第二章 工业微生物产生菌的分离筛选
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
PPT 工业微生物的分离与筛选.
液体培养基常用组分表
放线菌
细菌
霉菌
植物病原菌
碳源：葡萄糖、淀粉、 葡萄糖、柠檬 乳糖、葡萄 葡萄糖、蔗糖
糊精、蔗糖、麦芽糖 酸钠
糖、蔗糖
氮源：大豆粉、蛋白 肉汤、蛋白胨、玉米浆、蛋 蛋白胨
胨、牛肉膏、玉米浆、 豆饼粉、酵母 白胨
取细长吸液管，从菌群中吸取个体原生动物或藻类
要求：熟练的操作技术
第四节 有用微生物的筛选
筛选有用微生物是工业生产过程的第一步。 筛选：从自然界某些含有菌群的材料中，用特定的
操作程序分离并发现有用的微生物。
一 供筛选分离样品（采样）的来源 二 初筛 三 复筛 四 抗菌谱的测定
一 供筛选分离样品（采样）的来源
诺卡氏菌、游动放线菌、链孢囊菌、 糖多孢菌。不易形成孢子。少见。
常规培养基不能分离。需对不同来 源的样品做预处理。
如分离游动放线菌：
将混浊土壤水样倾入培养皿 中，后接入花粉进行培养。或采 用加温处理。
链霉菌
放线菌产生的主要抗生素 稀有放线菌
氨基糖苷类 氯霉素 链霉素 环丝氨酸 林可霉素 新生霉素
小单胞菌
1 自然资源分离筛选
土壤采样分离。
最理想是山野、农田、沼泽、湖泊、海洋
考虑不同民俗、动植物生态。
2 已有菌株
包括保藏的菌株。变异处理得到新的菌株。
二 初筛
初筛 一次或多次从现有菌群中把多数无用的 微生物淘汰，把少量有用的微生物筛选 出来。
（一）目的：得到具有潜在应用价值的目的微生物。
（二） 要求：
快速——有预测或预见 敏捷——迅速处理好众多的样品。 经济——得到有广泛目标的有用微生物。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种的分离与筛选来源：青岛海博一、微生物工业对菌种的要求一、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备;其中生产菌种的性能是最重要的因素;二、微生物工业对菌种的要求是：1菌株高产,在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;2在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;3生长繁殖能力强,较强的生长速率,产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;4能够高效地将原理转化为产品;5能利用广泛的原材料,并对发酵原料成分的波动敏感性小;6对需要添加的前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;7在发酵过程中产生的泡沫要少;8具有抗噬菌体的能力；9遗传稳定性,二、工业用微生物菌种的来源及选育一微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：1是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；2从大自然中采集样品分离；3从一些发酵制品中分离筛选目的菌株;当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组的定向育种;二微生物工业菌种的分离1、野生菌株的分离、筛选过程1新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节：以温度适中,雨量不多的秋初为好;采土方式：在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考;为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离;②标本预处理④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落;⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种;还要对菌种进行发酵性能测定,⑥毒性试验：据有的国家规定,微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外,其他微生物作为食用,均需通过两年以上的毒性试验;2、菌种的分离方法1施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同,如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等,人为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物生长,而不利于其他种类微生物的生存,以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的;如可以控制培养时的氧,可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度,可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH,可将嗜酸、嗜碱微生物分离等;在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性;如在分离放线菌和细菌时,可加入抗真菌抗生素；分离真菌时,可加入抗细菌药物; 2随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用,因此常采用随机分离方法分离;A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法;实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌,传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌;Ｂ、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株;原理是利用DNA的损伤,微生物发生突变;B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下,当DNA损伤时,诱发λ阻遏物CI分解,PL启动子启动lacZ基因转录,测定表达的ß-半乳糖苷酶活性,来检测药物的存在;B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时,可活化yecA蛋白,进而分解噬菌体的阻遏蛋白,再引起sifA基因启动lacZ基因转录,测定表达的ß-半乳糖苷酶活性,来检测药物的存在;Ｃ、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例,介绍筛选方法;首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物如亚胺环己酮的分离培养基中生长,然后采用影印法,将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中,培养2-3天后,用紫外线杀司长好的菌落,再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液,培养16小时后,被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈;3目的微生物分离A、根据形态筛选突变株B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等;①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基混浊;能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈,圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力;该法在分离水解酶产生菌时采用较多,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈;在分离某种产生有机酸的菌株时,也通常采用透明圈法进行初筛;在选择性培养基中加入碳酸钙,使平板成混状,将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养,由于产生菌能够把菌落周围的碳酸钙水解,形成清晰的透明圈,可以轻易地鉴别出来;分离乳酸产生菌时,由于乳酸是一种较强的有机酸,因此,在培养基中加入的碳酸钙不仅有鉴别作用,还有酸中和作用;②变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌,可在底物平板中加入指示剂或显色剂,使所需微生物能被快速鉴别出来;如筛选果胶酶产生菌时,用含%果胶为惟一碳源的培养基平板,对含微生物样品进行分离,待菌落长成后,加入%刚果红溶液染色4h,具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈;在分离谷氨酸产生菌时,可在培养基中加入溴百里酚蓝,它是一种酸碱指示剂,变色范围在～,当pH在以下时为黄色,以上为蓝色;若平板上出现产酸菌,其菌落周围会变成黄色,可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌;③生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌;工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株;将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养,若某菌株能合成平板所需的营养物,在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈;如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌如与不含嘌呤的琼脂混合倒平板,在其上涂布含菌样品保温培养,周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌;④抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选,工具菌采用抗生素的敏感菌;若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质,如抗生素等,便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈,很容易被鉴别出来;实验十从自然界中分离筛选微生物菌种1 目的1学习并掌握优良曲霉菌的分离原理和方法;2学习工掌握酸乳中乳酸菌的分离原理和方法;2 原理从自然界中分离筛选微生物菌种,是我们获得优良新菌种最基本、最主要的方法,因此,食品工业菌种的分离筛选是一项重要的、长期而繁重的工作;自然界存在着各种各样的微生物,尤其是土壤中微生物种类齐全,是微生物的大本营;因此可以从土壤中分离到几乎所有微生物;另外,不同的自然界环境中生存的微生物优势菌种也不同;各种食品、农副产品等营养组成不同,从中可以分离出不同的微生物;食品工业菌种常用的分离源有被污染的生产或科研菌种、生产中长期使用的菌种、发酵食品用菌种、动物肠道菌群、经各种育种方法处理过的微生物材料和自然界菌种样品;自然界的微生物是混杂生存的,要从中分理出一种微生物,不仅需要考虑分离源应含有较多数量的目的菌,还要在分离操作中使之与其他菌种相互分开;对于样品中含量较低的菌处,要针对其生物学特点合理设计分离方法,如富集培养、选择培养、利用其特殊的生理反应产生特定的生长现象等,以便于从大量杂菌中选出目的菌种;从混杂群体中分离特定微生物的常用方法有：控制分离培养基的营养成分、控制培养基的pH值、添加抑制剂、控制培养温度、控制空气条件、对样品进行特殊处理等;常用的纯种分离方法有平板划线分离法、简单平板分离法、稀释分离、涂布分离法、毛细管分离法、显微操作单细胞分离法等;本实验将采用稀释法和涂布法对目的微生物进行分离筛选;优良曲霉菌的分离采用透明圈法,即先用淀粉琼脂培养基培养样品,由于糖化酶的作用,长出的菌落周围的淀粉被水解,遇碘后呈无色透明圈而平板的其他处呈蓝色;一般来讲,透明圈的直径越大,该菌的糖化力越强;可根据透明圈的大小筛选出糖化力强的菌株;酸乳中乳酸菌的分离采用溴甲酚绿BCG牛乳营养琼脂平板分离法;溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色,在碱性环境中呈蓝色;在分离培养基中加处溴酚绿指示剂后呈蓝绿色,乳酸菌在该培养基中生长并分解乳糖,产生乳酸,使菌落呈黄色,菌落周围的培养基也变为黄色;乳酸可用纸上层析法鉴别;3材料样品黑曲霉种曲、酸奶;器具及其他用品平皿、三角瓶、涂布器、试管、玻璃珠、纱布;培养基及试剂2%淀粉察氏培养基、BCG牛乳培养基、L碘液、10%牛乳培养基、无菌生理盐水;4 流程优良糖化酶菌株的分离与筛选融化培养基→倒平板→打散孢子团粒→梯度稀释→涂布平板→培养观察→滴加碘液→挑菌落→接种→培养→糖化酶活力测定→菌种保存酸乳制品中的乳酸菌的分离制培养基→倒平板→梯度稀释→涂布平板→培养观察→挑菌落→接牛乳管→培养观察→传代培养→挑选凝乳管→乳酸测定→菌种保存5 步骤优良糖化酶菌株的分离与筛选1融化淀粉察氏培养基,稍冷后倒平板与斜面数个;2取种曲少许,加入10mL带玻璃球的无菌生理盐水的三角瓶中,用力振荡打散孢子团粒,使之形成均匀的孢子悬浮粒;然后将其用无菌纱布过滤于无菌试管中;3将上述滤液以10倍稀释法知释至10-7,取后3个稀释度的稀释液各,于淀粉察氏培养基平板上用无菌涂布器分别依次涂布2至3个皿,30℃培养1~2d;5性能测定：测定各菌落的糖化酶活力;酸乳制品中的乳酸菌的分离1制备BCG牛乳营养琼脂培养基;①称取脱脂奶粉10g,溶于50mL水中,加入%溴甲酚绿酒精溶液,压力下灭菌20min;②另取琼脂2g,溶于50mL水中,加酵母膏1g,溶解后调pH值至,压力下灭菌20min;③趁热将上述两液以无菌操作混合均匀,倒平板6个,待凝固后,置37℃培养24h,若无杂菌生长,即可使用;2将样品以10倍稀释法稀释至10-7,取其中10-7、10-6 2个稀释度的稀释液各~,分别置于上述各营养平板上,用无菌涂布器依次涂布2至3个皿,置43℃培养48h,如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基亦为黄色者初步定为乳酸菌;3将典型菌落转至脱脂乳发酵管,43℃培养8~24h,若牛乳管凝固,无气泡,呈酸性,镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色呈阳性,则将其连续传代若干次,43℃培养,挑选出在3~4h能凝固的乳管,保存备用;4乳酸菌的鉴定及生物量的测定;6 结果1描述黑曲霉分离株的形态特征及其分生孢子头的生态;2绘制所分离的乳酸菌形态图,并记录结果;7 思考题1为什么溶解样品的瓶内要加入玻璃珠2说明用透明圈直径与菌株淀粉酶产量有何关系3哪些情况能够引起凝乳。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种得分离与筛选来源:青岛海博一、微生物工业对菌种得要求(一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。
其中生产菌种得性能就是最重要得因素。
(二)、微生物工业对菌种得要求就是:(１)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力;(２)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物;(3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力;(4)能够高效地将原理转化为产品;(５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小;(６)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;(7)在发酵过程中产生得泡沫要少;(8)具有抗噬菌体得能力;(9)遗传稳定性,二、工业用微生物菌种得来源及选育(一)微生物菌种得来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选:(1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;(２)从大自然中采集样品分离;(3)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株、当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。
(二)微生物工业菌种得分离1、野生菌株得分离、筛选过程(１)新菌种分离与筛选得步骤菌种分离得流程如下:标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—1５cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。
为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离、②标本预处理④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落、⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。
--第二章工业菌种的活化及分离筛选
从自然界分离的菌种
研发部
诱变育种 扩大培养
基因工程 生产用菌种
生产车间
原料
接种
发酵罐
灭菌
发酵条件控制
培养基配置
提取车间
分离 提纯
微生物菌体
代谢产物
原料车间
产品
销售部
一、工业菌种的要求
菌种不是致病菌 能在廉价原料制成的培养基上生长，且高效合成产物
遗传性能要相对稳定，不易变异退化 具有抗噬菌体及杂菌污染能力强
发酵工程及设备 Fermentation Engineering
and Equipment
第一章 工业菌种的来源
第一节 工业菌种的活化及分离筛选
内容速览
1.1生产菌种的 要求
1.2生产菌种的 活化
1.3生产菌种的 分离与筛选
发酵产品
以下产品是发酵产品吗？
工程菌 构建
胰岛素
Figure 1. Idealized biorefinery concept. (Image courtesy of Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA.)
• IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心
• ID 中国医学科学院皮肤病研究所
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
• IV 中国医学科学院病毒研究所
CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
• CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
• GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心
链霉菌属 链霉菌属 诺卡氏菌
花粉
土壤
第二章 工业生产菌种筛选
将 试 管 于 震 荡 机 上 ， 使 菌 液 混 合 均 匀
取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL， 加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。
从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液， 臵入准备好的无菌琼脂内。
将三角玻璃棒浸于酒精中
将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）
二、诱变育种
• 用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再 从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学 实验用。 • 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率 并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10 左右。 • 以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提 高菌种产量、性能的主要手段。
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的 沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化 合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如 一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以 是植物，腐败物品，某些水域等。
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10-15g，盛入清 洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采 样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使 土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品 逐步分批寄回，以便及时分离。
自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导 致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种的【2 】分别与筛选起源：青岛海博一.微生物工业对菌种的请求(一).微生物工业的临盆程度由三个要素决议：临盆菌种的机能.发酵及提纯工艺前提.临盆装备.个中临盆菌种的机能是最重要的身分.（二）.微生物工业对菌种的请求是：（1）菌株高产,在较短的时光内发酵产生大量发酵产物的才能;（2）在发酵进程中不产生或少产生与目标产品邻近的副产品及其他产物;（3）发展滋生才能强,较强的发展速度,产孢子的菌种应当具有较强的产孢子才能;（4）可以或许高效地将道理转化为产品;（5）能应用普遍的原材料,并对发酵原料成分的波动迟钝性小;（6）对须要添加的前体物资有耐受才能,并且不能将这些前体物资作为一般碳源应用; （7）在发酵进程中产生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌体的才能;（9）遗传稳固性,二.工业用微生物菌种的起源及选育（一）微生物菌种的起源一般经由过程以下几个门路收集菌种.采集样品和分别筛选：（1）是依据材料直接向有科研单位.高级院校.工场或菌种保藏部门索取或购置;（2）从大天然中采集样品分别;（3）从一些发酵成品平分别筛选目标菌株.当前发酵工业所用菌种总趋向是从野生菌转向变异菌,天然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组的定向育种.（二）微生物工业菌种的分别1.野生菌株的分别.筛选进程（1）新菌种分别与筛选的步骤菌种分别的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集造就→菌种初筛→菌种复筛→机能判定→菌种保藏①采样采样季候：以温度适中,雨量不多的秋初为好.采土方法：在选好恰当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入干净的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记载采样时光.地点.情形前提等,以备查考.为了使土样中微生物的数目和类型尽少变化,宜将样品慢慢分批寄回,以便实时分别.②标本预处理④纯种分别：采用划线分别法.稀释分别法等纯化办法获取单菌落.⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与临盆邻近的造就基和造就前提,经由过程三角瓶的容量进行小型发酵实验,获得合适于工业临盆用菌种.还要对菌种进行发酵机能测定,⑥毒性实验：据有的国度划定,微生物中除啤酒酵母.脆壁酵母.黑曲霉.米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性实验外,其他微生物作为食用,均需经由过程两年以上的毒性实验.2.菌种的分别办法（1）施加选择性压力分别法主如果应用不同种类的微生物其发展滋生对情形和养分的请求不同,如温度.pH.渗入渗出压.氧气.碳源.氮源等,工资控制这些前提,使之利于某类或某种微生物发展,而不利于其他种类微生物的生计,以达到使目标菌种占优势．而得以快速分别纯化的目标.如可以控制造就时的氧,可将好氧微生物和厌氧微生物离开;经由过程控制温度,可将嗜热微生物和非嗜热微生物离开;控制pH,可将嗜酸.嗜碱微生物分别等.在分别造就基中也可以参加不同的抗生素或试剂来增长选择性.如在分别放线菌和细菌时,可参加抗真菌抗生素;分别真菌时,可参加抗细菌药物.（2）随机分别办法实验十从天然界平分别筛选微生物菌种1 目标（1）进修并控制优秀曲霉菌的分别道理和办法.（2）进修工控制酸乳中乳酸菌的分别道理和办法.2 道理从天然界平分别筛选微生物菌种,是我们获得优秀新菌种最根本.最重要的办法,是以,食物工业菌种的分别筛选是一项重要的.长期而沉重的工作.天然界消失着各类各样的微生物,尤其是泥土中微生物种类齐备,是微生物的大本营.是以可以从泥土平分别到几乎所有微生物.别的,不同的天然界情形中生计的微生物优势菌种也不同.各类食物.农副产品等养分构成不同,从中可以分别出不同的微生物.食物工业菌种常用的分别源有被污染的临盆或科研菌种.临盆中长期应用的菌种.发酵食物用菌种.动物肠道菌群.经各类育种办法处理过的微生物材料和天然界菌种样品.天然界的微生物是混淆生计的,要从平分理出一种微生物,不仅须要斟酌分别源应含有较多半量的目标菌,还要在分别操作中使之与其他菌种互相离开.对于样品中含量较低的菌处,要针对其生物学特色合理设计分别办法,如富集造就.选择造就.应用其特别的心理反响产生特定的发展现象等,以便于从大量杂菌中选出目标菌种.从混淆群体平分别特定微生物的常用办法有：控制分别造就基的养分成分.控制造就基的pH值.添加克制剂.控制造就温度.控制空气前提.对样品进行特别处理等.常用的纯种分别办法有平板划线分别法.简略平板分别法.稀释分别.涂布分别法.毛细管分别法.显微操作单细胞分别法等.本实验将采用稀释法和涂布法对目标微生物进行分别筛选.优秀曲霉菌的分别采用透明圈法,即先用淀粉琼脂造就基造就样品,因为糖化酶的感化,长出的菌落四周的淀粉被水解,遇碘后呈无色透明圈而平板的其他处呈蓝色.一般来讲,透明圈的直径越大,该菌的糖化力越强.可依据透明圈的大小筛选出糖化力强的菌株.酸乳中乳酸菌的分别采用溴甲酚绿（BCG）牛乳养分琼脂平板分别法.溴甲酚绿指导剂在酸性情形中呈黄色,在碱性情形中呈蓝色.在分别造就基（pH6.8）中加处溴酚绿指导剂后呈蓝绿色,乳酸菌在该造就基中发展并分化乳糖,产生乳酸,使菌落呈黄色,菌落四周的造就基也变为黄色.乳酸可用纸上层析法辨别.3材料3.1 样品黑曲霉种曲.酸奶.3.2 器具及其他用品平皿.三角瓶.涂布器.试管.玻璃珠.纱布.3.3 造就基及试剂2%淀粉察氏造就基.BCG牛乳造就基.0.02mol/L碘液.10%牛乳造就基.