光学衍射极限的突破
突破衍射极限——探索纳米世界的超分辨显微技术
突破衍射极限——探索纳米世界的超分辨显微技术作者：李德增陈波来源：《化学教学》2015年第01期摘要：介绍了2014年诺贝尔化学奖，并以此为背景围绕着如何突破衍射极限提高分辨率这一核心问题，通过衍射极限产生的原因、突破的途径及新型显微技术发展的历程及特点等几个方面展开阐述，以期更好地认识新型光学显微技术在探索纳米世界时的作用和意义。
关键词：诺贝尔化学奖；衍射极限；瑞利判据；超分辨率；荧光显微技术文章编号：1005–6629（2015）1–0012–05 中图分类号：G633.8 文献标识码：B1 引言2014年10月8日，2014年度诺贝尔化学奖揭晓，美国科学家埃里克·白兹格（Eric Betzig）、威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔（William E. Moerner）和德国科学家斯特凡·W·赫尔（Stefan W. Hell）三人获奖，以表彰他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成就。
长期以来，光学显微镜的分辨率被认为是有极限的，它不可能超过二分之一个光波长度，对于可见光波长而言，约200纳米。
1873年德国物理学家阿贝（E. Abbe）指出衍射极限是传统光学显微镜存在最大分辨率的物理限制。
然而，在荧光分子的帮助下，今年诺贝尔奖化学奖的几位获得者巧妙地绕开了这种限制，并突破了这一极限。
他们划时代的贡献将传统光学显微镜技术带进了纳米领域，使光学显微镜步入了纳米时代。
根据纳米荧光显微技术，科学家实现了活体细胞中单个分子通路的可视化。
他们能够观察到分子是如何在大脑神经细胞之间生成神经突触；还可以追踪帕金森病、阿尔兹海默症和亨廷顿症患者体内相关蛋白的累积情况等等。
然而科学家在最小分子水平上对活体细胞细节进行研究时，却受到了限制。
由于今年三位诺奖得主的贡献，我们可以利用突破衍射极限的光学显微镜对纳米世界一探究竟。
这次获奖的是两项独立的技术。
第一项是Stefan Hell于2000年研制的受激发射损耗（STED）显微技术。
生物荧光成像——突破光学衍射极限汇总
第３５卷第９期２００８年９月中国激光Ｖ０１．３５，Ｎｏ．９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００８ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬ０ＦＬＡＳＥＲＳ文章编号：０２５８—７０２５（２００８）０９—１２８３—２５超分辨远场生物荧光成像突破光学衍射极限毛峥乐王琛程亚（中国科学院卜海光学精密机械研究所强场激光物理国家重点实验室，上海２０１８００）摘要长期以来。
远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤，可探测样品内部等优点，一直是生命科学中最常用的观测ｊ＝具。
但由于衍射极限的存在，使传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为２３０ａｍ和ｉ０００ｎｍ。
为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征，提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求，在远场荧光显微镜的基础上，科学家们已经发展出许多实用的提高分辨率甚至超越分辨牢极限的成像技术。
例如，采用横向结构光照明提高横向分辨率到约１００ｎｍ．利用纵向驻波干涉效应将纵向分辨率提高５～１０倍。
然而，直到在光学荧光显微镜中引入非线性效应后。
衍射极限才被真正突破。
如受激荧光损耗显微镜利用非线性效应实现了３０～５０ｎｍ的三维分辨率。
另外应用荧光分子之间能量转移共振原理以及单荧光分子定位技术也可以突破衍射极限，甚至可以将分子定位精度提高到几个纳米的量级。
关键词光学；超分辨；远场光学荧光显微镜；生命科学；非线性效应；单分子中图分类号ＴＨ７４２．６５文献标识码Ａｄｏｉ：１０．３７８８／ＣＪＬ２００８３５０９．１２８３ＳｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＦａｒ－ＦｉｅｌｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＢｉｏ－ｌｍａｇｉｎｇ：ＢｒｅａｋｉｎｇｔｈｅＤｉｆｆｒａｃｔｉｏｎＢａｒｒｉｅｒＭａｏＦｉｎｅＺｈｅｎｇｌｅＷａｎｇＣｈｅｎＣｈｅｎｇＹａ（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｉｇｈＦｉｅｌｄＬａｓｅｒＰｈｙｓｉｃｓ，ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＯｐｔｉｃｓａｎｄＭｅｃｈａｎｉｃｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１８００，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔｏｗｉｎｇｔＯＦａｒ－ｆｉｅｌｄｏｐｔｉｃａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｃｏｐｙｈａｓｂｅｃｏｍｅｉｔｓｕｎｉｑｕｅｃａｐａｂｉｌｉｔｙｔＯａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｏｏｌｉｎｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｆｏｒａｌｏｎｇｔｉｍｅｌａｒｇｅｌｙｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ，ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ（３Ｄ）ｉｍａｇｉｎｇｉｎｓｉｄｅｃｅｌｌｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｗｉｄｅ－ｆｉｅｌｄｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｉＳｌｉｍｉｔｅｄｔＯａｂｏｕｔ２３０ｎｍｌａｔｅｒａｌｌｙａｎｄ１０００ａｍａｘｉａｌｌｙ。
突破衍射极限地超高分辨率成像技术发展 (修改)
结课论文题目突破衍射极限的超高分辨率成像的技术进展学生学号学院专业班级二〇一五年十二月一引言1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久的历史，但一直以来，光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200 nm。
后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，但是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。
值得庆贺的是近年来，超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达到了20 nm以下。
其中德国科学家Stefan Hell、美国科学家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出贡献获得了2014年的诺贝尔化学奖。
在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用，并对诸位大师致以敬意。
1.2技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y平面分辨率与Z轴分辨率大小来判定，分辨率越高数值越小。
下表是各种显微成像技术的分辨率指标。
普通光学显微镜200-300 500-700 4Pi显微镜100-150 STED显微技术50-70STED+4技术50 50 PALM技术20 303D STORM技术20-30 50-60 dSTORM技术30 502D SSIM技术503D SSIM技术100 200 电子显微镜0.05X光衍射仪0.03-10二衍射极限2.1 衍射极限我们能看到什么？看到多小的围？看得有多清楚？几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。
人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。
1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄的软木塞切片。
虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。
此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。
STED显微镜
4pi显术简介
4pi也是HELL发明的.而样品的成像通过两个物镜的 亚衍射尺寸的光斑来扫描样品实现的.
缺点 1.需要强光,能量利用率低. 2.过强的光还会引起光致漂白. 3.略贵 4.应用范围较窄 受激损耗的原理也可以应用在其它地方,比如近年来 在纳米光刻领域引起重点关注的双光束刻录技术.
受激发射损耗的基本原理
如果你有一根粗笔，怎么能够用它画细线？ 买块橡皮。先画个粗的，再擦去两边的多余部分. STED用的就是这个原理。 使用一种合适的激光,仅激发一个点的荧光基团使其 发光,然后再用一个面包圈样的光源抑制那个点周围 的荧光强度,这样就只有一个点发光并被观察 了.
受激发射损耗的基本原理
损耗光的波长要选在荧光发射谱的红边,以避免重激 发,激发光与损耗光的时间差要选的合适,既保证有 荧光产生,又能保证一定的损耗几率.
STED荧光显微镜示意图
环形的损耗光是利用一个位相片进行光位相调制， 最终在焦点处形成环形光分布。 按顺序先给激发脉冲(2ps左右)，等荧光物质跃迁上 去了,马上给一个受激辐射波长的脉冲（250ps左 右），用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射，探测 过来的自发辐射信号,移动样本就可以三维成像. 起初的主要用于突破STEM显微镜主要用于突破横 向衍射极限 ,横向分辨率可达70nm,而轴向分辨率还 较低, 因为有限的孔径角导致轴向分辨率降低. 近来将和4pi显微术互补性地结合 ,在技术上扩大了 有效孔径角.目前已经获得了100nm的轴向分辨率.
某种染料的光谱.图中蓝色曲线为激发光谱,红色曲线为发射光 谱.620nm~850nm均有可能,670nm最大.这是自发辐射.
