基因功能的研究方法
功能基因组研究
功能基因组研究功能基因组研究（functional genomics）是一项基于基因组学的研究领域，旨在理解基因组中的所有基因在细胞和整个生物体中的功能。
它涵盖了从基因组到表型的整个连续过程，并通过整合大规模的数据集来揭示基因组中的功能元件和与特定生物过程相关的基因。
本文将从基本概念、研究方法和应用前景三个方面来介绍功能基因组研究。
一、基本概念功能基因组研究是在基因组学基础上发展起来的一门科学，它研究不仅关注基因组的结构和组成，更关注基因组的功能和调控。
功能基因组学对于理解细胞和生物体的发育和生理过程至关重要。
它通过系统性的研究基因表达、转录调控和蛋白质互作等信息，揭示基因组中的功能元件和基因间的相互作用关系，进而深入理解生物体各个层次的调控机制。
二、研究方法功能基因组研究依赖于大规模的实验数据和先进的计算方法，主要包括以下几个方面：1. 基因表达分析：通过测定细胞或组织中的基因表达水平，了解特定基因在不同条件下的活性变化，并通过差异表达分析寻找与特定生物过程相关的基因。
2. 基因敲除和过表达：通过基因编辑技术或转基因技术，在模型生物中敲除或过表达特定基因，并观察生物表型的变化，从而推断这些基因在生物过程中的功能。
3. DNA甲基化分析：通过测定基因组中的DNA甲基化水平，揭示基因启动子区域和基因间区域的甲基化模式，进而了解基因的表达调控机制。
4. 蛋白质互作分析：通过蛋白质-蛋白质相互作用实验和生物信息学方法，构建蛋白质互作网络，从而推断蛋白质在细胞中的功能和调控模式。
5. 基因组编辑技术：包括CRISPR-Cas9等先进的基因组编辑技术，可以通过精确的基因编辑和修饰，研究特定基因对细胞和生物体功能的影响。
三、应用前景功能基因组研究在诸多领域具有广泛的应用前景：1. 疾病研究：通过功能基因组研究，可以揭示与疾病发生发展相关的基因和通路，为疾病的早期诊断和治疗提供新的思路和方法。
2. 药物开发：功能基因组研究可以识别药物靶点和副作用相关的基因，加速新药的开发和筛选。
研究基因功能的流程
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生物学研究中的基因组学方法
生物学研究中的基因组学方法基因组学是生物学领域中研究基因组的一门学科，通过研究生物体内的基因组信息来揭示生物体结构和功能的规律。
随着科技的不断发展，基因组学方法也不断更新。
本文将介绍几种常用的基因组学研究方法。
一、基因组测序基因组测序是基因组学研究的核心方法之一。
它通过分析生物体内的DNA序列来获取基因组信息。
目前常用的测序方法有Sanger测序（链终止法）和高通量测序（下一代测序）。
Sanger测序是一种传统的测序方法，其优点是准确性高，缺点是测序速度慢且成本高。
高通量测序则可以同时测序大量的DNA分子，并具有高通量、高精度和低成本的优势。
二、基因组组装基因组组装是基因组学研究中的一个重要步骤，它将测得的DNA 序列片段进行拼接，重新构建出完整的基因组序列。
基因组组装的难点在于大量的DNA序列片段之间存在交叉、重叠等问题，需要借助计算机算法进行拼接。
目前常用的组装软件有SOAPdenovo、Velvet、SPAdes等。
三、基因注释基因注释是对基因组序列进行功能分析和解读的过程。
它通过比对已知的基因库、蛋白质库和功能数据库，根据序列的相似性和保守性等特征来预测基因的功能。
基因注释可以帮助研究人员理解基因的功能和作用，从而进一步研究其在生物体内的生理过程和疾病发生发展中的作用。
四、转录组学转录组学是研究生物体基因表达的一门学科。
通过分析生物体中mRNA的表达水平和转录变异，可以了解基因在不同组织、不同发育阶段和不同环境条件下的表达情况。
转录组学研究方法主要包括RNA测序和基因表达谱分析等。
RNA测序可以全面地检测和定量所有转录本，而基因表达谱分析则可以帮助研究人员挖掘潜在的调控关系和功能分析。
五、蛋白质组学蛋白质组学是研究生物体内蛋白质组成和功能的一门学科。
通过对生物体蛋白质的组成、结构和功能进行研究，可以揭示生物体内的调控网络和信号传导途径。
蛋白质组学研究方法主要包括质谱技术和蛋白质互作网络分析等。
研究基因功能的方法
研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
➢ 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同的祖先基因可能
存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。 将Ac因子转座酶的编码基因与组成型启动子如35S构建成嵌合基因表达载体，由于除去了转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编
植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外
源基因在转基因植株中成功表达。
➢植物中有许多转座子系统，它们的转座机
制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-
的贡献，也可列出很长的一串名单。 Bait protein。
基因功能测定方法
基因功能测定方法
基因功能测定就像是在生命的神秘宝库里寻宝！咱先说说步骤呗。
首先得确定要研究的基因，这就好比在茫茫大海中找到那艘有宝藏的船。
然后可以通过基因敲除、基因过表达等方法来观察生物体的变化。
比如基因敲除，就像是把一个特定的工具从工具箱里拿走，看看没了这个工具，机器还能不能正常运转。
注意事项呢？那可不少！一定要精准地操作，不然就像射箭没瞄准，白费力气。
而且要确保实验环境稳定，不能一会儿热一会儿冷，那可不行。
说到安全性，这可是个大问题。
就像走钢丝，得小心翼翼。
在进行基因功能测定时，要确保不会对生物体造成不可挽回的伤害。
稳定性也很重要，不能今天测出一个结果，明天又变了。
这就像盖房子，得稳稳当当的，不能摇摇晃晃。
那应用场景可多了去了！在医学领域，可以帮助我们了解疾病的发生机制，找到治疗的新方法。
这不就像在黑暗中找到了一盏明灯吗？在农业领域，可以培育出更优良的品种，提高产量。
哇塞，这多棒啊！优势也很明显，能够深入了解生命的奥秘，为人类的发展做出巨大贡献。
实际案例来啦！比如研究某种疾病相关的基因，通过测定其功能，找到了新的治疗靶点。
这就像在迷宫中找到了出口，让人兴奋不已！
基因功能测定真的超级厉害！它就像一把神奇的钥匙，能打开生命奥秘的大门。
让我们一起探索这个神秘的领域吧！。
基因功能研究方法
3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
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3.3 核酶技术
核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分 子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解 与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构， 单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部 位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头 状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。
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芯片的制作
• 目前常用的基因芯片制作方法：
•
接触点样法、喷黑法、原位合成法。
• 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结 构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
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• 喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样 需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在1cm2面积上可喷射10000个点。
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原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
几种常用的基因功能分析方法和工具
几种常用的基因功能分析方法和工具（转自新浪博客）一、GO分类法最先出现的芯片数据基因功能分析法是GO分类法。
Gene Ontology（GO，即基因本体论）数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它包含38675 个Entrez Gene 注释基因中的17348个，并把它们的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。
在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。
这样，GO中每一个分类术语都以一种被称为定向非循环图表（DAGs）的结构组织起来。
研究者可以通过GO分类号和各种GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。
在芯片的数据分析中，研究者可以找出哪些变化基因属于一个共同的GO功能分支，并用统计学方法检定结果是否具有统计学意义，从而得出变化基因主要参与了哪些生物功能。
EASE（Expressing Analysis Systematic Explorer）是比较早的用于芯片功能分析的网络平台。
由美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发。
研究者可以用多种不同的格式将芯片中得到的基因导入EASE 进行分析，EASE会找出这一系列的基因都存在于哪些GO分类中。
其最主要特点是提供了一些统计学选项以判断得到的GO分类是否符合统计学标准。
EASE能进行的统计学检验主要包括Fisher 精确概率检验，或是对Fisher精确概率检验进行了修饰的EASE 得分（EASE score）。
由于进行统计学检验的GO分类的数量很多，所以EASE采取了一系列方法对“多重检验”的结果进行校正。
这些方法包括弗朗尼校正法（Bonferroni），本杰明假阳性率法（Benjamini falsediscovery rate）和靴带法（bootstraping）。
同年出现的基于GO分类的芯片基因功能分析平台还有底特律韦恩大学开发的Onto-Express。
2002年，挪威大学和乌普萨拉大学联合推出的Rosetta 系统将GO分类与基因表达数据相联系，引入了“最小决定法则”（minimal decision rules）的概念。
基因研究方法
Cossins A and Crawford DL. 2005. Nat. Rev. in Genetics, 6, 324-333.