无菌心理盐水.4 流程4.1 优秀糖化酶菌株的分别与筛选熔化造就基→倒平板→打散孢子团粒→梯度稀释→涂布平板→造就不雅察→滴加碘液→挑菌落→接种→造就→糖化酶活气测定→菌种保存4.2 酸乳成品中的乳酸菌的分别制造就基→倒平板→梯度稀释→涂布平板→造就不雅察→挑菌落→接牛乳管→造就不雅察→传代造就→遴选凝乳管→乳酸测定→菌种保存5 步骤5.1 优秀糖化酶菌株的分别与筛选（1）熔化淀粉察氏造就基,稍冷后倒平板与斜面数个.（2）取种曲少许,参加10mL带玻璃球的无菌心理盐水的三角瓶中,用力振荡打散孢子团粒,使之形成平均的孢子悬浮粒.然后将其用无菌纱布过滤于无菌试管中.（3）将上述滤液以10倍稀释法知释至10-7,取后3个稀释度的稀释液各0.2mL,于淀粉察氏造就基平板上用无菌涂布器分别依次涂布2至3个皿,30℃造就1~2d.（5）机能测定：测定各菌落的糖化酶活气.5.2 酸乳成品中的乳酸菌的分别（1）制备BCG牛乳养分琼脂造就基.①称取脱脂奶粉10g,溶于50mL水中,参加1.6%溴甲酚绿酒精溶液0.07mL,0.075MPa压力下灭菌20min.②另取琼脂2g,溶于50mL水中,加酵母膏1g,消融后调pH值至6.8,0.1MPa压力下灭菌20min.③趁热将上述两液以无菌操作混淆平均,倒平板6个,待凝固后,置37℃造就24h,若无杂菌发展,即可应用.（2）将样品以10倍稀释法稀释至10-7,取个中10-7.10-6 2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL,分别置于上述各养分平板上,用无菌涂布器依次涂布2至3个皿,置43℃造就48h,如消失圆形稍扁平的黄色菌落及其四周造就基亦为黄色者初步定为乳酸菌.（3）将典范菌落转至脱脂乳发酵管,43℃造就8~24h,若牛乳管凝固,无气泡,呈酸性,镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色呈阳性,则将其持续传代若干次,43℃造就,遴选出在3~4h能凝固的乳管,保存备用.（4）乳酸菌的判定及生物量的测定.6 成果（1）描写黑曲霉分别株的形态特点及其分生孢子头的生态.（2）绘制所分别的乳酸菌形态图,并记载成果.7 思虑题（1）为什么消融样品的瓶内要参加玻璃珠？（2）解释用透明圈直径与菌株淀粉酶产量有何干系？（3）哪些情形可以或许引起凝乳？。
第二章工业微生物产生菌的分离筛选课件
芽孢杆菌的筛选：芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀死，要在121℃才能彻底死亡。 分离培养：将培养液倾入硅酸胶平板上，用富集培养物涂布接种于烘烤后的平板培养基上，于适温、厌氧条件下培养至长出足够大的 菌落。
四、厌氧微生物的分离 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌
一、 含微生物样品的采集
1、从土壤中采样 土壤是微生物的王国，从土壤中几乎可以分
离到任何所需的菌株。 细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）> 酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103）
1）根据土壤特点采样
▪比较复杂，应根据分离目的来进行灵活掌握
土壤有机质含量和通气状况
有机质含量丰富：耕作土、菜园土和近 郊土壤 ；森林土壤，枯枝落叶多的土壤
某些必要试验和毒性试验
分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰 富的原料
3、菌的稳定性
4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度
5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性
6、容易从培养液中回收产物
3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条， 便有希望成为效益高的生产菌株
➢ 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势 的情况下进行。
1、控制培养基的营养成分
环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该 物质的微生物也较多。在分离该类菌株之前，可在增 殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。 那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖， 其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。
工业生产菌的筛选步骤
工业生产菌的筛选步骤
工业生产菌的筛选步骤一般包括以下几个环节：
标本采集：这是第一步，需要从各种可能的环境或样本中收集微生物。
采集标本的原则是，样品来源越广，获得新菌种的可能性越大。
同时，需要了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物种类及其生理特征，以便更好地选择采样地点和方式。
标本材料预处理：收集到的样本需要进行适当的处理，以便于后续的微生物分离和纯化。
这一步通常包括样本的破碎、稀释、过滤等操作。
富集培养：为了提高目标微生物的浓度，通常需要进行富集培养。
这一步通过提供有利于目标微生物生长的环境条件，使其数量增加，便于后续的分离和筛选。
菌种初筛：在富集培养后，需要对微生物进行初步的筛选。
这一步通常基于微生物的某些特定生理特征或代谢产物进行，如抗菌活性、酶活性等。
性能鉴定：初筛得到的菌种需要进一步进行性能鉴定，以确定其是否满足工业生产的要求。
这一步通常包括对微生物的生长速度、产物产量、稳定性等方面的评估。
菌种保藏：最后，对于筛选得到的优良菌种，需要进行妥善的保藏，以便于后续的研究和生产使用。
这些步骤可能需要反复进行和优化，以获得最适合工业生产
的菌种。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种得分离与筛选来源:青岛海博一、微生物工业对菌种得要求(一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。
其中生产菌种得性能就是最重要得因素。
(二)、微生物工业对菌种得要求就是:(1)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力;(2)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物;(3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力;(4)能够高效地将原理转化为产品;(５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小;(6)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;(7)在发酵过程中产生得泡沫要少;(8)具有抗噬菌体得能力;(9)遗传稳定性,二、工业用微生物菌种得来源及选育(一)微生物菌种得来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选:(1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;(2)从大自然中采集样品分离;(３)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株。
当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。
(二)微生物工业菌种得分离1、野生菌株得分离、筛选过程(1)新菌种分离与筛选得步骤菌种分离得流程如下:标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—１５ｃm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。
为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
②标本预处理④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。
⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。
工业微生物菌种的筛选
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根据微生物的生理特点
• 产纤维素酶 • 产蛋白酶 • 产淀粉酶,糖化酶 • 以碳氢化合物为底物的菌种等
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采样方法
• 出去表层5CM左右的土层,取5~25CM的 土样10~15克(北方土壤干燥,可在1030CM处取样),装入事先准备好的容器内, 编号并记录地点﹑ 土壤质地 ﹑植被状况 ﹑取样时间及其它环境条件等.