STED的发明
STED 受激发射损耗显微术是在 1994 年被施特芬-赫 尔开发出来的,当时赫尔正躺在研究生公寓的床上看 一本有关光学量子理论的书,突然灵光一闪,就发明 了STED. Stefan W. Hell（生于1962年)物理学博士学位，1990 年开始在海德堡大学学习，后留在海德堡欧洲分子 生物学实验室研究.1993年到1996年，他曾作为高级 研究员，在芬兰土尔库大学开发受激发射损耗显微 镜 .1996年，他在哥廷根的马克斯普朗克生物物理 化学研究所，在那里他建立了他目前的研究小组， 致力于高分辨率显微镜的研究。
光学衍射极限的突破
光学衍射极限的突破纪岚森，仵云龙，李岷池，贺杰（青岛大学物理科学学院2011级材料物理1班）摘要：由于光学衍射极限的存在，使得在电子科技上边很难达到人们期望的高分辨率，然而光学衍射极限并不是不能克服的。
除了减小光波长与增加孔径外，我们还可以通过改变光路来突破艾里斑衍射极限。
减小艾里斑在很多的方面都有极其重要的意义，这里讲述的是艾里斑对显微镜技术突破的一些介绍。
关键词：艾里斑，显微镜，光学衍射极限1引言：在大量的电子图像应用领域，人们经常期望得到高分辨率（简称HR）图像。
高分辨率意味着图像中的像素密度高，能够提供更多的细节，而这些细节在许多实际应用中不可或缺。
例如，高分辨率医疗图像对于医生做出正确的诊断是非常有帮助的；使用高分辨率卫星图像就很容易从相似物中区别相似的对象；如果能够提供高分辨的图像，计算机视觉中的模式识别的性能就会大大提高。
同时随着生命科学的迅猛发展三维光学显微技术也已经成为研究生命过程的一种极为有效的工具，但是传统的基于荧光共焦技术的成像方案受到光学衍射极限的限制，其横向和纵向的数量级均在百纳米，因而无法满足科学技术发展的需要，利用各种非线性光学荧光激发方案已经打破光学极限的方案已经实现，然而这种光路较为复杂，通过其他的方法构造出来的奇异光线也是能够实现科学家长期最求的三维远场光学的超分辨成像。
根据瑞利衍射极限任意的光学系统成像就会在像方产生一个光斑，而这个光斑是无法通过改变显微镜的结构来实现的，也就是说，无论是共焦显微镜或是宽场显微镜这个光斑都是存在的，而这个光斑就是我们所说的爱里斑(Airy disc) 由于光的波动性，光通过小孔会发生衍射，明暗相间的条纹衍射图样，条纹间距随小孔尺寸的减少而变大。
大约有84%的光能量集中在中央亮斑，其余16%的光能量分布在各级明环上。
衍射图样的中心区域有最大的亮斑，称为爱里斑。
爱里斑的角度与波长(λ)及小孔的直径(d)满足关系：sinθ=1.22λ/d，θ即第一暗环的衍射方向角（即从中央亮斑的中心到第一暗环对透镜光心的张角），因为θ角一般都很小，有sinθ≈θ，故θ≈1.22λ/d。
论如何突破光的衍射极限,提高光学及电子显微镜的分辨率
学显微镜的分辨率是 ２００ｎｍ。若要提高分辨率就要选择更小波 衍 射 图样 。
长 的电子显 微镜 ，分辨 率可达 ０．５ｎｍ。
为什 么光学显微镜的分辨率是受限于＇ Ⅱ丁见光的波长 ，就是
此光 学显 微镜 的分 辨 率是 ２００ｎｍ。若要 提 高分辨 率就要 选择 更 小波 长的 电子显 微镜 ，分辨 率可达 Ｏ．５ｎｍ。本 文探 讨如何 突破 广德
衍射 极 限 ，从 而提 高光学级 电子 显微镜 的 分辨 率 。
关键 词 ：光 的衍射 ；显微镜 分辨 率 ；提 高
中图分类 号 ：ＴＨ７４２
离 越小 ，分 辨率 越 大 。
于光波的波长时，光子容易绕射过去继续 向前直线传播或绕射
光 学显 微镜 的分辨 率是 受限 于可 见光 的波 长 ，就 是 说 当被 并 撞击 到障 碍 物边 缘 的 正 面或 背 面形 成 反射 从 而 形 成 偏 离 几
观察 的物体 小于 可见 光波长 １／２时 ，就无法 在被 观察 到 。因此 光 何 光学 中直 线传 播 的光 ，并在 屏幕 上 相叠 加 形成 的明 暗 条纹 的
时 ，光才能 发生 明显 的衍射 现象 。由于 可见光波 长范 围为 ４ｘｌ０－Ｔｍ 小于 可见光 波长 １／２时 ，就无法 在被 观察 到 ？
至 ７．７ｘｌ０－Ｔｍ之 间 ，所 以 日常生活 中很少 见到 明显 的光 的衍射 现 由 以上 实 验可 知 ：当 小孔 （窄缝 ）或 障 碍 物 的尺 寸 比光波 的
缝 、一 根细 丝时 ，可以清 楚地 看到 光的衍 射 。用单 色 光照射 时效 宽度 。当小 车的 宽度 大于公 路 的宽度 的时候 ，由于 空间 不够 ，车
果好 一 些 ，如果 用复 色光 ，则 看到 的衍射 图案 是彩 色 的。
衍射极限
衍射极限是指一个理想点物经光学系统成像，由于衍射的限制，不可能得到理想像点，而是得到一个夫朗和费衍射像。
因为一般光学系统的口径都是圆形，夫朗和费衍射像就是所谓的艾里斑。
这样每个物点的像就是一个弥散斑，两个弥散斑靠近后就不好区分，这样就限制了系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。
这个限制是物理光学的限制，是光的衍射造成的。
这种衍射限制本质上来源于量子力学中的测不准关系限制。
对于给定频率的光子，当它在某个方向上的动量范围给定时，它的分辨率也就定了。
一般当一个艾里斑的中心和另一个艾里斑的边缘暗环刚好重合时，认为两个像斑刚好能够分辨（瑞利判据）。
这一现象用傅立叶分析理论可解释为：携带物体信息的入射光波的傅立叶分量中，较大的横向分量对应着高频成分，代表着物体的细节部分；但含高频横向分量的光波因满足2222x y k k w c +〉 (k x 、k y 为波矢量K 在x和y 方向分量，ω为光波角频率、c 为光速，传播方向为z 轴)而成为倏逝波，倏逝波在传播过程中因振幅呈指数衰减而无法到达像面，不能参与成像，造成物体细节部分的丢失，因而普通透镜的成像总是有缺陷的。
图1. 艾里斑图形（三维强度值和和平面图像）衍射极限公式是sinθ=1.22λ/D 。
其中θ是角分辨率，λ是波长，D 是光圈直径。
当θ很小时，sinθ约等于tanθ，约等于d/f ，其中d 是最小分辨尺寸，f 是焦距。
