核酸提取质量保证与全自动核酸提取仪的性能评价 廖璞

HSV-…DN…A、HPV-
DNA、EV-DNA
…… 分泌物
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临床病原微生物核酸提取
病毒与细菌 耐细药菌相关检 核测病酸毒检测 核酸检测
HTBBV--DDNNAA、
痰、肺及支气管灌洗液、 咽血清拭、子血等浆、乳汁等
性病H结药类CV核基：-RN分因GN枝检-AD杆测NA菌、耐生殖血泌清尿或道血分浆泌物、眼
提取后贮存方式
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DNA核酸提取评价
评价方法
完整性(Integrity)
1
普通凝胶电泳
2 脉冲场凝胶电泳
3
毛细管电泳
其他：如扩增不同 4 大小的片段比较
……
Clinica Chimica Acta 424 (2013) 274–286
不同实验室核酸提取后完整度比较 （脉冲场凝胶电泳）
核酸提取质量保证
与自动核酸提取仪性能评价
廖璞 重庆市临床检验中心
2015 . 10 重庆
内容
引言 核酸提取质量评价与保证 自动核酸提取仪性能评价 结语
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引言
器官移植 配型HLA 分型检测
分子诊断
病原微生物 核酸检测
核酸提取 与纯化是
基础
分子诊断 临床应用
染色体病 和遗传性 疾病基因
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引言
核酸提取与检测结果
Clin Chim Acta. 2015 Feb 2;440:205-10.
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引言
核酸提取与检测结果
Clin Chim Acta. 2015 Feb 2;440:205-10.
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内容
引言 核酸提取质量评价与保证 自动化核酸提取仪性能评价 结语
1. 检测260nm、280nm、
（ 320nm ）OD值，计算纯度
2. 层析
层析
NATURE PROTOCOLS, 2007,2(12)
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RNA核酸提取评价
完整性(Integrity)
评价方法
RNA电泳图：
1 普通凝胶电泳
毛细管电泳/RIN 2 值等
理想的RNA完整性为：清晰的 28S/18S两条带，以及5S条带，无 基因组污染的DNA条带。28S/18S 应近似两倍。
RNA核酸提取评价
完整性(Integrity)
不同RIN值对GAPDH扩增的影响 Methods. 2013 Jan;59(1):20-31.
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核酸提取其它评价
干扰物质、交叉污染
干扰试验
一、将已知病原体含量 的溶血或脂血标本用待评价 试剂提取，比较所得到的结 果。可知纯化后是否将有关 抑制物去除从而反映提取纯 度。
检测Baidu Nhomakorabea
用药个体化 核酸检测
肿瘤基因 检测
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引言
核酸
脱氧核糖核酸
(deoxyribonucleic acid, DNA)
核酸的紫外吸收
核糖核酸
(ribonucleic acid, RNA)
• 线性高分子化合物，粘度极大； • 多元酸，较强酸性； • 核酸分子具有强烈的紫外吸收。
DNA纯品A260/A280=1.8 RNA纯品A260/A280=2.0
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引言
核酸提取质量管理
性能验证
试剂性能验证记录应能反映该批试剂的核酸提取效率 和核酸扩增效率。
可采用凝胶电泳试验比较核酸提取物与核酸标准物确 认核酸片段提取的完整性、260nm紫外波长测定确认核酸提 取的产率、260nm/280nm比值 确认核酸提取的纯度。
检验过程
应使用验证过的核酸抽提和纯化方法。
R = (A260–A320)/(A280–A320)
不同实验室核酸提取后纯度比较
Clinica Chimica Acta 424 (2013) 274–286
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DNA核酸提取评价
完整性(Integrity)
影响完整性的因素
物理剪切力 核酸酶的降解等
样本分析前储存 （时间、温度）
提取方法
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DNA核酸提取评价
产率 (yield)
核酸定量分析方法
若不含脂肪组织，大于10mg的组织应能产出大于 10 μg的 RNA 或 DNA 。
CLSI-MM10-P Genotyping for Infectious Diseases:Identification and Characterization . CLSI- MM13A Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods.
