核酮糖1,5-二磷酸羧化酶羧化活性的测定

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶羧化活性的测定

一、实验原理

核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶是光合作用中一个关键酶，它在Calvin 循环中催化中催化CO2的固定，生成2分子的3-磷酸甘油酸(3-PGA)，同时它是一个双功能酶，又能催化将O2加在核桐糖-1,5-二磷酸(RuBP)上生成1分子的磷酸乙醇酸和1分子的PGA ，这两个反应的速率由O2和CO2的浓度调节[1]。分光光度酶偶联法是根据RuBP 羧化酶催化RuBP 与CO2反应产生的磷酸甘油酸与NADH 的氧化作用相偶联的原理设计的。当加入ATP 及NADH 后，NADH 在PGK 和GAPDH 的催化下氧化为NAD+，每羧化l mol RuBP 有2 mo1 NADH 被氧化，根据在波长340 nm 处光密度的变化，可测知NADH 的数量，从而算出同化CO2的值。Rubisco 羧化活性的测定可用酶偶联法将3-PGA 的变化转换为NADH 的变化来测定。

RuBP+CO2+H2O −−−−→−+2

Mg RuBPC ，2(3-PGA)

3-PGA+ATP −−

−−−→−－磷酸甘油激酶

31,3-二磷酸甘油酸+ADP 1,3-二磷酸甘油酸+NADH −−−−−−→−－磷酸脱氢酶

甘油醛－33-磷酸甘油醛

+NAD++PO43+ 二、实验仪器及材料 2.1实验仪器

研钵、分光光度计、秒表、比色杯、冷冻离心机 2.2实验材料

小麦叶片 三、实验步骤

1.核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶活性额测定

1.1称取0.1 g 新鲜叶片，放于已经预冷的研钵中。

1.2加入1 mL ，4℃提取缓冲液（50 mM Tricine-NaOH pH 7.9， 0.1% PVP-40, 5 mM MgCl2）冰上研磨，（缓冲液分3次加入，第一次0.5ml ，剩下两次分别0.25ml 将研钵冲洗干净），将研好的样品装入1.5ml 的离心管中，放于冰盒中。12000 g ，4℃，离心10 min 。取上清液备用。

1.3 按下表顺序依次加入630 uL 反应液，然后再加10 mmol/L RuBP ，100 mmol/L ATP ，100 mmol/L 磷酸肌酸，40 U/ml 肌酸磷酸激酶，80 U/mL 3-磷酸甘油醛脱氢酶，80 U/mL 3-磷酸甘油酸激酶各50 uL ，将分光光度计波长调至340 nm 调零。最后加20 uL 酶提取液，50 uL 4 mmol/L NADH 启动反应，立即每隔5s 测定吸光度。

1.4 酶活力计算公式

RuBPC

酶

活

力

[umol

CO 2

min -1mg -1

Chl(a+b)]=Fw

)b a (Chl t V d 2V A ⨯+⨯∆⨯⨯ξ⨯⨯⨯∆反

ΔA 为1 min 内吸光度的变化值， V 反 为反应总体积1 mL , d 为光径cm ，

ξ为NADH 的消光系数 6.22， V 为加样体积0.02 mL ， Δt 为时间1 min,

Chl(a+b)为叶绿素a 与b 的含量之和mg/g ， Fw 为叶片鲜重g 。

2 叶绿素含量的测定

2.1 称取0.1g 新鲜叶片，加入少量纯的丙酮研磨，棕色容量瓶定容至10mL 。 2.2置于黑暗处过滤备用。

2.3以纯丙酮做参比，测定663/645nm 处的吸光值。 2.4叶绿素含量计算公式。 Ca=12.72A 663-2.59A 645 Cb=22.88A 645-4.67A 663

C T =Ca+Cb 叶绿素含量=

样品鲜重

提取液体积

）色素的浓度（ T C （mg/g ）

四、实验结果

1叶绿素吸光度测定结果

2.叶绿素含量测定结果

3.酶活力吸光度测定结果

2 酶活力测定结果

结果表明，小麦RuBPC酶活力比玉米RuBPC酶活力大，这是因为C4植物固定CO2的酶为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)，与C3作物中RuBPCase相比，PEPCase对CO2的亲和力高。C4植物是从C3植物进化而来的一种高光效种类。与C3植物相比，它具有在高光强，高温及低CO2浓度下，保持高光效的能力。

五、注意事项

1、RuBP很不稳定，特别是在碱性环境下，因而要使用不超过2~4周，在pH 5~6条件下，以10 mmol/L浓度保存于-20℃冰箱中。

2、反应液和比色杯保持温度在30℃左右，冬天可在分光光度计样品室内放入装有温水的瓶子，保温。

3、在比色杯内添加试剂和样液时，必须要匀速。