推导出d/f=1.22λ/D 。
显微镜的可分辨的最小线度为：δy=0.61λ/N.A.，其中N.A.为镜头的数值孔径。
目前，普通显微镜的分辨率一般为200nm 以上。
突破衍射极限：在物理概念上从只使用实数推广到使用虚数；从物理上讲，属于从传统中那样使用实光子辐射场推广到使用非辐射的虚光子场（不在光子质壳上的光子都是虚光子），前者就是传统中的光学成像，后者则属于近场成像。
产生电磁波的源都可以称为天线。
天线产生辐射远场和非辐射近场，前者包括我们通常看到的一束光，它在真空中传播，幅度不会衰减；后者则随空间距离迅速衰减，主要局域于天线附近，属于局域性的电磁波，或者附在材料表面附近的“表面波”。
突破光学衍射极限,发展纳米光学和光子学材料及器件
学材料及 器件 的发展 正是迎合这种 快速和 高密度信 息技 术 的需求。先进 的纳米光学和纳米 光子 学器件 应该是 快速 、高分辨率和 高集成 的 ，形成各 类光 学和光子 学芯片和盘片。先进 的材料是 突破各 类功能芯 片的关键 。在各类 电子 学以及光 学和光 子学的 纳米芯片和器件制
１ ０１ 年 第７ 第５ ６ （ 第３ － 期 ） ６２ ０ 卷 －期 总 ８ ３９
５ｎ ０ ｍ的分辨 率 ，不仅需 要紫外 光源 ，数值孔 径 要 ＞ １５ （ 没 式 ） 。短 波 长 激 光 器 和 大 数 值 孔 ． 浸 径透镜 都 已经 接近 了 目前 技术 所 能达 到的极 限 或者 成本太 高 ，例 如 ，一 台深 紫外 浸没 式光 刻 机 的价格达０ ～０ 亿美 元 ，所 以传 统技术路线 ． ． ２ ３ 已经面 临着 巨大 的挑 战 。超 分辨 技术 是指 突破 瑞 利衍 射极 限的技术 ，一直 是光 学领 域 的主要 研 究 课 题 。 ２ ０ 年 美 国光 学 学 会 提 出 ，超 分 辨 ０９ 技术 是２ 世纪光 学发 展 的重大 突破 点 ，需要 发 １ 展分辨 率达 入 ｌ～ 入／０ ／０ ２ 的新方法 、新 原理和 新 技术 。 目前 已经发 展 出 多种 超 分 辨技 术 ，如远 场
高 ， 已接 近 可达 到 实 用 化 纳 米 光 刻 的极 限 。 突破 光 的衍 射 极 限 ，在 光 的 远 场 和 近 场 应 用 超
分辨 率技 术 ，是 当前 重要 的前 沿课题 。发展 用 于光 学超 分辨率的各种 功能材料 以及新 的刻 录介 质 材 料 是 这 一 新 的 重 大创 新技 术 的 关键 。
般 需 要 波 长 短 于 ２ ０ ｍ的 光 源 ， 要 达 到 ０ｎ
突破衍射极限的超透钙
分将永远得不到 ． 这一现象 的原 理是 ， 这些消失 的细节信 息 是 由物体发射 出来的高频 波所 携带 ， 而这些 亚 波长 的高 频
波都是呈指数衰 减的倏 逝波 ， 它们 在极小 的距 离 内就完 全
衰减完 ， 因而无法在远处得 到这 些细节信息 ， 无法 得到完 美 成像 ， 就决 定了传统光学成像 系统的分辨率极 限． 这 数百 年 来人们都在努力 尝试突破这个极 限， 直至 ２ ０ ００年 Ｐｎ ￣ 提 ｅｄ
出一块负折射率 材料平板可 以被视 为“ 美透镜 ” 在这 块 完 ， 平板里面倏逝 波不再是呈指数衰减 ， 而是被增强 ， 这使得 获
得亚波长 的细节 信息成为可 能 ．
１ 超 透 镜 物 理 原 理
自蝴 瞄隘 辫ｉ掰 镗 。 ｌ 鞠 Ｉ 鳆 醢
Ｉ
当一束 光照射到一个 物体 时 ， 物 体散射 出来 的 的各 该 种具有 不同波矢 的波便 记录 了该物 体的信 息 ， 这些 散射 出
然而以上进行 的超 透镜 实验成像也只是局域在像平 面
的近场范 围内 ， 了超透镜倏逝波将会继续衰 减下去 ， 出 因而 基于此原理设计 的平 板超透 镜也 只能是 近场 的． 们要 将 人
光波照射两宽为 ３ｎ 相距 ｌ５ ｍ的线 对． （ ） ５ｍ， ｌｎ 图 ９ 是其 扫 描电子显微镜 （ Ｅ 图像 ， 中则是 有和没有 “ ｙｅｌ ｓ Ｓ Ｍ） 图 Ｈ ｐｒ ｎ ” ｅ 所 得到的 比较结果 ， １） 图（０ 是对应于图（ ） ９ 中的场强分布．
中的共振 ， 避免不 了其 固有 的损失 ， 因而并不能实现真 正意
义上的完美成像． 由于超分辨成像十分精细敏感 ， 并不十分 成熟的纳米制技术也势必限制了成像的分辨率．
光学超分辨突破光学衍射极限的挑战
光学超分辨突破光学衍射极限的挑战光学超分辨技术一直以来都面临着一个重大挑战，即光学衍射极限的限制。
根据光学原理，当物体的尺寸小于光波的波长时，光学显微镜无法观察到其细节。
然而，随着科技的不断发展，人们对于超越光学衍射极限的需求也越来越迫切。
在近年来，随着光学超分辨技术的不断突破，一种全新的视野正在展开。
光学超分辨技术的突破主要依赖于两种关键技术，即近场光学显微镜和荧光标记。
1. 近场光学显微镜近场光学显微镜是一种能够绕过光学衍射极限的显微镜技术。
光学显微镜为我们提供了观察微观世界的途径，然而，其分辨率一直受到限制。
近场光学显微镜通过在物体和探测器之间引入纳米刻度的探测器探头，使得探测器能够接近或直接接触被观察物体表面，从而绕过了光学衍射极限。
这种技术的发展极大地拓宽了我们对微观领域的认知。
2. 荧光标记技术荧光标记技术是另一种突破光学衍射极限的重要技术。
利用荧光标记，科学家们能够将荧光标记剂附着在被观察对象的表面或内部，从而对其进行标记。
这些荧光标记剂能够发光，并且能够通过特定的光源进行激发。
通过对荧光标记的观察和分析，科学家们能够获得超过光学衍射极限的分辨率。
这一技术的应用广泛，涵盖了生物医学研究、纳米材料研究等领域。
然而，值得注意的是，光学超分辨技术的突破并非毫无限制。
其存在一定的条件限制和技术难题。
例如，对于近场光学显微镜来说，由于纳米刻度探测器的制造和操作难度较大，其运用仍面临挑战。
同时，荧光标记技术也需要克服标记剂的选择、标记过程的可靠性等问题。
对于这些挑战，科学家们正在不断探索和研究，以期开拓更广阔的研究领域并提出更有效的解决方案。
总结而言，光学超分辨突破光学衍射极限的挑战是一个具有挑战性和前瞻性的课题。
