菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数与大肠菌群数测定 PPT
大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 36℃，48h
分离培养
器材与试剂 初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰 平板培养基
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
涂片
热固定
初染
媒染
脱色
复染
革兰染色法
革兰氏染色阴性
革兰氏染色阳性
复发酵
器材与试剂 培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、 复发酵管
大肠菌群数测定
实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落 1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37℃，24h （4）观察指标：产酸，产气
别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值
MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method） 1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布:
P(x=k)=e-x ×xk/k! x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数 2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为 Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为：
计算方法： （2）有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比>2，选较小值 菌落数之比<2，取平均值 （3）所有稀释度均>300 取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均<30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者
结果单位：CFU/ml（g）
大家应该也有点累了，稍作休息
分区划线法
水中细菌菌落总数和大肠菌群的测定.doc
水中细菌菌落总数和大肠菌群的测定摘要：水是微生物广泛分布的天然环境。
各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。
水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
水中细菌菌落总数可作为判断被检水样被有机物污染程度的指标。
细菌数量越多，则水中有机质含量越高。
本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。
由于水中的细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖。
因此采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基培养出的细菌总数仅是一种近似值。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
本实验采用多管发酵法，它是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初步发酵实验，平板分离和复发酵实验三个部分来测定漓江水中的总大肠菌群数量，试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
关键词：细菌、菌落、大肠菌群前言：水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数中不得超过3个/L，细菌总数不得超过100个/L。
细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(m L)。
它反映的是检样中活菌的数量。
大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
通过这两个实验的好处有：了解和学习水中细菌菌落总数和大肠菌群的检验原理、检验方法、数据处理和报告方法；学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法；学习和掌握测定水中大肠菌群的多管发酵法；了解大肠菌群数量与水质状况的关系,以及它在饮水中的重要性。
食品中细菌菌落总数和大肠菌群的检测
二0一三年一月
概念认识——菌落总数ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱerobic plate count
食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、 培养温度和培养时间等）培养后，所得每 g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
概念认识——大肠菌群coliforms
在一定培养条件下 能发酵乳糖、产酸 产气的需氧和兼性 厌氧革兰氏阴性 无芽孢杆菌
食品微生物学检验 菌落总数测定
解读标准——GB/T 4789.3-2003
食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
为规范食品中大肠菌群指标的检测工作，现公告如下： 现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“MPN/100克或 MPN/100毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大 肠菌群测定》（GB/T4789.3-2003）进行检测；以“MPN/克或 MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”为单位的，适用《食品 卫生微生物学检验大肠菌群计数》（GB/T4789.3-2008）进行 检测。 特此公告。
二○○九年十月二十六日
解读标准
GB 7099-2003 糕点、面包卫生标准
GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验 糖果、糕点、蜜饯检验 GB 4789.1-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则
GB 4789.2-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定
GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
解读标准——GB 7099-2003 糕点、面包卫生标准
解读标准——GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验
糖果、糕点、蜜饯检验