• 平板菌落预选法:根据菌种及其代谢产物 的特性,在平板上设计许多巧妙的筛选方 法和活性粗测方法.
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平板菌落预选法
• 根据形态变异 • 根据产物特性 • 浓度梯度法
a定每一突变株,选出 生产能力高的菌株.
• 复筛:对同一菌株采用不同的条件实验,选 出生产能力强的菌株和相对应的实验条 件.
a
3
工业微生物菌种的筛选步骤
• 菌株的筛选通常分采样 ﹑富集﹑分离﹑ 筛选﹑产物鉴别等步骤.
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出发菌株采样
• 向菌中保藏机构购买或索取 • 向其它机构购买或索取 • 从自然界采样
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从自然界采样
• 从土壤中采样 • 根据微生物特点采样
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从土壤中采样
• 土壤有机质状况 • 土壤酸碱度和植被状况 • 地理条件 • 季节变化
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工业微生物的诱变育种
• 微生物育种是建立在遗传和变异的基础 上的,一个菌种生物合成代谢产物的产量 和质量由遗传因素所决定.一个性能好的 菌种只有在合适的条件下才能表现出来. 因此诱变育种的包括诱变 筛选和优化环 境条件三个重要环节.
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人工诱变育种的目的
• 提高有效产物的产量. • 改善菌种特性 提高产品质量.例如:孢子
发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：
1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。
第三次平板分离
第三次原种斜面
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
种子培养
1株3-5瓶 较优菌株
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
工业微生物产生菌的分离筛选(二)
工业微生物产生菌的分离筛选（二）富集（enrichment）培育是在目的微生物含量较少时,依据微生物的生理特点,设计一种选择性培育基,制造有利的生长条件,使目的微生物在最适的环境下快速地生长繁殖,数量增加,由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种,以利分别到所需要的菌株.富集培育主要依据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以掌握.一般可从以下几个方面来进行富集.一、掌握培育基的养分成分微生物的代谢类型非常丰富,其分布状态随环境条件的不同而异.假如环境中含有较多某种物质,则其中能分解利用该物质的微生物也较多.因此,在分别该类菌株之前,可在增殖培育基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源.那些能分解利用的菌株因得到充分的养分而快速繁殖,其他微生物则由于不能分解这些物质,生长受到抑制.当然,能在该种培育基上生长的微生物并非单一菌株,而是养分类型相同的微生物群.富集培育基的选择性只是相对的,它只是微生物分别中的一个步骤.现举两例,如要分别水解酶产生菌,可在富集培育基中以相应底物为惟一碳源,加入含菌样品,给目的微生物以最佳的培育条件（pH、温度、养分、通气等）进行培育.能分解利用该底物的菌类得以繁殖,而其他微生物则因得不到碳源无法生长,菌数渐渐削减.此时分别将得到所需的微生物.又如要分别耐高渗酵母菌,由于该类菌在一般样品中含量很少,富集培育基和培育条件必需严密设计.首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样.富集培育基为5%～6%的麦牙汁,30%～40%葡萄糖,pH3～4,在20～25℃温度下进行培育,可以达到富集的目的.在富集培育时,还需依据微生物的不同种类选用相应的富集培育基,如淀粉琼脂培育基通常用于丝状真菌的增殖,配方为（%）：可溶性淀粉4,酵母浸膏0.5,琼脂2,pH6.5～7.0.在配制时要特殊留意酵母浸膏加量,过多会刺激菌丝生长,而不利于孢子的产生.依据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点,可通过连续富集培育的方法分别降解高浓度污染物的环保菌.如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培育,待底物完全降解后,再以肯定接种量转接到新奇的含苯胺的富集培育液中,如此连续移接培育数次.同时将苯胺浓度逐步提高,便可得到降解苯胺占优势的菌株培育液,采纳稀释涂布法或平板划线法进一步分别,即可得到能降解高浓度苯胺的微生物.移种的时间既可依据底物的降解状况,也可通过微生物的生长状况确定.如在分别环己烷降解菌时,样品经环己烷为惟一碳源的培育基富集后,培育液由原来的无色变为浑浊的乳白色.同时锥行瓶壁上也可观看到微生物的生长状况.此时可以2%的接种量移入新奇的富集培育基中连续培育.连续富集培育的方法虽耗时较长,有时甚至需要6～7个月,但效果较好.通过该方法分别DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌,也都取得了满足的结果.二、掌握培育条件在筛选某些微生物时,除通过培育基养分成分的选择外,还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特别要求加以掌握培育,达到有效的分别目的.如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5）,霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）.因此,富集培育基的pH值调整到被分别微生物的要求范围不仅有利于自身生长,也可排解一部分不需要的菌类.分别放线菌时,可将样品液在40℃恒温预处理20分钟,有利于孢子的萌发,可以较大的增加放线菌数目,达到富集的目的.筛选极端微生物时,需针对其特别的生理特性,设计相宜的培育条件,达到富集的目的.一般所筛选的微生物通常是好氧菌,但有时也需分别厌氧菌.因严格厌氧菌不仅可省略通气、搅拌装置,还可节约能耗.这时除了配置特别的培育基外,还需预备特别的培育装置,制造一个有利于厌氧菌的生长环境,使其数量增加,易于分别.三、抑制不需要的菌类在分别筛选的过程中,除了通过掌握养分和培育条件,增加富集微生物的数量以有利于分别外,还可通过高温、高压、加入抗生素等方法削减非目的微生物的数量,使目的微生物的比例增加,同样能够达到富集的目的.从土壤中分别芽孢杆菌时,由于芽孢具有耐高温特性,100℃很难杀死,要在121℃才能彻底死亡.可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h,杀死不产芽孢的菌种后再进行分别.在富集培育基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长,对革兰阴性无抑制作.分别厌氧菌时,可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂,它能使培育基氧化还原电势下降,造成缺氧环境,有利于厌氧菌的生长繁殖.筛选霉菌时,可在培育基中加入四环素等抗生素抑制细菌,使霉菌在样品的比例提高,从中便于分别到所需的菌株；分别放线菌时,在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml,以及丙酸钠10g/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长.另外据报道,重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用,也可用于选择分别放线菌.在分别除链霉菌以外的放线菌时,先将土样在空气中干燥,再加热到100℃保温1h,可削减细菌和链霉菌的数量.分别耐高浓度酒精和高渗酵母菌时,可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间,杀死非目的微生物后再进行分别.对于含菌数量较少的样品或分别一些稀有微生物时,采纳富集培育以提高分别工作效率是非常必要的.但是假如按通常分别方法,在培育基平板上能消失足够数量的目的微生物,则不必进行富集培育,直接分别、纯化即可.。
