真核生物之酵母表达系统共44页文档
酵母表达载体的构件
各个外显子
终止密码子
真核基因的一般结构
真核生物基因表达过程示意图
真核生物基因的结构特点
真核生物结构基因示意图
可见，真核生物基因的转录和翻译具有时间 和空间上的分隔。上述真核生物基因转录后 的剪切、拼接和转移等过程，都需要有调控 序列的调控，这种调控作用是原核生物所没 有的。
产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋
白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌
是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
真核基因在大肠杆菌中表达体系的不足：
1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含 有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性。 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰 （正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞 中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分 子，并把它们降解掉。
统，需要构建不同的表达载体。克隆基因在不同的系
统中表达成功的把握性，取决于我们对这些系统中宿
主基因表达调控规律的认识程度。
人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背
景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖
快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工
具已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因
第十一章
克隆基因在真核生物中的表达
真核表达系统是指利用真核生物细胞作为外源基因 表达宿主的一类基因表达系统，常用的真核系统包 括酵母、丝状真菌、昆虫类、植物和哺乳动物细胞 等表达系统。 本章主要是关于酵母表达系统。
真核细胞表达系统
利用PAXOI表达外源蛋白时,一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子代替PAXOI，不需要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：
①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制；
②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及；
③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
关键词：细胞系统真核细胞表达系统酵母表达系统酵母虫细胞哺乳动物哺乳动物细胞
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就 。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
酵母表达系统
Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35
19
pAO815和pPIC9K 在
5 AOX1
Bgl II双切：
Bgl II
在5AOX1位点和
3AOX1双交换，替
换掉了宿主的AOX1
基因，
gene
转化后GS115产生
AOX1
His +/Muts
His4
3AOX1 His4
20
21
技术路线
选择合适的内切酶位点 将基因插入载体
注:pAO815 和pIC9K是穿梭载体, 可在 大肠杆菌中操作
grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，
室温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭
菌的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀， 液氮快速冷冻， -70°C保存。
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
AOX2 利用甲醇的能力低
生长慢
7
histidinol dehydrogenase gene (his4)
酵母表达系统2010
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
表达载体构建 大肠杆菌转化 重组表达载体的大量抽提及其线性化 酵母转化 转化子筛选 转化子表型鉴定 诱导表达 外源蛋白的分离纯化 外源蛋白的PAGE电泳、序列分析及活性检测
4.2乳酸克鲁维亚酵母表达系统
表达载体：整合体型载体 附加体型载体：1.胞质线性双股DNA杀伤粒 2.含有乳酸克鲁维亚酵母ARS序列 3.稳定高拷贝数 启动子：LAC4 乳糖作为唯一的能源和炭源
成功表达的外源蛋白实例：人血清蛋白和白细胞介 素1β
乳酸克鲁维亚酵母表达系统的独特优点：
4.不同酵母表达系统的特点
4.1酿酒酵母表达系统
表达载体：自主复制型和整合型 筛选标记: LEU2、URA3 启动子： PGK1、 PHO5、CUP1
成功表达的外源蛋白实例：人重组干扰素
一种常用的酿酒酵母表达载体结构图
酿酒酵母表达系统的主要不足：
A.分泌能力低 B.不能使异源蛋白正确糖基化 C.所表达的蛋白质的C-末端被截短
A.可以高密度发酵； B.不需要甲醇防爆装置； C.工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再 繁殖能力。
4.3甲醇营养型酵母表达系统
甲醇作为唯一的能源和炭源 表达载体：整合体型载体 筛选标记：HIS4 启动子：AOXI 作为分泌型表达时，外 源基因需要接上一段信号 肽序列
我国酵母表达载体产品结构分析
酵母表达系统
陈茜 2012.12.16
Concept
1
酵母表达系统的产生
2
3 4 5
酵母表达系统的组成 主要酵母表达系统 不同酵母表达系统的特点
酵母表达系统的方法
1.酵母表达系统的产生
基因工程技术的发展为用微生物合成 和生产外源蛋白展示出广阔的前景。长期 以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多 种蛋白。
酵母表达系统
酵母表达系统基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。