通过近场光学显微镜和荧光标记技术的应用，科学家们正在突破光学衍射极限，实现对微观领域的更细致观察和研究。
尽管还存在一些技术难题，但相信在不久的将来，光学超分辨技术将会得到更为广泛的应用，为科学研究和各个领域的发展带来新的突破。
突破光学衍射极限：实现远场纳米级分辨的光学显微镜
突破光学衍射极限：实现远场纳米级分辨的光学显微镜作者：倪洁蕾程亚来源：《科学》2015年第01期由于光学衍射极限，远场光学显微镜的分辨率仅能达到光波长的一半左右。
在可见光波段，这一极限大约为200纳米。
而对于生命科学研究，往往需要数十纳米甚至更高的分辨率，以获取组织或活细胞内部精细结构的信息。
2014年度的诺贝尔化学奖获得者解决了这一世纪难题。
2014年度的诺贝尔化学奖授予在超分辨光学显微镜领域做出开创性贡献的三位科学家：贝齐格（E.Betzig）、黑尔（S.W.Hell）和莫纳（W.E.Moerner）。
对于很多同行而言，这件事既在意料之中，却也颇显意外。
西方人有一句谚语：“Seeing is believing（眼见为实）。
”因此，成像与观测领域的重大突破一直为诺贝尔奖所青睐。
300余年前，当荷兰科学家列文虎克（A.van Leeuwenhoek）利用自己搭建的显微镜观察水珠时，他意外地发现了悬浮在水滴中的细小浮游微生物，从此向世人打开了进入微观世界的大门。
从几何光学角度看，通过合理设计光学成像系统，光学显微镜具备实现任意放大倍率的能力。
然而，人们身处的世界在本质上是量子世界，最终一切物质都必须用“波”的概念来描述，对光自然也不例外。
因此，当人们利用光波来进行显微观测时，量子力学中的不确定性原理为光学显微镜的分辨率设置了一道屏障，即光学衍射极限。
自从1873年德国科学家阿贝（E.Abbe）首次提出光学衍射极限的概念开始，直到20世纪末，人们一直认为光学显微镜所能够看清的物体的最小尺寸大约为光波长的一半左右（对于可见光而言，这一极限尺寸大约在200纳米）。
这意味着科学家们可以辨别完整细胞，以及其中一些被称为细胞器的组成部分。
然而，他们却无法分辨一个正常大小的病毒或者单个蛋白质。
在这样的背景下，即便对于很多一流的光学科学家，他们也已形成了一个思维定势，认为突破光学衍射极限在理论上是一件不可能的事情。
突破衍射极限的成像方法综述
突破衍射极限的成像方法综述作者：乌拉郑玉祥来源：《光学仪器》2017年第01期摘要：“衍射极限”实际上不是一个真正的障碍，除非处理远场和定位精度。
这种衍射障碍并不是坚不可摧的，可以利用一些智能技术来突破光学衍射极限。
讨论了四种技术，近场扫描光学显微镜（NSOM）法，受激发射损耗（STED）显微镜法，光激活定位显微镜（PALM）法或随机光学重建显微镜（STORM）法和结构照明显微镜（SIM）法，并且介绍了各自的基本原则与优劣。
NSOM利用纳米级探测器检测通过光纤的极小汇聚光斑，从而获得单个像素的分辨率；PALM和STORM利用荧光探针，实现暗场和荧光的转换，从而观察到极小的荧光团；SIM则是利用栅格图案与样品叠加成像来实现。
其中，STORM具有相对较高的潜力，能够更为有效地突破衍射极限。
关键词：衍射极限；近场显微镜；三维显微中图分类号： O 43文献标志码： Adoi： 10.3969/j.issn.10055630.2017.01.014A review on imaging methods to break the diffraction limitRamzan Ullah1，2， ZHENG Yuxiang1（1.Shanghai UltraPrecision Optical Manufacturing Engineering Center， Department of Optical Science and Engineering，Fudan University， Shanghai 200433， China；2.Department of Physics， COMSATS Institute of Information Technology， Islamabad 45550， Pakistan）Abstract：Notorious term 'diffraction limit' is not actually a true barrier unless we are dealing with far field and localization precision.This diffraction barrier is not impenetrable and can be broken with some intelligent techniques.We discuss here four powerful techniques，nearfield scanning optical microscopy（NSOM），stimulated emission depletion（STED） microscopy，photoactivated localization microscopy（PALM） & stochastic optical reconstruction microscopy（STORM） and structured illumination microscopy（SIM），along with their underlying principles together with pros and cons.NSOM uses a nanometer scale detector or source which compels the light to passthrough the tiny tip of a fiber while keeping the distance between the tip and sample less than λ.At any given moment in a STED microscope，laser light is focused into a