工业微生物产生菌的分离筛选【3】
工业微生物产生菌的分离筛选【3】在分离以氯化物为氮源的细菌时，把浸透了KCN溶液的滤纸放到平皿盖上，滤纸所产生的HCN蒸气逐渐渗入含无机盐的分离培养基，每天用新制备的浸湿KCN的滤纸更换，培养一段时间后，从平皿上长出的菌落中进行分离，便容易得到分解氰化物的菌株。
由于塑料工业的发展，环境中到处都有各种高分子包装废弃物，这些污染物多为不溶于水的高分子化合物，获得其降解菌株较为困难。
通常采用富集法进行筛选，如日本的小野胜道教授以低浓度聚乙烯作为富集培养基对土壤微生物进行驯化，分离到了三种能降解聚乙烯的细菌。
在淀粉塑料的降解试验中，采用加富土壤淹埋法，筛选到的降解微生物主要是霉菌与放线菌。
这可能是因为丝状体更容易深入共混物内部生长。
尤其是膜料中的聚乙烯和淀粉分布并非均匀，由于聚乙烯的流动性好，因而在吹塑过程中膜表面的聚乙烯含量偏高，使细菌在初期很难降解这类共混物，所以在降解菌的研究方面应着重考虑霉菌与放线菌。
除驯化培养进行降解菌的筛选外，还可采用阶段式筛选法。
如在分离聚乙二醇降解菌时，可先筛选能分解乙二醇、丙二醇或聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇的微生物，再从中筛选能降解聚乙二醇的菌株，也能达到较好的效果。
除寻找能够降解废旧塑料的微生物外，根治白色污染的最好方法是用降解塑料替代现有塑料。
目前降解塑料有光降解、光-生物降解、纤维素类生物降解塑料等。
有些生物降解塑料是以简单的物理共混工艺，将淀粉填充到聚乙烯等树脂内，淀粉可以被微生物分解，但树脂分子骨架在很长时间内仍分解不了，反而为废弃塑料的回收增加了困难。
而一些聚脂类高分子由于具有和微生物本身可合成的聚β-羟基丁酯（PHB）相类似的结构，无毒，且能在酸、碱和微生物条件下完全降解，同时具有良好的塑性，用途宽广的多。
用微生物发酵法生产的聚β-羟基脂肪酸（polyhydroxyalkanoic acid,PHAs）也成为研究生物降解塑料的热点，其中利用真氧产碱杆菌（Alcaligtnes eutrophus）合成PHB的研究最多。
工业微生物产生菌的分离筛选(四)
工业微生物产生菌的分离筛选（四）各种微生物对养分要求和培育条件是不同的,在分别筛选时若在这两个方面加以调整掌握,就能获得更好的分别效果.1. 培育基的养分成分各种微生物对碳源、氮源要求各异,有的对养分还有特别的要求,事先了解被分别微生物的养分要求,从而设计一个合理快速的分别培育基,能够收到事半功倍的效果.放线菌是生产抗生素和酶制剂的重要来源.在选择分别放线菌时,通常采纳改良的HV琼脂培育基、土豆-胡萝卜水汁液培育基和淀粉琼脂培育基能取得较好的效果.但不同菌种对养分要求差别很大,如奴卡氏菌在有氧条件下用一般培育基即可分别到,而以色列放线菌则在有CO2存在且有相宜培育基的状况下才能正常生长繁殖.筛选水解酶产生菌时,通常利用以底物为惟一碳、氮源的平板进行分别,如以淀粉为碳源的培育基可鉴定菌落能否产生淀粉酶；一种含纤维素粉为碳源的分别培育基,可以鉴别纤维素酶产生菌；用含有酪蛋白为有机氮源的平板培育基,可以鉴别蛋白酶的产生菌.纯种分别时,把以上琼脂平板置于相宜的温度培育肯定的时间,如具有产生水解酶力量的菌株,便在菌落四周形成水解圈或呈色圈,依据圈的大小可初步推断酶活力强弱.测定水解圈直径与菌落直径之比,把比例大的菌落移入斜面保藏,供进一步筛选.2. 培育基的pH细菌、放线菌的生长繁殖对pH一般要求偏碱,霉菌和酵母菌要求偏酸.因此,分别培育基的pH应当调整到被分别微生物要求范围.这不仅有利于自身生长,也可排解一部分不需要的菌类.例如,分别柠檬酸产生菌的黑曲霉,就是利用调整培育基的酸碱度获得胜利的.其分别方法是：取红芋粉醪20%、柠檬酸 10%～20%配成培育液,调整pH2.0～2.5,以肯定量的培育基和土样匀称混合,用毛细吸管点种在平皿内事先掩盖的无菌滤纸上（2～3层）,于30℃培育,这样可以分别到产生柠檬酸的黑曲霉.分别碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时,可以把培育基调到pH9～11,在此范围内不宜生长的微生物被抑制,这对分别本身起到浓缩作用.大多数水解酶的生长最适pH基本相近,而酶的作用pH未必与产酶pH相同.培育基的pH要结合养分成分和培育条件来考虑.由于微生物在生长繁殖过程中,由于代谢作用会产生酸性或碱性产物,pH发生变化,微生物生长受到抑制.一般培育基中碳氮比（C/N）高者,培育后倾向于酸性,反之则倾向于碱性.无机盐的性质也会影响pH变化,（NH4）2SO4是生理酸性无机氮源,其中NH4+被菌体利用,留下SO42-,培育液变成酸性.而NaNO3是生理碱性氮源,其中NO3-被菌体分解利用后,剩余Na+,使培育液变成碱性.如发酵过程缺氧,则代谢向有机酸合成方向进行,pH下降.为了维持培育基的PH,一般要加磷酸盐,如K2HPO4、KH2PO4,使培育基具有肯定的缓冲力量.假如培育液中的酸碱变化很大,磷酸盐的缓冲容量不足以调整pH变化,则可适当加入碳酸钙,以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类,使培育基的pH能保持在恒定的范围内.此外,在分别霉菌时,加几滴乳酸不仅可以维持肯定酸碱度,而且可以抑制细菌的生长.3. 排解不需要的菌类实行调整pH的方法来抑制非目的微生物的生长,虽然能起到肯定的作用,但并不是对全部的菌类都有效.有些细菌和放线菌同样可以在酸性环境下生长,而个别的霉菌,也同样可以在中性或偏碱的培育基中生长.为了更有效地抑制非目的微生物的生长,要加入一些专一性的抑制剂.（1）分别细菌时,在培育基中加入浓度为50U/ml制霉菌素,可以抑制霉菌和酵母菌的生长.（2）分别放线菌时,在样品中加入0.05%十二烷基磺酸钠（SDS）不仅可以抑制细菌的生长,还能激活放线菌孢子的萌发.加入氟哌酸（5mg/L）+ 制霉菌素（50mg/L）+ 青霉素（0.8mg/L）也可以有效地抑制细菌和真菌,而不影响放线菌的生长.（3）分别霉菌和酵母菌时,在培育基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U/ml,可以抑制细菌和放线菌生长.（4）分别根霉和毛霉时,由于这些微生物的菌丝易扩散成片,难以得到纯化的菌落,通常在培育基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝扩散,使菌落长得小而紧密.一般用于分别单一目的微生物的培育基中均含有抑制其他微生物的抑制剂,这些专用的抑制剂在小型试验室配制较麻烦,现已有成品供应,只要直接加入基础培育基即可.如氨苄西林,主要用于分别亲水气单孢菌.4. 掌握培育温度掌握培育温度,也是一种获得目的微生物的有效措施.各类微生物生长温度不同,从大范围来看,可分三大类：一类是高温微生物,最适温度在50～60℃.假如要分别这类菌可将分别培育基置于50～60℃温度下培育,能抑制一些嗜冷、中性微生物生长,可以有效地分别到高温菌类.其次类是中温微生物,它们的最适生长温度是20～40℃,超过50℃,就停止生长.这类微生物最为常见,、数量都占首位.工业发酵微生物绝大多数都属于此类.其中不同类群微生物对温度又有所差别,一般细菌、放线菌最适温度为25～37℃,霉菌和酵母最适温度为20～28℃.第三类为低温微生物,它们的最适温度为15℃或更低.当从样品中分别各种菌类时,分别置于自身最适温度下培育也可大体上抑制另一些微生物的生长.当分别某些特别产物的微生物时,对温度的选择还需考虑某些内在的关系,如在筛选不饱和脂肪酸产生菌时,由于细胞膜中所含的不饱和脂肪酸含量越高,其凝固点越低,即细胞在较低温度下仍能表现出活力,因此在低于正常温度10℃下分别效果最好.。