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DNA核酸提取评价
产率 (yield)
检测260nm 、（320nm）OD值计算浓度
Q=(A260 – A320) ×50 × 稀释因子× 复溶体积/样本体积(ng/μl)
不同核酸提取方法产率比较 （不同提取方法提取核酸量比较）
Clinica Chimica Acta 424 (2013) 274–286
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DNA核酸提取评价
完整性(Integrity)
不同的提取方法 对核酸提取完整性的影响（ ImageJ分析）
Clin Chim Acta. 2015 Feb 2;440:205-10.
样本提取间隔时间 对完整性的影响(脉冲场电泳)
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RNA核酸提取评价
产率 (yield)
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核酸质量综合评价 产率 纯度
完整性 其他
其他：干扰物质、交叉污染等
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DNA核酸提取评价
产率 (yield)
1
核酸定量
评2
价
提取核酸后进行定量PCR，比较Ct值
方3 通过标本倍比稀释后提取进行灵敏度评价
法
4
通过内标(Internal Control/Calibrator)评价
RNA核酸提取评价
产率 (yield)
不同实验室RNA提取产率比较 （ 通过RT-qPCR对提取出的RNA进行基因转录子扩增比较提取效率）
Methods 59 (2013) 20–31
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RNA核酸提取评价
纯度 (Purity)
比值 R = (A260–A320)/(A280–A320)
组织样本结合杆菌检测 不同提取方法效率比较
（检测限比较）
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临床病原微生物核酸提取
提取方法的选择
依据 标本类型
考虑 后续实验 对提取质 量的要求
依据
相关标准、 指南
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临床病原微生物核酸提取
提取方法的选择
依据治疗、监测要求选择
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临床病原微生物核酸提取
葡萄球菌相关基因 检测
部分泌物等。 粪血便清、、血全液血及、各咽类拭分子泌等 物
HP-DNA
HCMV-DNA 乙肝病毒耐药相
关基因检测
MP-DNA
胃粘膜组织活检标本 尿液、乳汁、血清、 全血等 血清或血浆
痰、咽拭子等
HIV-1RNA 血清或血浆等
细菌其宏它…基…因组 Flu-RNA
菌液 …… 咽拭子、呼吸道分泌 物样本等
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引言 多样化
临床核酸提取标本类型
血液：全血、血清、血浆、血斑… 粪便、尿液、脑脊液…
分泌物：痰、乳汁、拭子…
细胞：肿瘤细胞、羊水细胞… 病理组织、微生物菌落…
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引言
核酸提取方法
病毒核酸 提取方法
基因组核酸 提取方法
RNA 提取方法
有机提取法 靶向捕获技术 硅材质技术 …
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微量样本的核酸质量评价
如微生物群体中pg级的DNA提取量
• 使用荧光双链DNA染料
法在quabit荧光计上测
定浓度。
• Lonza FlashGel system检 测完整性、16S rRNA基 因进行qPCR检测
Nat Protoc. 2015 May;10(5):768-79.
5
个体化用药核酸检测
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临床病原微生物核酸提取
病毒与细菌 耐药相关检 测 细菌 核酸病检毒测
核酸检测
结核HT分BBV枝--DD杆NN菌AA、耐
药基H因CV检-R测NA
痰、肺及支气管灌洗液、 咽拭子等 血血清清或、血血浆浆、乳汁等
性病类：NG-DNA、 生殖泌尿道分泌物、眼
耐CT甲-D氧NE西AB、林-DU金NU黄-AD色NA
CT-DENBA、-DUNUA-DNA 部血分清泌、物全等血。、咽拭子等
耐 葡甲 萄氧 球核西 菌林 相酸金 关提黄 基色 因取方粪物法便、：血液及各类分泌 H检HC测PM-VD煮-DN沸NAA法；胃尿全粘液血膜、等组乳织汁活、检血标清本、
H乙关MIVP肝基--1病因D柱RN毒检N提AA耐测取药；相痰血、清血咽或清拭血或子浆血等等浆 磁珠法等。
细菌Flu宏其-R基它N因…A组… 菌咽物拭液样子本、等呼吸…道…分泌
HSV-D…NA…、HPV-
DNA、EV-DNA
…… 分泌物
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临床病原微生物核酸提取
不同的提取方法之间存在结果差异
不同提取方法效率比较 （菌液稀释）
Ann Lab Med. 2012 Mar;32(2):119-25.