解读标准——GB 4789.1-2010 食品安全国家标准
食品中菌落总数大肠菌群数测定
国际上常见的取样方案
一、国际食品微生物规范委员会取样方案 1、采样原则 - 各类微生物对人的危害程度不同 - 食品经不同条件处理后，危害度变化情况：降 低、未变、增加 2、采样方法 - 三种危害度： 1）老人和婴幼儿 2）可立即食用的食品，在食用前危害基本不变 3）食用前经过加热处理
ICMSF取样方案：分为二级法和三级法 解释四个代号： n：系指一批产品采样个数。 c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的 检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。 m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接 受的数量区别开。 M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量， 表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的 界限。 它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多 少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该 产品的质量而设定的
12.3 大肠菌群测定操作流程 （任务一）
梯度稀释样品
大肠菌群测定操作注意事项
1、检验步序：三步法（乳糖发酵、分离培养、证 实实验），也可称（初发酵、平板分离、复发酵） 2、抑菌剂 3、挑选菌落 4、产气量
大肠菌群测定操作注意事项
5、接种量是指实际接入试管中的、相当于原样品 的量 例如： 稀释度1：10 接种10ml，取液量是10ml，但接 种量就是1ml(g)，即相当于原样品的1ml(g) 6、接种量若是大于１ml的话全部用双料管，等于 或小于１ml用单料管
乳糖胆盐发酵管
配方： 蛋白胨 2 % 猪胆盐（或牛胆盐）0. 5 % 乳糖 1 % 溴甲酚紫酒精液 0 . 06ml pH 7.4
• 双料乳糖胆盐发酵管：除蒸馏水外其他成分加倍
原理 •溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸 性时呈黄色 •如果颜色不变（呈蓝紫色），说 明无产酸的大肠菌群 •如果颜色变黄色，说明可能出现 能分解乳糖产酸的大肠菌群 •胆盐可以抑制G+细菌生长繁殖 分解乳糖产酸产气的大肠菌群， 看杜氏管中的气体
细菌总数和大肠杆菌的测定
高温之所以能杀死微生物，主要是因为微生物细胞的基本组成是蛋白质，蛋白质遇热会凝固变性。
而启动一切生命活动的生物催化剂-酶，其主要成分也是蛋白质，也具有不耐热性。
湿热比干热容易杀死微生物，原因是蛋白质的含水量越多，加热时愈容易凝固，而且湿热所用的水蒸气的传导力与穿透力都比较强，更容易破坏蛋白质。
微生物在其最低生长温度下代谢活动减弱，处于休眠状态，维持生命而不发育。
实验室常用冰箱保存菌种，反复冻融会使细胞收到破坏，微生物死亡。
实验 细菌总数的测定一、测定方法平皿计数法二、方法依据《生活饮用水卫生规范》三、测定范围生活饮用水及其水源水中的细菌总数的测定四、测定原理细菌总数是指水样在一定条件下培养后（培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等）所得1mL水样所含菌落的总数。
按本作业指导书所得结果只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的细菌菌落总数。
五、试剂营养琼脂1、成分A蛋白胨 10gB牛肉膏 3gC氯化钠 5gD琼脂 10～20gE蒸馏水 1000mL2、制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4～7.6，分装于玻璃容器中（如用国产含杂质较多的琼脂时，应先过滤），经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
六、仪器设备1、高压蒸汽灭菌器2、干热灭菌箱3、培养箱36±1℃4、电炉5、天平6、冰箱7、放大镜或菌落计数器8、 pH计或精密pH试纸9、灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等七、分析步骤1、生活饮用水1.1以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。
每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
1.2待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36±1℃培养箱内培养24h，进行菌落计数，即为水样1mL中的细菌总数。
食品中细菌菌落总数及大肠菌群的检测实验报告
实验九食品中细菌菌落总数及大肠菌群的检测[实验目的]1、了解国家规定的食品质量与细菌菌落总数和大肠菌群数量的重要关系。
2、掌握食品细中细菌菌落总数及大肠菌群的检测方法。
[实验原理]菌落总数根据稀释平板技术法检测每mL/g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上,经37℃、24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。
它所反映的是检样中的活菌数，细菌数越多，说明污染程度越大，这项指标可作为判定待测样品被污染的程度。
大肠菌群数是在100mL(g)食品中（或1000 mL水中）大肠菌群最近似值。
它是指肠杆菌科中的４个属，即埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
这一菌群致病力不强，具有共同特点：好氧和兼性厌氧、革兰氏染色阴性反应、无芽孢杆菌、37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气。
大肠菌群在人畜肠道内含量最多，可随排泄物进入水源或污染食品。
国际公认以大肠菌群的存在作为粪便污染指标。
这项指标可判定待测样品有无被粪便污染及污染的程度。
[实验材料]1、检样牛乳（饮料、酱油）2、培养基普通营养琼脂平板、单料乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、EMB平板3、仪器和其他物品恒温箱、水浴锅、无菌培养皿、无菌吸管、无菌盐水瓶（内装225 mL无菌生理盐水）、无菌试管（内装9 mL无菌生理盐水）、灭菌剪刀、镊子等[实验内容]1、细菌菌落总数的测定(1)制备样品及样品稀释取待测样品（牛乳、酱油）一瓶，用点燃的酒精棉球烧灼瓶口，若是塑料瓶则用75%的酒精棉球擦拭灭菌。
在无菌条件下取样25 mL放入内装225 mL生理盐水的瓶中，充分混匀，制成10-1的稀释液。
用1 mL无菌吸管吸取10-1稀释液1mL，沿管壁徐徐注入装有9mL无菌生理盐水的试管中（注意，吸管尖端不要触及管内稀释液），振荡试管，混合均匀，制成10-2的稀释液。
另取1mL无菌吸管，按上述操作方法做成10-3稀释液。
每次稀释，换用一支无菌吸管，共做10-1、10-2、10-3三个稀释度，分别含样品0.1mL，0.01mL，0.001mL。
食品微生物学检验 大肠菌群计数和菌落总数的测定