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工业微生物产生菌的分离筛选
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
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地理条件 （南方北方土壤）
工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是 霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。 原因：南方温度高，温暖季节长，雨水多，相 对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤 有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。
季节条件
冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少 春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加 春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良 7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中 微生物数量比任何时候都多 秋季取样最好
采土样最好 的土层是 5～25cm 微生物类群较多，生长旺盛， 细菌、放线菌较多；霉菌、酵 母菌生产多
土壤酸碱度和植被状况
偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境，适合于细菌、放线 菌生长 偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长 旺盛 番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌 葡萄或其他果树根部附近土壤中酵母菌数量增多 豆科植物根瘤菌
分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂， 它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利 于厌氧菌的生长繁殖。 筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑 制细菌，使霉菌在样品的比例提高，从中便于分离到所 需的菌株
三、好气微生物的分离
经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖， 占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但 并未死亡。因此，经过富集培养后的样品，也需要进 一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分 离出来。 分离方法：一类较为粗放，“菌落纯”；一类较细 的单孢子或单细胞分离方法，“菌株纯”，“细胞 纯”。
高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物； 高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；
1、控制培养基的营养成分
环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该 物质的微生物也较多。在分离该类菌株之前，可在增 殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。 那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖， 其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。 分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底 物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最 佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培 养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微 生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。此 时分离将得到所需的微生物。
收集和筛选 的途径：
向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需 菌株 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等， 从中进行分离筛选 从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的 产生菌等
本章内容
一、 含微生物样品的采集 二、 富集培养 三、 好氧微生物的分离 四、厌氧微生物的分离
如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素； 如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素； 需注意， 需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培 控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物； pH可分离嗜酸或嗜碱微生物 控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物； 养基的性质，从而改变选择压力。 养基的性质，从而改变选择压力。 分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉 菌素等 重复移植几次后接种少量已富集的培养物到 固体培养基上。 固体培养基上。 移植时间是关键， 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势 的情况下进行。 的情况下进行。
一、 含微生物样品的采集
1、从土壤中采样 土壤是微生物的王国，从土壤中几乎可以分 离到任何所需的菌株。 细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）> 酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103）
1）根据土壤特点采样
比较复杂，应根据分离目的来进行灵活掌握
土壤有机质含量和通气状况
有机质含量丰富：耕作土、菜园土和近 郊土壤 ；森林土壤，枯枝落叶多的土壤
2）采样方法