特异性功能基因的筛选和寻找方法:
1）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选 2）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选 3）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位 4）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究
对表达于特定组织、特定阶段的功能基因 的筛选
一、文献查阅
二、充分利用GeneBank、SymAtlas(/SymAtlas/)、 ZFIN等网上公共资源 a. 直接查阅基因表达信息 b. 对大量的est资源进行利用和分析:
如IH_ZGC_15: embryo, 2-8hpf NIH_ZGC_18: embryo, 18-20hpf NCI_CGAP_Zemb2: embryo, 24hpf GISZF001: embryo, 0-72hpf NCI_CGAP_Zemb3: embryo, 72hpf Zebrafish adult retina cDNA: adult eye, retina 1-2 year old NIH_ZGC_9: eye, 72hpf NIH_ZGC_22: Gill NIH_ZGC_17: adult heart
3’
5’ cDNA
Enzymatically add tag sequence to cDNA 3’ end
3’ 3’
5’
PCR amplify with primers to tag sequence and ßgeo
ß geo primer 2
Clone and sequence to identify Gene X
in HDAC2 null
基因组学的研究方法及其应用
基因组学的研究方法及其应用随着科技的不断发展，基因组学成为了一个备受关注的领域。
基因组学研究基因组的组成，结构和功能，为人们探究生命的奥秘提供了一个重要的途径。
本文将介绍基因组学研究的方法以及其在生命科学，医学，生态学等领域的应用。
1. 基因组学研究的方法1.1 DNA测序DNA测序是基因组学研究中最重要的方法之一。
它利用各种分子技术和计算生物学方法，从样品中提取DNA，并将其转化为数字信息，以便更好地研究。
目前，DNA测序中最常用的方法是高通量测序或称为下一代测序。
这种方法的基本原理是将DNA分成小片段，放在反应室中反应，然后通过测序仪器的扫描，将得到的序列合并起来，形成完整的DNA序列。
这种方法可以大大提高测序的效率和准确性，是当前基因组学研究的主要方法之一。
1.2 生物信息学生物信息学是将计算机科学和生物学相结合的一门交叉学科，它是基因组研究中必不可少的方法。
通过生物信息学技术，可以分析大量的DNA序列数据，以发现基因序列中的功能元素和特征。
生物信息学包括DNA序列分析，基因组注释，蛋白质结构预测等诸多领域。
其中最常用的技术是BLAST（Basic Local Alignments Search Tool），即在数据库中寻找相似性序列的方法。
这项技术极大地促进了我们对基因组的了解，并使基因组学从理论转向实际应用。
1.3 基因编辑技术基因编辑技术是近年来兴起的一项技术，它可以对DNA序列进行精确的修饰和改变，如插入、删除或替换特定的碱基。
这种技术有许多不同类型，如CRISPR-Cas9系统等。
基因编辑技术可以很好地作为基因组学研究的工具。
基因编辑技术在分子生物学、遗传学和医学研究中，是一种非常有效的手段。
通过基因编辑技术，可以发现基因功能和互作，并从中推断更多的生物学信息。
2. 基因组学在生命科学中的应用2.1 人类基因组计划人类基因组计划是基因组学研究中最激动人心的产物之一，它标志着人们对人类基因组潜力的深入研究。
功能基因组学的研究方法
功能基因组学的研究方法
功能基因组学可有趣啦，那它都有啥研究方法呢？
一种是基因表达谱分析哦。
这就像是给基因们做个大普查，看看在不同的情况，比如说细胞在健康状态和生病状态下，哪些基因特别活跃，哪些又变得很安静。
科学家们可以用像微阵列技术这样的方法，就像是在一个小芯片上排满了基因的小探子，来检测基因的表达水平呢。
这就好比是给基因们做一个大型的社交活跃度调查，知道它们在不同场景下的表现。
还有基因敲除和基因敲入技术呀。
基因敲除就像是把某个调皮捣蛋或者可能有特殊作用的基因从细胞这个大家庭里赶出去，然后看看细胞会发生什么变化。
要是这个细胞突然变得不正常了，比如说不能正常分裂或者对某种药物特别敏感了，那就说明这个被敲除的基因可能有着很重要的功能哦。
而基因敲入呢，就是把一个新的基因或者改变后的基因放进细胞里，看看它会给细胞带来什么新的特性，这就像是给细胞这个小世界里引进了一个新居民，看看大家怎么相处。
RNA干扰技术也是很厉害的研究方法呢。
它就像是一个小小的基因干扰器，可以特异性地让某些基因的表达降低。
想象一下，这个技术就像一个调皮的小精灵，悄悄地跑到基因旁边，让基因不能好好地发挥作用，然后我们就能通过细胞或者生物体的变化，来推断这个基因本来的功能啦。
蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究也不能少。
基因最终是要通过蛋白质来发挥功能的嘛。
科学家们就像侦探一样，去寻找哪些蛋白质之间是好朋友，它们之间互相合作或者互相调节。
可以用酵母双杂交系统这样的方法，就像是给蛋白质们创造一个特殊的社交场所，看看谁和谁会互相结合，这样就能知道基因在蛋白质这个层面上是怎么协同工作的啦。
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1.3 基因敲除主要应用领域及国内外研究 进展
基因敲除的应用领域主要有： ①建立人类疾病的转基因动物模型，为医学 研究提供材料； ②改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功 能； ③治疗遗传病； ④改造生物、培育新的生物品种。
ES细胞基因敲除途径建立转基因小鼠技术 的成熟，首次使体外精细的基因操作与小 鼠的整个生长发育和生命过程得到了直接 的结合，为探讨高等动物基因组结构和功 能提供了有效的方法。 由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对 哺乳类生物学的各领域，包括发育生物学、 癌生物学、免疫学、神经生物学和人类遗 传学产生了极大影响。 理论上，基因敲除可适用于任何能产生ES 细胞的物种，将来可在小鼠基因敲除成熟 的基础上开展其它实验动物的基因敲除工 作。
胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于 高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列 自然发生同源重组的机率非常低，约为百万 分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来 是一件非常困难的工作。因此，同源重组的 筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的 关键问题。 目前已有多种筛选方法，其中1988年犹它大 学的Capecchi教授的研究组发展的"正负双向 选择系统"适用范围宽且效率较高。
通过上述种种方法得到的携带失活基因的品系与 个体后，下一步工作就是检测突变体表型以便指 认未知基因的具体功能。这一步也会遇到难题， 生物表型范畴很广。 即使单细胞的酵母，要确认一个未知基因对表型 的贡献，也可列出很长的一串名单。
至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综 合性，区分其准确的功能更加棘手。
2．转座子突变库构建
转座子标签法又称基因标签(gene tagging)， 通过构建插入突变库系统，分离与克隆功 能基因与调控顺序。这一策略主要依据以 下技术： 植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外 源基因在转基因植株中成功表达。
植物中有许多转座子系统，它们的转座机 制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。 转座子可以发生回复突变，从插入的座位 脱离，使突变系重现野生型表型。
③ 治疗遗传病 这包括去除多余基因或修饰改造原有异 常基因以达到治疗的目的。 ③ 改造生物、培育新的生物品种 细菌的基因工程技术是本世纪分子生物 学史上的一个重大突破，而基因敲除技 术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。 这项新技术在基础理论研究及实际应用 中都将有着广阔的应用前景。
1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
一、计算机预测基因功能
计算机预测基因功能的依据仍然是同 源性比较。同源基因都有1个共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序。 同源基因可以分为2类：
种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之 前的同一祖先。 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种 生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的 不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形 成之后，也可能出现于物种形成之前。 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因 为这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但 它们有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸 位臵是相同的。 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从 数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的 相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
第十章.基因功能的研究方法 （一）
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out） 1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
② 改造动物基因型，鉴定新基因和/或 其新功能，研究发育生物学
深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命 各期的表现，可以得到详细的有关该基因 在生长发育中的作用，为研究基因的功能 和生物效应提供模式。 例如，目前人类基因组研究多由新基因序 列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在 小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化。 目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、 LTD 有缺陷的基因敲除动物，发现多种 基因在学习、记忆的形成过程中必不可少。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因； 2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。 3. 一致性常指同一位臵同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法
三、其他的基因功能研究方法 １．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization)
2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质 之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题
就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。 一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们 所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如 大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前 已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传 学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突 变鉴定，但实际上还有很多空白。 大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知 道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母， 所知更少，仅为30%。
