植物原生质体的分离及融合

植物原生质体的分离及融合

生93沈睿2009012372同组：古梦婷

实验日期：2011年11月2日

一．实验原理

1.原生质体分离

原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。

2.原生质体融和

诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。本实验用PEG诱导原生质体融和。

PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。

PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。二．实验步骤

1.原生质体的制备

（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。

（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。

（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。

（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。

（5）配平后，在700rpm下离心5min，弃去上清液；加洗涤液约3ml，吹打均匀，700rpm、5min重复离心一次，彻底去除酶液。

（6）加200μl洗涤液，悬浮原生质体。

（7）镜检原生质形态和浓度，看看是否有碎片；如碎片较多，利用蔗糖溶液漂浮1-2次。（8）蔗糖漂浮方法：

取部分原生质体悬浮液，加入洗涤液定容至1ml。用注射器吸取20%蔗糖溶液，装上长针头后小心插入盛有原生质体悬浊液的离心管底部，缓缓、轻柔地将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。配平后在700rpm下离心5min。用装有长针头的注射器小心吹吸底部沉淀，连同底部碎片一起将底层蔗糖溶液吸出，再小心除去上清液，得到纯净完整的原生质体。

2.PEG融和

（1）取一干净、干燥的小平皿，向其中加入一滴原生质体悬液，静置10min。

（2）缓缓加一滴PEG溶液，转动平皿，使其混匀，静置10min，观察原生质体聚集现象。（3）逐滴滴加高钙高pH值洗液，使其混匀，观察聚集细胞的融合过程。

三．实验结果与分析

1.细胞融合过程

在静置原生质体悬液后，加了一滴PEG溶液，静置后在倒置显微镜下观察（这阶段未进行拍照），只有个别的细胞靠在一起，而且没有融合的迹象。之后加了一滴高钙高pH值洗液，有较多细胞靠在一起，且在接触面出现融合迹象。但是并没有发现处在融合中期的细胞，于是又滴加了一滴高钙高pH值洗液，之后观察，看到一些细胞已经完全融合，一些细胞仍处在接触阶段，但还是未观察到处在融合中期的细胞。之后又加过高钙高pH值洗液，但始终没有观察到融合中期的细胞。以下展示了一些细胞融合的照片来演示融合的过程。

图1细胞接触图（10×20）

上图在滴过PEG溶液和高钙高pH值洗液后拍摄。原生质体相互接触，可能是由于细胞在溶液中自由悬浮而相触，也可能是在PEG的作用下靠在一起。多数原因为后者，因为可以发现图中两个原生质体的接触面已经是平的了，在自然情况下，应以圆弧相切，所以判断有分子间的作用力使细胞膜相贴拢。

图2细胞接触图2（10×20）

进一步地，原生质体的接触面开始变得不如其他部位的膜平整，说明接触面细胞膜已经

起了反应，可能是两个细胞的接触面的磷脂双分子层开始从内部解离并互相结合。

图3细胞融合图（10×20）

图3中的细胞就其大小而言和单个的原生质体差不多，约为55μm，但是很明显可以看出细胞膜上的裂纹（或浅沟），推断它可能是三个较小的原生质体融合而成的一个细胞。这个细胞已经十分接近完全形态，只要它进一步把细胞膜调整挪动得更为平整即可。

图4细胞融合图2（10×20）

上图为两个正常大小的原生质体融合的结果，虽然接触界面的膜已经消去了大部分，但还是可以看到椭圆体的中间有融合时的痕迹。它也不是完全体，在膜均匀分布后应该会成为球形。

在追踪原生质体融合的过程时，并没有成功地看到并拍到原生质体融合的过程，可能存在以下几个原因。其一，可能是滴加的高钙高pH值洗液，从第一滴到第二滴这个跨度已经很大（因为本身滴在平皿上原生质体悬液也只有3-4滴），在这个跃变中，一些相接触的细胞可能失去了活性，而停留在接触的阶段，另一些则在Ca2+的推动下迅速完成融合过程，所以就出现中间阶段没被观测到的结果。另一个可能原因是我们组悬液中，原生质体含量不是很高（单位体积内个数不多），所以降低了捕捉到原生质体融合中期的概率。

2.实验组与对照组

只加PEG溶液的原生质体悬液中基本观测不到细胞的融合现象，只加高钙高pH值洗液的对照实验漏做了，不过根据理论推断，也观察不到细胞融合。

四．思考题

1.原生质体制备和融合过程中各种试剂的渗透压？