small spot by the objective and as a result，all fluorophores within this focused spot radiate fluorescence，which is then gathered by the objective and headed to the detector where it forms a single pixel.Fluorescent probes are employed by STORM/PALM，which are able to toggle between dark states and fluorescent so that with every snapshot taken，only a tiny，optically resolvable portion of the fluorophores is observed.Structured illumination is a wide field technique in which a grid pattern is produced by the interference of diffraction orders which are superimposed on the sample while taking images.STORM has the relatively high potential to effectively break the conventional diffraction barrier with fewer hurdles.Keywords：diffraction limit； nearfield microscopy； threedimensional microscopyIntroductionA microscope is a device used to see objects in intricate detail usually up to the order ofnanoscale.The main factor in determining the quality of a microscope is its resolution which is fundamentally bounded by diffraction limit.Normally，determining the diffraction limit of an imaging system is based on Abbe and Rayleigh criterions[1] which in turn depend on numerical aperture of the lens and wavelength of light being used.With the advent of new technologies different types of microscopes working beyond the limit of diffraction，have been developed which include electron microscopes[23] using electrons as well as optical microscopes using smart optical techniques.Each type has its own pros and cons.We present a short review of some of these optical microscopes.1Nearfield scanning optical microscopy（NSOM）NSOM sometimes abbreviated as SNOM for "Scanning Nearfield Scanning Optical Microscopy" was firstly suggested in 1928[4].NSOM uses a very innovative concept to penetrate the diffraction barrier which is to use a detector or source whose size is in nanometer scale.NSOM compels the light to pass through the tiny tip（whose aperture size is on the order of tens of nanometers） of afiber.Now if this tip is brought very close to the object，the resolution is no more limited by the diffraction，but by the size of the tip aperture as elucidated in Fig 1.So it means the distance between the tip and object must be much smaller than λ.So it breaks the far field resolution limit.Probe resolution is mainly quantified by the diameter of the aperture[5].With the passage of time，more and more advanced techniques have been developed and some are even specific to the type ofsample[6].This technique has revolutionized the field of material characterization especially