食品微生物学检验大肠菌群计数和菌落总数的测定摘要：菌落总数和大肠菌群超标是食品产品卫生指标中常见的质量问题,我国的国家标准对绝大多数食品都制订了菌落总数和大肠菌群的指标，并对其数量做了详细的规定。
菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，是影响产品质量问题的常见指标，在对食品进行检测的时候菌落总数以及大肠菌群两项指标容易出现相应的检测问题[1]，为了熟悉和掌握大肠菌群计数和菌落总数测定的方法和技术，本次实验以未经清洗的生菜为实验对象，用MPN计数法对大肠菌群进行计数，用平板倾注的方法培养微生物后观察获得的单菌落来测定菌落总数。
关键词：生菜；大肠菌群 MPN计数法；菌落总数；平板倾注一、前言：食品中菌落总数是指食品样检经过处理，在一定条件下（如培养基成分、培养温度和时间、PH值、需氧性质等）培养后，所得1mL(或1g) 检样中形成菌落的总数。
菌落总数测定通常是用来判定食品被微生物污染的程度及卫生质量，测定结果反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
大肠菌群是一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌群主要来源于人、畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。
食品中大肠菌群数系以每1mL(g) 检样内大肠菌群最可能数（the most probable number,MPN）表示。
[2]二、实验材料与方法（一）实验材料1、实验器材高压灭菌锅恒温培养箱电子天平2、实验材料及试剂未经清洗的生菜无菌生理盐水3、菌落总数测定所用培养基及其配方平板计数琼脂（PCA）培养基胰蛋白胨5.0g 酵母浸膏2.5g 葡萄糖1.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000mL PH7.0±0.2 4、大肠菌群计数所用培养基及其配方4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤胰蛋白胨20.0g 氯化钠5.0g 乳糖5.0g 磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g 月桂基硫酸钠0.1g 蒸馏水1000mL PH6.8±0.24.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤蛋白胨10.0g 乳糖10.0g 牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL1％煌绿水溶液13.3mL 蒸馏水800mL PH7.2±0.1（二）实验方法（1）培养基、生理盐水的配制及灭菌1、生理盐水称取NaCl8g溶于1000mL蒸馏水中,配成0.8%的生理盐水，NaCl溶解完全后，取90ml 分装到250ml带玻璃珠的三角瓶中。
菌落总数及大肠菌群测定 - 副本
固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升 （ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米 （cm2）报告。
-----大-大肠肠菌菌群群
粪便污染指示菌之一
一、大肠菌群的定义
二、大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示的 卫生意义 三、大肠菌群计数方法：
当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明 显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则 每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开 计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不 到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘 2代表全平板的菌落数。
如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘 以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情 况计算出的菌落数按估算值报告。
不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平 板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍 数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（ 有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检 样计数报告的依据。
大肠菌群MPN值
指每1g或1ml食品检样中大肠菌群最可能数。
大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示 的卫生意义：
1.它可作为粪便污染食品的指示菌。 2.它可作为肠道致病菌污染食品可能性的指示菌。
大肠菌群的检测：旧国家标准 GB/T4789.3-2003三步法
乳糖发酵试验 分离培养 证实试验
大 肠 菌 群 检 测 程 序
GB/T4789.3-2003版食品卫生微生物学检验 大 肠菌群测定
大肠大菌肠群菌的群定义
具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。 指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需 氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢的杆菌。 包括埃希氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属和克雷 伯氏菌属等的一些菌种。
微生物检测注意事项——大肠菌群和菌落总数
分析与检测T logy科技30 食品安全导刊 2018年9月我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌3项，其中致病菌一般指“肠道致病菌和致病性球菌”，主要包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、致病性链球菌4种。
此外，鉴于很多霉菌能够产生毒素，引起消费者食物中毒及其他疾病，故特定产品也应对产毒霉菌进行检验。
大肠菌群检测注意事项方法选择大肠菌群（C o l i f o r m b a c t e r i a）是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界中广泛存在。
调查研究表明，大肠菌群多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方。
人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因之一，粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则大肠菌群的其他菌株较多。