我室核酸纯化过程中乙醇未完全去 除导致测序结果出现杂峰
乙醇未完全去除标本
乙醇完全去除标本
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引言
核酸提取与检测结果
Anal Biochem. 2015 Jun 15;479:60-2.
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引言
核酸提取与检测结果
Clin Chim Acta. 2015 Feb 2;440:205-10.
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引言
核酸提取基本步骤
样本 预处理
裂解 释放
分离 纯化
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引言
核酸提取与检测结果
核酸提取、扩增过程中人基因组的污染，导致测序结果被污染
J Natl Cancer Inst. 2011 Jun 8;103(11):847-8.
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引言
核酸提取与检测结果
二、将影响后续实验的物 质加入到标本中，看提取试 剂是否能够有效去除干扰。
交叉污染
将已知不同浓度的病原 体含量（包括阴性）的标本 用待评价试剂提取，比较所 得到的结果。可知纯化后是 否存在标本间交叉污染。
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核酸提取其它评价
成本、时间、特殊设备要求等
Journal of Microbiological Methods 76 (2009) 30–37.
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DNA核酸提取评价
产率 (yield)
不同核酸提取方法产率比较 （不同提取方法提取后Ct比较）
菌液浓度106 CFU/ml
Journal of Microbiological Methods 76 (2009) 30–37
菌液浓度105CFU/ml 重庆市临床检验中心
DNA核酸提取评价
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RNA核酸提取评价
完整性(Integrity)
RIN值评价： 进行毛细管电泳，并以软件进行RIN(RNA Integrity Number)分数评估，
10为RNA完整性最好。
毛细管电泳图
Methods. 2013 Jan;59(1):20-31.
不同实验室RIN值比较 重庆市临床检验中心
提取方法的选择
参考诊断试剂相关要求
HBV-DNA提取 （1）最低检出限与定量限的确定
产率 (yield)
不同核酸提取方法产率比较 （通过样本浓度倍比稀释后比较灵敏度）
Journal of Virological Methods 171 (2011) 195–199。
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DNA核酸提取评价
纯度 (Purity)
检测260nm、280nm、(320nm)OD值，计算比值
检测260nm（ 320nm）OD值，计算浓度
Q=(A260 – A320) ×50 × 稀释因子× 复溶体积/样本体积(ng/μl)
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RNA核酸提取评价
产率 (yield)
RT-qPCR检测管家基因（Ct值）
Springerplus. 2014 Feb 8;3:76.
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微量样本的核酸质量评价
如NanoDrop超微量分光光度计、quabit、 Quant-iT荧光定量分析–用 于下游检测为（NGS）等需要精密测定的实验
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主要分子诊断技术对核酸提取的要求
1 临床病原微生物核酸检测
2 染色体病和遗传性疾病基因检测
3
肿瘤基因检测
4 器官移植配型HLA基因分型检测
有机提取法 盐析法 氯化铯密度梯度离心法 硅材质技术 离子交换法 滤纸分离法 …
CLSI- MM13A Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods
酶消化法 有机溶剂提取法 强变性剂提取法 酒精及氯化锂沉淀法 氯化铯及蔗糖密度梯度 离心法 离子交换层析法 硅材质技术 Oligo(dT) 亲和层析法 分离mRNA …