其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。
1、酵母表达系统的特点酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。
酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。
某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。
解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。
因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。
2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。
因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。
真核表达系统
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真核表达载体
➢质粒：真核表达元件、真核抗性 ➢病毒载体：改建后
➢ SV40病毒 ➢ 腺病毒 ➢ 反转录病毒 ➢ 痘苗病毒
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病毒基因组的结构特点
➢ 病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒 的基因组很小
➢ 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成
TATA box TATAAAA
TBP 30,000 ~ 10bp
GC box GGGCGG
SP-1 105,000 ~ 20bp
CAAT box GGCCAATCT CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Octamer ATTTGCAT
Oct-1 76,000 ~ 20bp
Oct-2 53,000 ~ 23bp
11
启动子
➢ 真核启动子：RNA聚合酶（Ⅱ）结合并起动转录的 DNA序列
➢ 一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包 含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件 约长7-30bp
➢ 核心启动子元件：RNA聚合酶起始转录所必需的最 小DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处 的TATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和 产生基础水平的转录
➢ 与其序列的正反方向无关
➢ 要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没 有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型 启动子的转录
➢ 增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式 调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后 才能发挥增强转录的作用
➢ 增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子 只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞 或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
真核生物之酵母表达系统
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 毕赤酵母 30℃ 4.5 是 汉森酵母 37℃ 4.5 否
糖基化
高密度发酵
部分过度
100g/L
较正常
100g/L
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要选择标记
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
低温诱导、磷酸盐抑制 A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1 3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA
提供多个整合位点
3、酿酒酵母糖基化系统
糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）
N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖
基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。
O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化
酿酒酵母糖基化特点
* 过糖基化（超糖基化修饰）：
酵母表达系统
•巴斯德毕赤酵母 它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基 因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可 在细胞中高水平积累。 AOX1的启动子是一种可诱导的强启
动子。以AOX1为启动子，选择AOX1基因缺失的突变株作为
受体细胞，可高效表达外源基因。 在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面 抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。 毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了 解还比较少，且发酵周期也比较长。
Selecting a Pichia Expression Vector
pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点
Selecting a Pichia Expression Vector
Pichia Cloning
表达载体与毕赤酵母基因 组发生重组的方式：
1. 载体的3‘ AOX1区与基因组的