同源性分析可以给出整个基因或 某一区段功能的信息
同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA 顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多 种，而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要 比核苷酸的差异大的多。 以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更 加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的 是BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子 邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会 得到回音。
长度 末端IR 768 23 1327 41 1428 18 1195 16 1329 22 1531 9
靶位DR 9 95 （12） 4 9 9
插入选择 随机 热点 AAAN20TTT 热点 TNAGCN 热点
2.2 实验步骤
将Ac因子转座酶的编码基因与组成型启动子
如35S构建成嵌合基因表达载体，由于除去了
转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编码 基因不能自我转座。这一表达载体转化细胞获
得的再生植株为Ａ（sAc）。
外显子捕获载体构建：在转座子的边界顺序与
标记基因之间插入内含子剪接受体顺序，将它
们转化细胞获得再生植株B。
③ 将植株Ａ和植株B杂交，在转座酶的作用下来自植
株B的转座子可以切离与转座。当它们插入到某一 外显子中时，基因转录加工后可能获得含正确读 框的mRNA。根据突变表型与标记基因的共分离 筛选转化无性系，通过自交可得到纯合的不含转 座酶基因的插入突变系。 ④ 增强子捕获载体将核心启动子TATA盒框与标记 基因编码顺序连接，然后在其两侧安装转座子边 界，转化细胞获得再生植株C。将植株A与植株C 杂交，在转座酶的作用下来自植株C的转座子可以 转移到增强子下游启动标记基因表达。采取类似4 的方法分离纯合的插入突变系，进一步检测增强 子的组织特异性表达场所。
有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出 现局部相似的区段。这种情况表明，2个无 亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相 似的顺序是功能的核心区域。 虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却 有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔， 在进化中一方面发生独立突变，另一方面又 因基因组重排成为新基因的组成部分。例如 信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基 本的功能域，即接受信号的功能域和传达信 号的激酶域。
目前应用的最成功的是玉米的Ac-Ds转座因 子系统。基因标签突变库的工作原理如下： 玉米色粒调控元件 Ac-Ds 系统：第9 染色体 C 基因：色素合成基因。 Ac 基因：自主移动的调节因子，4.5 kb， 5 个exon， 编码转座酶。 Ds 基因：非自主移动的受体因子， 0.5－ 4.0 kb，与Ac 有同源序列 ，插入引起色素 不能合成。
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。 1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源 重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。 到1987年，Thompsson首次建立了完整的 ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年 中，基因敲除技术得到了进一步的发展和 完善。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
① 建立人类疾病的转基因动物模型，为医学 研究提供材料 基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分 子基础及诊断治疗的重要实验材料。如 1989年囊性纤维化病（CF）的致病基因 （CFTR）被成功地克隆；1992年成功建立 了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，为 CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以 顺利通过了基因治疗的动物试验；于1993 年开始临床试验并获得成功。
二、实验确认基因功能
同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能 分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将 同源性研究的结果进一步外延。 如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难 的问题之一。 大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于 从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究 是远远不够的。 基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系 列反应。 传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因； 现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。 因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基 因相关的表型。