA、cDNA或者是其他载体（如质粒）中确定出编码目标基因的编码区，这一步一般是靠PCR扩增。
步骤三：筛选表达元件要实现融合蛋白效果，需要筛选出可以有效促进目标基因表达的表达元件，常用的表达元件有宿主细胞系特异性的启动子、促炎症基因表达的细胞因子受体对应的响应元件、核糖体蛋白结合位点以及转录抑制因子。
步骤四：构建融合蛋白表达载体在确定编码区和表达元件之后，就可以进一步设计和构建融合蛋白表达载体，使其具有指定的基因表达功能。
步骤五：植入细胞中和进行表达构建完毕的融合蛋白表达载体需要进入胞内，实现真正的核酸表达，可以通过转染（transfection）或者质粒转染（transfection）将融合蛋白表达载体植入细胞中，从而实现目标基因的表达。
步骤六：确定表达结果植入细胞后，可以通过Western Blot和ELISA等生物实验技术，从而确定融合蛋白的表达效果，从而确定融合蛋白表达载体是否有效。
3、结论融合蛋白表达载体可以提高蛋白表达的质量和效率，特别是在复杂的分子机制中，融合蛋白表达载体的使用可以帮助获得更高的可靠性和精确性。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
表达载体的构建注意事项
表达载体的构建注意事项构建载体是一项重要的任务，它决定了信息传递的质量和效果。
在进行载体构建时，我们需要注意以下几点：1. 独特性：确保文章内容的独一性，避免内容重复出现。
这样可以让读者获得新鲜感，并更好地吸引他们的注意力。
2. 结构合理：为了增强阅读流畅性，我们需要合理安排文章的结构。
可以使用适当的标题来划分段落，使内容更加清晰明了。
3. 避免网络地址：在文章中不得插入任何网络地址，以确保文章的纯文本性质。
这样可以避免读者在阅读过程中被打断或分心。
4. 避免数学公式和计算公式：文章中不应包含数学公式或计算公式。
这些公式对于非专业读者来说可能会造成困扰，降低文章的可读性。
5. 避免使用图片链接：不得使用、插入任何形式的图片链接。
这样可以避免读者在阅读过程中需要打开链接或依赖图像来理解文章的内容。
6. 避免依赖图像的语句：避免使用依赖图像的语句，如“如图所示”等字眼。
这样可以避免读者对文章内容的误解或困惑。
7. 避免重复问题：不得在文章中反复提出同一个问题。
这样可以避免读者产生厌烦或对文章内容产生疑惑。
8. 简洁自然：文章应该尽量简洁自然，避免过多的自我介绍。
这样可以让读者更加专注于文章的主题和内容。
9. 流畅表达：文章应刻画明确，句式流畅，并使用丰富多样的词汇来表达。
这样可以增加文章的可读性和吸引力。
10. 中文描述：请尽可能使用准确的中文进行描述，避免使用拗口或错误的词汇和表达方式。
11. 准确无误：确保文章内容的准确无误，严肃认真。
避免使用歧义或误导的信息，以免给读者带来困惑或误解。
通过以上注意事项，我们可以以人类的视角来构建载体，使文章富有情感，并使读者感到仿佛是真人在叙述。
同时，我们也要确保文章的自然度和流畅度，避免让读者感觉像机器生成的内容。
这样可以提高文章的质量和吸引力，让读者更加愿意阅读和理解。
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大肠杆菌表达系统 大肠杆菌
融合型原核表达载体 非融合型(天然蛋白质） 非融合型(天然蛋白质）原核表达载体
pGEMEX-1载体图谱（融合型） 载体图谱（融合型） 载体图谱
1. Gene10 reader peptide 260aa; 2. More than 50% cell peoteins, and 10mg/L of induced culture
选择表达载体应考虑的因素
(4).所产生的融合蛋白是否需要切割加工以及如何切割 加工。对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载体 序列间应有适当的切割识别序列。 (5).是否需要用强启动子提高表达水平。当需要提高表 达水平时，可选用强启动子。但在某些情况下，由 于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主不 利，可选用诱导型载体，只有经诱导后，蛋白质才 能被表达。
原核表达载体 克隆载体: 克隆载体
通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标 记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。
表达载体: 表达载体:
除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位 点(核糖体结合位点,又称SD序列，它是指mRNA分子中核糖体 结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面3～12个碱基， 该序列与16S rRNA的互补)、转录起始信号、转录信号、翻 译起始密码子(ATG)和终止密码子等一系列调控序列。