for nano materials[7].So basically NSOM/SNOM utilizes the near field component of the electromagnetic wave whose propagation is limited to very short distance as opposed to far field light which smears out infinitely until absorbed，refracted or scattered whatever is the case.The propagation distance of a near field photon is proportional to the physical dimensions of its source；hence in order to be observable by the nearfield，the objects have to be in very close proximity of the field.The distance between the tip and object must be less than the dimensions of the aperture of the tip.The amplitude ofthe nearfield light decays exponentially as the negative of the 1st or higher power of the distance from its source.A detailed analysis of the NSOM can be found here[8].Similarly another technique called apertureless near field microscopy reaches beyond the range of simple NSOM[9].1.1Advantages（1） NSOM offers direct relationship between surfacenano features and optical or electronic characteristics along with concurrent mensuration of the topography as well as optical properties （fluorescence）.Fig.1Schematic diagram of a NSOM（2） NSOM is substantially effective in characterizing the inhomogeneous materials or surfaces，like nano particles，polymer blends，porous silicon，and biological systems[10].1.2Disadvantages（1） The chief drawback to NSOM is the restricted number of photons coming out of the tiny tip and the miniscule collection efficiency.（2） Long scan time for high resolution images or large areas to be scanned.（3） Only surface features can be studied.2Stimulated emission depletion（STED） microscopyA STED microscope is built on the basis of aconfocal laser scanning microscope（CLSM）.A layout of a CLSM is shown in Fig.2.At any given moment，laser light is focused into a small spot by the objective and as a result，all fluorophores within this focused spot radiate fluorescence，which is then gathered by the objective and headed to the detector.The detected signal forms a singlepixel.Then the scanning mirror moves in XY plane to take the next pixels and this goes on until the whole sample is scanned and as a result whole image of the sample is formed.Sometimes，the sample stage is moveable so sample is moved in the XY plane and whole image is formed.A single pixel is obtained for each location.So in order to get a high resolution image，it would take considerable time.Fig.2A schematic diagram of a CLSMThe intensity of the light at the focused spot spreads out in accordance with the point spread function（PSF）.For a circular aperture，the PSF exhibits a pattern