塑料袋编号并记录地点、土 壤质地、植被名称、时间及其 他环境条件 样品取回后应马上分离， 以免微生物死亡 路途遥远或者取样太多，选择性 培养基做好试管斜面
2、根据微生物生理特点采样
筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等 采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘 蔗渣堆积处采样 森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。 肉类加工厂附近、饭店 排污沟，易分离到蛋白 酶和脂肪酶产生菌。面 粉加工厂等场所易分离 到产淀粉酶、糖化酶的菌
其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不 利于其他菌型生长的条件，例如， 利于其他菌型生长的条件，例如，供给特殊的 基质或加入某些抑制剂。 基质或加入某些抑制剂。 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性
高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；
分离解脂微生物(吐温为底物 尼罗红作指示剂) 吐温为底物， 又如 分离解脂微生物 吐温为底物，尼罗红作指示剂 豆油作底物 中性红（红～黄. 6.8～8.0. ）指示 菌落周围呈红色圈 甘油三丁酸酯为底物 罗丹明B为指示剂 罗丹明 为指示剂 荧光圈
带正电、加美兰、 聚赖氨酸产生菌 （带正电、加美兰、排斥 呈现透明圈） 呈现透明圈）
透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之 间并不完全成正比。 间并不完全成正比。 但作为初筛的手段是有意义的
2）、变色圈法 ）、变色圈法
富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相 应的富集培养基，如淀粉琼脂培养基通常用于丝状 真菌的增殖，配方为（%）：可溶性淀粉4，酵母浸 膏0.5，琼脂2，pH6.5～7.0。 特别注意酵母浸膏加量，过多会刺激菌丝生长， 而不利于孢子的产生。 根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的 特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓 度污染物的环保菌。比如：降解高浓度苯胺的微 生物分离；环己烷降解菌的分离
3、抑制不需要的菌类
通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微 生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到 富集的目的。 芽孢杆菌的筛选：芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀 死，要在121℃才能彻底死亡。可先将土样加热到80℃ 或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后 再进行分离。 革兰氏阴性菌：富集培养基中加入适量的胆盐和十 二烷基磺酸钠
筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样 油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源 的菌株
杨 尺 蠖
鳞翅目尺蛾科
赤 松 毛 虫
侧 柏 毛 虫
二、含微生物样品的富集培养
富集(enrichment)培养 富集(enrichment)培养 (enrichment) 是在目的微生物含量较少时，根据微生物 的生理特点，设计一种选择性培养基，创造 有利的生长条件，使目的微生物在最适的环 境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自 然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种， 以利分离到所需的菌株。
透明圈法
变色圈法
生长圈法
抑菌圈法
1、稀释涂布法和划线分离法 、
1）稀释涂布法 稀释涂布法
2）.平板划线分离法 平板划线分离法 采用无菌操作法， 采用无菌操作法， 以接种环沾取少许 待分离的样品， 待分离的样品，在 无菌平板表面进行 平行划线、扇形划 平行划线、 线或其他形式的连 续划线 ，如果划线 适宜的话， 适宜的话，微生物 能一一分散， 能一一分散，经培 养后，可在平板表 养后， 面得到单菌落。 面得到单菌落。
2、控制培养条件：pH、温度及通气
富集培养基的pH值调节到被分离微生物的要求 范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要 的菌类。 分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20 分钟，有利于孢子的萌发，可以较大的增加放线菌 数目，达到富集的目的。 筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性， 设计适宜的培养条件，达到富集的目的。 厌氧菌需要特殊的装置
第二章 工业微生物产生菌的分离筛选
菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种 微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要 求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他 们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。 工业微生物产生菌的筛选：
一是从自然界分离所需要的菌株，二 是把分离到的野生型菌株进一步纯化并 进行代谢产物鉴别。
增殖培养
纯种分离
生产性能测定
筛
调查研究（包括资料查阅） 调查研究（包括资料查阅）
选
试验方案设计
工
采样
作
增殖条件探索 第一次增殖培养
程
第一次平板分离 第 次增殖培养 第一次
序
第 次平板分离
第 次
（11ຫໍສະໝຸດ ）第三次平板分离第三次原种斜面 复筛 不纯 第四次平板分离 第三次菌种保藏
第四次原种斜面 初步工艺条件摸索 再复筛 1株3-5瓶 株 瓶 较优菌株 保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株 某些必要试验和毒性试验 种子培养
比如分离淀粉酶产生菌：淀粉作为碳源 比如分离淀粉酶产生菌：
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性 蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上 的不溶性蛋白质，产生一透明圈。
分离某种产生有机酸的菌株时， 分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈 法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状， 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解， 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明 圈
分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标： 在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 、 2、菌的生长温度 、 3、菌的稳定性 、