遗传学原生质体培养及融合配色

细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
第一节 原生质体培养
一、原生质体培养的发展历史
要进行原生质体培养，首先必须分离原生质体， 即去除细胞壁，得到完整的裸露细胞。
植物原生质体培养研究中几个重要的成就： ➢ 1880年，Hanstein首次提出原生质体(protoplast)
➢ 小原生质体(miniprotoplast)：也称核质体 (nuclearplast)，具备完整细胞核，但只含有部分 细胞质。
➢ 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条 染色体的情况。
➢ 胞质体（cytoplast）：不含细胞核，只有细胞质。
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。 是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体， 通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使 其再生成为杂种植株的技术。
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
率极低，无法进行培养和再生。
甜菜 洋葱 萝卜 黄瓜
➢ 1960年，英国诺丁汉大学的Cocking教授首次使 用纤维素酶酶解法处理番茄的幼根，获得了大量 具有高度活性的原生质体。
➢ 1968年后，由于纤维素酶、离析酶投入了市场， 使原生质体分离技术日益发展和成熟，原生质体 培养也开始成为热门研究领域。
从根霉或黑曲霉中提取，能降解中胶层，使细 胞从组织中释放出来。
常用的果胶酶商品制剂：
Pectinase
Sigma
Macerozyme R-10 Japan
Pectolyase Y-23 Japan (价格昂贵)
2）纤维素酶类
从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂， 其作用是降解细胞壁中的纤维素，使原生质 体释放出来。常用的商品酶制剂：
2）盐溶液系统 主要使用：KCl、MgSO4•7H2O
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生 质体的稳定性，保持原生质体的活性，促进细胞壁 再生及细胞分裂等。
据1993统计，已有49个科，146个属的 320多种植物，都可经原生质体培养得到 再生植株。虽然大体上仍以农作物和经济 作物为主，但已从一年植物生向多年生植 物、从草本植物向木本植物、从高等植物 向低等植物扩展。
二、原生质体培养的意义
1、为细胞融合提供直接方法
2、为遗传转化提供新的途径
原生质体没有细胞壁，可以直接吸收 外源DNA，或通过电击穿孔法、PEG法等 方法，将基因导入原生质体，实现遗传转 化。
22h 3-5h
3、酶液的渗透压
原生质体的一个基本属性是渗透破 损性。因此，酶液、原生质体洗涤液及 培养基中都要加入适量的渗透压稳定剂。 常用的稳定剂分为两类：
1）糖溶液系统Biblioteka Baidu
2）盐溶液系统
1）糖溶液系统 多用甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，
目前广泛使用的是甘露醇和山梨醇。蔗糖因 对原生质体培养不利，很少使用。
EA-867
中科院上海植生所
Cellulase Onzuka R-10 Japan
Cellulase Onzuka RS Japan（价格昂贵）
Meicelase P
Japan
Cellulase
USA
Driselase（崩溃酶，具多种活性） Japan
3）半纤维素酶
用于降解细胞壁中的半纤维 素，主要商品制剂有：
Plants
Pre-treatment enzymolysis
Suspension cells
Purification Vigour test
Cuture and regeneration
三、原生质体的分离
1、取材：材料的类别对原生质体培养很重要
可采用离体培养植株、田间或温室植 株，利用其叶片、叶柄、茎段等均可分离原 生质体，但一定要选用幼嫩部分。
也可以通过细胞器的转移，使物种获 得相应的性状。
5、 用于理论研究
如细胞壁的生物合成、原生质膜的结 构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染 机理等。
原生质体研究已在细胞生物学、生 物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒 学、育种学等领域得到广泛应用。
6、用于种质资源保存
A scheme of plant protoplast
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
Hemicellulase H-2125 Sigma
Rhozyme HP-150
USA
4）蜗牛酶：分离孢粉素、胼胝质
各公司生产的酶的效果不尽 相同，使用时应予以注意。必须 控制好浓度、温度和处理时间， 例如：
Cellulase Onzuka R-10 Japan Cellulase Onzuka RS Japan （两种纤维素酶的活性大约差10倍）
近年来，为了提高原生质体再生的频 率，最常用的是以下几类材料：
➢ 无菌试管苗的叶片 ➢ 上胚轴和子叶 ➢ 处于对数生长期的细胞悬浮系
2、酶的种类和作用
原生质体分离的效果主要取决于酶的 种类和浓度。
目前主要使用的酶有：
果胶酶类 纤维素酶类 半纤维素酶类和崩溃酶等 有时还会使用蜗牛酶。
1）果胶酶类
3、利用原生质体培养中广泛发生的变异， 选育新品种。
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可 以进行亚细胞水平的操作研究。如叶绿体、 线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄 取细胞器后进行培养，获得再生植株，根 据再生植株的表现，即可进行遗传分析， 研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
➢ 1971年，Takebe 等首次将烟草叶肉原生质体培 养成完整植株。
➢ 1985年，Fujimura 等获得第一例禾谷类作物，即 水稻原生质体的再生植株。
➢ 1986年，Spangenberg 等由甘蓝型油菜的单个 原生质体培养得到再生植株。（白菜型、芥菜型和甘蓝型 ）
BACK
随后，其它植物上也逐渐有原生质体再 生植株成功的报道，包括粮食作物、油料 作物、经济作物和一些药用植物。