大肠菌群检测的关键在于方法的选用，食品中大肠菌群检测有两种表示方法，其一是以100m L(g)检样内大肠菌群最大可能数（M P N）表示，检测方法需使用G B/T4789.3-2003《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》；其二以每g（m L）样品中大肠菌群的MP N值表示，检测方法需使用G B4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。
G B/T4789.3-2003《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》虽然被后更新的方法代替，但卫生部关于规范食品中大肠菌群指标的检测工作公告（2009年第16号）明确指出，为规范食品中大肠菌群指标的检测工作公告如下：现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“M P N/100克或M P N/100毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大微生物检测注意事项——大肠菌群和菌落总数□ 董玲 上海英斯贝克商品检验有限公司大肠菌群（Coliform bacteria）是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
菌落总数和大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定方法菌落总数和大肠菌群的测定方法如下：一、菌落总数的测定方法菌落总数是指食品样品在一定条件下培养后，得到的1克或1毫升样品中所含的活菌个数。
它反映了食品在生产过程中的卫生状况，是判定食品质量的重要指标之一。
1.样品处理：根据样品是固体或液体，采用不同的处理方法。
对于固体样品，先进行均质化处理，将其粉碎并混匀。
对于液体样品，直接进行摇匀。
2.稀释：根据样品的污染程度，将样品稀释至适当浓度。
通常采用系列稀释的方法，即先将样品稀释10倍，再稀释10倍，直到适合接种。
3.接种：将稀释后的样品接种到培养基上，可以采用倾注法或涂布法。
倾注法是将稀释后的样品倒入培养皿中，摇匀后倾注培养基；涂布法是将稀释后的样品均匀涂布在培养基表面。
4.培养：将接种后的培养皿放在适宜的温度和湿度下培养，一般培养时间为24-48小时。
5.计数：观察培养后的菌落数量，并计算每克或每毫升样品中的菌落总数。
二、大肠菌群的测定方法大肠菌群是指一群能在30℃-37℃的伊红美蓝琼脂平板上生长并产生深紫色素的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
它主要来源于肠道，是人类肠道中的主要菌群之一。
大肠菌群的测定对于食品卫生质量的控制具有重要意义。
1.样品处理：与菌落总数测定类似，将固体或液体样品进行均质化处理和稀释。
2.接种：将稀释后的样品接种到伊红美蓝琼脂平板上，可以采用倾注法或涂布法。
3.培养：将接种后的平板放在适宜的温度和湿度下培养，一般培养时间为24-48小时。
在培养过程中，大肠菌群会在伊红美蓝琼脂平板上形成深紫色的菌落。
4.验证试验：为了确保结果的准确性，需要进行验证试验。
可以采用革兰氏染色法对可疑菌落进行染色，以便确认是否为大肠菌群。
5.计数：观察培养后的菌落数量，并计算每克或每毫升样品中的大肠菌群数。
需要注意的是，上述方法仅供参考，具体操作步骤可能会因不同的检测机构或标准而有所差异。
在实际操作中，应根据具体情况进行调整和修改。
另外，为了保证检测结果的准确性和可靠性，需要注意实验室的卫生条件、仪器的校准、试剂的质量以及操作人员的专业素质等方面的因素。
食品中细菌总数及大肠菌群值的检测
菌落总数测定——卫生学意义
• 判定食品被细菌污染的 程度及卫生质量。
菌落总数测定流程(倾注平板法)
检样1mL+9ml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）
35 ℃ ，48 ± 2h
检测程序
初步发酵试验（产酸产气否？） 平板分离（伊红美蓝鉴别培养基） 革兰氏染色（是否G-无芽孢杆菌？） 复发酵试验（可疑菌落是否产气菌？）
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
• 伊红和美蓝可抑制G+生长； • 不发酵乳糖的细菌菌落无色
透明；
菌名
大肠埃希氏菌
• 能发酵乳糖，产酸力弱，菌 肺炎克雷伯氏菌
卫生学意义
• 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪 便污染指标。
• 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病 菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。 大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康 危害性的大小。
• 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预 示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指 示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测 作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
一、目的要求
1.了解食品卫生微生物学的重要性及其原理 2.学会食品中细菌菌落总数的测定方法和平
板活菌计数法 3.学会食品中大肠菌群数的测定方法
二、基本原理
1、食品卫生微生物学指标包括细菌菌落总数、大肠 菌群数和致病菌数量。前两者在日常检测中是必检项 目。
大肠杆菌菌落总数检测步骤
大肠杆菌及菌落总数检测方法为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。
下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。
一、大肠杆菌：1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例）双料试管配制A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。
单料试管配制A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。
2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。
3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。
4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后及25g样品混合均匀。
（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合）B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。