非融合型(天然蛋白质） 非融合型(天然蛋白质）原核表达载体
通常天然蛋白表达载体（非融合型表达载 体）都含有一个强的可调控的启动子和一个 有效的核糖体结合位点。 大多数原核基因中都带有一个有效的核糖 体结合位点，对这些带有强核糖体结合位点 的原核基因，只须提供一个启动子； 而对被表达的真核基因(或带有弱核糖体结 合位点的原陔基因)，就必须同时提供一个强 启动子和一个有效的核糖体结合位点。
pET-5a载体图谱（非融合型） 载体图谱（非融合型） 载体图谱
融合型原核表达载体 表达融合蛋白有下列优点： 表达融合蛋白有下列优点 (1)转录和翻译起始从正常的 E. coli 序列 开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白。 (2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳 定。 (3)产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋 白质凝胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从 凝胶上切下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作 为抗原。 (4)有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到 细胞外，这有助于蛋白质的分离和纯化。
选择表达载体应考虑的因素
(1). 所表达的蛋白质是融合蛋白还是天然蛋白。如果是天然 蛋白，必须考虑如何将目的准确地与载体衔接。如果是融 合蛋白，载体是由一系列3种不同阅读框架的载体组成，当 用同一种限制酶切割载体并与目的DNA片段重组时，则可以 保证其中至少有一种融合蛋白的框架与之吻合. (2). 被表达的基因是原核基因还是真核基因。原核基因一般都 带有核糖体结合位点，只虑它是否带有强启动子。对真核 基因除考虑该基因是否带有启动子、核糖体结合位点外， 考虑该基因是否会产生翻译后加工，以后是否需要转到真 核表达系统中表达等。 (3). 表达蛋白是否分泌到体外。如需要分泌，则必须带有信号 肽序列，故应选择带适当序列的载体。
原核表达系统类型
大肠杆菌表达系统 大肠杆菌
遗传背景很清楚，基因操作的方法非常完善，很容易大 规模培养产生大量的目的蛋白质。 但大肠杆菌表达的蛋白质大多不分泌到细胞体外，如 要使蛋白分泌到细胞外，必需使目的基因带有信号肽。信 号肽(signal peptide)又称前导肽(1eader peptide)，这是一种 位于分泌蛋白质或输出蛋白质N端上长约15～30个氨基酸的 序列，可被细胞的蛋白质加工机制所识别，使蛋白质通过 细胞膜被分泌出来。
枯草杆菌表达系统 枯草杆菌
真核表达系统类型
酵母表达系统 酵母 哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物 昆虫杆状病毒表达系统 昆虫杆状病毒 植物细胞表达系统。 植物细胞
真核表达系统类型需要有强启动子、增强子、连接序 列（内含子）、转录起始信号、转录信号、多聚A信号、翻 译起始密码子(ATG)和终止密码子等筛选标记等。
实验十二、表达载体的构建及鉴定 实验十二、
基因工程中使用的表达系统类型
一、基因来源： 基因来源： 原核生物 真核生物 二、原核表达系统 原核表达系统： 1、原核表达系统： 遗传背景清楚，易改造，培养容易，费用 低，蛋白质表达水平高。但在原核中表达后所合 成的蛋白无自我修饰如糖基化等，或因折叠的方 式不正确或折叠效率的低下，最后产生的蛋白质 其生物活性很低。 2、真核表达系统
三种不同阅读框架图例
PinPoint Xa-1 图谱
目的基因的表达产物检测 A．重组载体的构建：将目的DNA片段与表达载体连接，产生 重组载体的构建：
阅读框架对应的融合. B．转化 转化：将重组后pGEMEX-1载体转化E.coli JMl09，然后涂布 转化 于含氨苄青霉素 (100µg/m1)的LB平板上，在37℃下培养过夜。 筛选能在平板上生长的转化子。 C．转化子鉴定 将转化子挑出后，小批量培养，抽提质粒进行 转化子鉴定: 转化子鉴定 酶切鉴定或者PCR鉴定，确证克隆片段确为所需目的片段后， 进行诱导表达。 D ． 诱 导 表 达 ： 将 含 有重 组 质 粒 的 JM109 接 入5ml含 100ug/m1 Amp的LB培养基中培养过夜，第二天取50ul培养液接种到另 一5ml LB(内含100ug/m1Amp)培养基的试管中培养至光密度值 OD600 为0.5左右，加入IPTG终浓度至lmmol/L，继续培养6-12 小时，使基因表达。 表达产物的检测：诱导表达后的细胞经5000g离心后，TE缓冲液 表达产物的检测 悬浮后加入SDS-PAGE上样缓冲液电泳检查或进行Western blot检测。