expression and can even lead to cell death. Other important facts: • Doubling time of log phase Mut+ or MutS Pichia in YPD is ~2 hours • Mut+and MutS strains do not differ in growth rates unless grown on methanol • Doubling time of log phase Mut+Pichia in methanol medium (MM) is 4-6 hours
AOX1基因的末端发生同源重组
2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4 基因的末端发生同源重组
Gene Replacement at AOX1 in GS115
酵母表达系统
比较基因组学
通过比较不同物种之间的基因组 和转录组，分析生物进化的特征 和规律。
05 酵母表达系统的未来发展
提高表达产物的产量与质量
基因编辑技术
利用基因编辑技术，如CRISPR-Cas9，对酵母基因进行精确修饰， 以提高目标蛋白的表达量和纯度。
沉默子
沉默子是能够抑制基因表达的DNA序列，通过与转录因子结合来抑制基因的表达，在基因表达调控中具有重要作 用。
转录因子与基因表达调控
转录因子
转录因子是能够识别并结合DNA序列的蛋白质，通过与特定DNA序列的结合来调控基因的表达。
转录因子与基因表达调控
转录因子在基因表达调控中发挥关键作用，通过与启动子、增强子或沉默子等DNA序列的相互作用来 调节基因的表达。
蛋白质相互作用
通过酵母双杂交等技术研究蛋白质之间的相互作用，揭示基因调控 的分子机制。
基因突变分析
通过构建突变体分析基因突变对酵母生长、代谢等的影响，研究基因 的功能。
生物进化研究
物种进化
利用酵母表达系统研究物种之间 的进化关系，通过比较不同物种 之间基因表达的差异，揭示物种 进化的规律。
适应性进化
利用酵母表达系统生产食品添 加剂、酶制剂等，提高食品质 量和安全性。
农业领域
通过酵母表达系统改良农作物 ，提高抗逆性、产量和品质等
。
酵母表达系统的优缺点
优点
操作简便、周期短、成本低、可大规 模生产、安全性高。
缺点
表达水平相对较低、分泌蛋白的加工 和修饰能力有限、易受宿主菌遗传背 景的影响。
02 酵母表达系统的基本组成
对启动子、终止子等表达元件进行优化，提高其转 录和翻译效率，促进目标蛋白的表达。
酵母表达系统研究概述
酵母表达系统研究概述田晓娟【摘要】目前常用的外源基因表达系统主要分为两类:原核表达系统和真核表达系统.前者主要包括大肠杆菌表达系统和枯草杆菌表达系统,后者一般包括酵母表达系统、昆虫/杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统以及新兴的转基因植物表达系统等.在这众多的表达系统中酵母表达系统因其培养比较方便、简单、价格低廉、外源蛋白表达量高、表达的蛋白活性好、能进行翻译后修饰等诸多优点脱颖而出,成为目前最主要的外源基因表达系统.概述了常见的几种酵母表达系统的特点,并对发酵过程中影响外源蛋白表达量的因素做了探讨,以期为人们表达重组蛋白时选择合适的表达系统和获得高效的表达产物提供帮助.【期刊名称】《陇东学院学报》【年(卷),期】2018(029)001【总页数】5页(P72-76)【关键词】酵母表达系统;外源基因;蛋白表达【作者】田晓娟【作者单位】陇东学院岐伯医学院,甘肃庆阳 745000【正文语种】中文【中图分类】R379.9;Q93-33酵母常被广泛地用于生产医用或有工业前景的重组蛋白。
为了高效获得某种单一的蛋白产物，首先必须考虑目的蛋白本身的特点、宿主菌的特性等问题，以确定和优化它的最适表达系统。
酵母表达系统有众多品质优良的宿主菌株，包括酿酒酵母、毕赤酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母和Arxula adeninivorans等。
与多数复杂的真核生物不同，酵母表达系统比较经济节约，能快速地达到较高的细胞密度，产生高浓度的蛋白，并且不含有致热源、病原体和病毒夹杂物；具有良好的耐热性；能利用一些罕见的不易被其他生物利用的碳源；有些菌株还进行了一些更具优势的加工，例如人源化的糖基化、缺失一些蛋白酶等。
此外，它们使用各种各样的载体、启动子和选择性标记以供选择。
酵母因其单细胞生物的这种优势和独特的翻译后修饰的能力，使得它们已经广泛地用于生产工业化的重组蛋白(如核糖体蛋白)。
随着工业化发酵工艺知识的积累和目前基因工程技术的发展，有望设计出更符合成本效益的表达系统，以满足日益增长的对重组蛋白和糖蛋白的需求。
基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)
酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
第六页，编辑于星期三：四点 七分。
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
第二十三页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母复制型质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322。 同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列。 这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组，它 转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗传。
第二十四页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着丝 粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb的序 列。带有此着丝粒序列的质粒在酵母中的行 为类似一微型染色体，它可以稳定遗传，并 均匀地分配到子代细胞中，同时在宿主细胞 中的拷贝数很低。
特异性的重组酶，这个酶可以催化反向重复序列之间的遗传重 组。
• 酵母附加型质粒就是在这种质粒的基础上，加入酵母核
DNA序列，以及大肠杆菌pMB9的部分序列组成。故其既可 以在酵母中复制，又可以在大肠杆菌中复制。
第二十二页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母菌中天然存在的自主复制型质粒并不多， 而且相当一部分野生型质粒是隐蔽型的，因 此目前用于外源基因克隆和表达的载体质粒 都是由野生型质粒和宿主染色体DNA上的自 主复制子结构(ARS)、中心粒序列(CEN)、 端粒序列(TEL)以及用于转化子筛选鉴定的 功能基因构建而成。