C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。
D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。
E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。
F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。
G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml吸管取样品液体分别注入双料试管中H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。
I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。
J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。
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菌落总数和大肠菌群测定（固体样品）
药品：
1、平板计数琼脂
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）
3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）
4、氯化钠
设备材料：
烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃
棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。
一、准备工作
（指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加）
1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定
将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加
200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定
（a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。
（b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。
（c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释
将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸
或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。
4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。
5、准备8个培养皿，用布包扎好。
6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。
7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。
二、使用灭菌锅灭菌
1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。
2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。
3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。
4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。
三、无菌操作
进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
10分钟后进入无菌室。
（无菌室缓冲间应放有：白色衣服、帽子、鞋子和口罩等）。
1、待灭菌锅自然冷却后，取出6件灭菌好的物品，留下平板计数琼脂培养基（PCA）在灭菌锅里待用（该液体凉后会凝固，应保持温度50 C 左右）。
2、用75%的酒精棉球消毒手和操作台面。
3、点着酒精灯，准备接种，接种过程在酒精灯周围10cm范围进行。
4、无菌操作
A、拿出第一瓶生理盐水，用10毫升的吸管分别吸9ml生理盐水加入2个空的试管中，再吸1ml的生理盐水，放入1个培养皿内（这是生理盐水空白试验用的）。
（10ml吸管使用3次，不再使用）
B、准备制样，用75%的酒精棉球擦拭样品包装准备开口处，拿出第二瓶生理盐水，放在电子称上，去皮，称取或量取25g （mL）样品，放入225ml生理盐水中充分摇匀，制成稀释10倍的检测样品，即10-1 溶液。
（注意摇匀）（见书中最后1页图）
C、取出第一个5ml的吸管，吸取5ml的“检测样品10-1溶液”，分别放入2个培养皿和3个试管中，各放1ml，再吸取1ml “检测样品10-1溶液”放入9ml生理盐水的试管中，制成稀释100倍的检测样品，即10-2溶液。
（注意摇匀）
D、取出第二个5ml的吸管，吸取5ml的“检测样品10-2溶液”，分
别放入2个培养皿和3个试管中，各放1ml，再吸取1ml放入9ml生理盐水的试管中，形成稀释1000倍的检测样品，即10-3溶液。
（注意摇匀）
E、取出第三个5ml的吸管，吸取5ml的“检测样品10-3溶液”，分
别放入2个培养皿和3个试管中，各放1ml。
（注意摇匀）（详见书中最
后1页图）。
F、取出灭菌锅内的三角瓶（平板计数琼脂培养基（PCA）），用手感觉瓶子热度（以45-50度为宜，过热或过低均不行），分别倒入8个培养皿内15-20ml平板计数培养基，注意倒入时仅拿开一点点盖子，并在酒精灯边上操作，左右摇匀，待平板计数培养基凝固后，倒置培养皿。
其中有1个培养皿是用于做平板计数培养基空白试验的。
四、培养
要求培养箱温度在（36士1）度，培养时间在（48士2）小时，将8
个培养皿（倒置）和9个试管均放入培养箱内进行培养。
五、检查结果、计算
（1）计算大肠菌群：
培养24h取出9个试管，观察是否有产酸产气现象，浑浊即为产酸、
倒气管悬空即为产气，有几个试管产酸产气，即准备做几个煌绿乳糖胆盐
肉汤试管，煌绿和月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，做法同样！即：看药品使用说进行配制，称量--煮沸溶解--分装--加入倒气管--排气--塞硅胶塞--火菌备用。
1类结果：均无产酸产气现象，继续培养24h,
检验值是：＜30MPN/100g 。
2类结果：煌绿试管有产酸产气现象，查看各稀释度产酸产气个数，对照书中“倒数第2页”表格，找出结果后乘以100,再保留2位有效数字（例如：4.3X102）
（2）计算菌落总数：
取出8个培养皿，逐一观察，不论菌落大小，连在一起的计算为1
个，如果菌落比较多，可以分成4个区来计数。
1类结果：空白试验的2个培养皿，发现菌落，则环境污染了，本
次试验失败。
2类结果：对照书“第3页-第4页”有6种可能出现的情况，对照对应情况进行计算。
注意：菌落数适宜计数范围是：30--300个/培养皿。
菌落总数检验值：保留两位有效数，例如： 6.1 X102，即为610 CFU/ml。