第二十一页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母附加型质粒来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存在 于很多啤酒酵母株系中，功能不祥。但有一个重要特点 是，该质粒被一段长度约为599bp的反向重复序列分为 两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子控
酵母表达过程
酵母表达是指以酵母细胞为宿主来表达和生产大量的蛋白质。
其表达过程可分为以下步骤：
1. 选择合适的载体：选择适合酵母宿主的载体，通常是pYES2或pPICZα等。
2. 克隆基因：将要表达的基因插入到载体的限制性酶切位点上，构建重组质粒。
3. 转化酵母：重组质粒经过酵母细胞质膜的转录进入细胞质，通过蛋白质互作关系进入细胞核。
4. 选优获得高表达克隆：经过筛选和挑选，可以得到高表达克隆。
5. 诱导表达：经过培养，达到适合期待蛋白质大量表达的条件，即在合适的诱导剂的作用下表达重组蛋白，不断产生目标蛋白。
6. 分离和纯化：通过不同的方法和技术，将复杂的酵母系统中的重组蛋白分离和纯化出来。
酵母表达具有操作简便、表达量大、易于分离和纯化等特点，适用于大规模蛋白质生产。
酵母表达系统
产生量（g/L） 2.3 0.8 2.5 1.0 1.7 12.0 3.0 1.3 10.0 4.0
文献 [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13]
甲醇营养型母表达系统的主要不足：
1. 甲醇不适于食品工业生产； 2. 易发生火灾。
◆ 裂殖酵母表达系统的特点
件下诱导表达,每隔24小时加一次甲醇,以弥补甲醇的损 失。
8. 外源蛋白的分离纯化
将培养液进行离心,收集上清液过0.2 μm滤膜, 然 后将滤液以5 ml/min的流速过His Quick分离柱,再用洗 涤缓冲液(5 mM imidazole, 0.5M NaCl, 20 mM TrisHCl,pH 7.9)洗涤分离柱, 最后用洗脱缓冲液((0.2 mM imidazole, 0.5M NaCl, 20 mM Tris-HCl,pH 7.9))洗脱获 得外源蛋白。
分泌能力低 不能使异源蛋白正确糖基化 所表达的蛋白质的C-末端被截短
◆乳酸克鲁维亚酵母表达系统
表达载体：整合体型载体。 附加体型载体：1.胞质线性双股DNA
杀伤质粒;2. 含有乳酸克鲁维亚酵母ARS序列;3. 稳定高拷贝数2 μ样pKD1和pKL1质粒。
启动子：LAC4。
乳糖作为唯一的能源和炭源。
酵母表达系统与方法
酵母表达系统的产生
基因工程技术的发展为用微生物合成和生产外源蛋 白展示出广阔的前景。长期以来，人们用大肠杆菌作为 宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠杆菌具有若干优点， 如：遗传背景和生化特性清楚、容易操作、生长迅速、 营养需求简单等。
但大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：A：缺少真核 生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成 二硫键等；B：表达的蛋白多以包含体形式存在，需要 经过复杂的复性才能恢复构象和活性；C：背景杂蛋白 很多、纯化起来麻烦；D：表达量一般不是很高。
酵母表达系统的特点 大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。
大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。
但同时该系统还存在很多缺陷。
它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。
昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。
但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3]2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。
某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。
所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。
它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。
自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。
5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。
酵母表达体系
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶.而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子.毕赤酵母含有两种醇氧化物酶,AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。
AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白:分泌型和胞内表达.利用含有α因子序列的分泌型载体即可.翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N—连接糖基化高甘露糖型,毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基)短得多。
菌株：GS115 （ Mut+， Muts)和 KM71（Muts）分泌型载体：pPICZα A，B,and C（5’AOX1启动子，紧密型调节,甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)胞内表达型载体:pPICZ A，B，and C,一：分子克隆1。
设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B，p15—pPICZ C）2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer(10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture（各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlO up to 50μlddH2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3。