called “Airy disk”，whose size is proportional to λ/NA where λ is the wavelength of light & NA is numerical aperture.The resolution of CLSM is decided by the size of the PSF：If the focal spot is smaller，so does the each pixel acquired and the resultant image will be crisp and sharp.But if not，resultant image willbe blurred.So the main challenge is to achieve smaller and smaller PSF to get better and better resolution.However，there is a natural diffraction limit in doing this like in any other system and this situation was first described in 1870’s by a German physicist Ernst Abbe（1840—1905） who indicated that the PSF size has a lower limit which is proportional to λ/NA（circular aperture） due to diffraction.This is called the Abbe’s diffraction limit.The basic idea behind STED microscopy is the utilization of nonlinear optics to design a smaller PSF below Abbe’s diffraction limi t.It was Albert Einstein，who in 1917 theoretically anticipated the occurrence of stimulated emission.Stimulated emission is the basic building block of lasers and it also functions as the foundation of STED that cracks the diffraction limit.The STEDmicroscope is largely dependent on two laser pulses which are synchronized.These two synchronized laser pulses are named as 'STED laser' and 'excitation laser' in Fig.3.As can be seen，excitation is carried out by a subpicosecond laser pulse which is tuned to the absorption spectrum of the dye.The excitation pulse is irradiated and focused onto the sample，generating a typical diffraction limited spot of excited molecules.The excitation pulse is instantly chased by a depletion pulse named as STED pulse.The STED pulse is redshifted（increased in wavelength） in frequency to the emission spectrum of the dye，in such a way that its lower energy photons operate only on the excited molecules of the dye under ideal condition，hence，extinguish them to the ground state by stimulated emission.The overall result of the STED pulse is that the influenced excited molecules cannot radiate in the fluorescence regime because their energy is disposed of in the STED pulse.By arranging the STED pulse in doughnut mode spatially，only the molecules in the proximity of the spot are quenched under ideal condition.Fluorescence ideally remains intact at the center of the doughnut，where the STED pulse is evanescing.Fig.3Simplified STED schemeBy increasing the intensity of the STED pulse，the depletion becomes increasingly more functional towards the middle and sufficiently complete at the proximity of the spot.However，the fluorescence is ideally not affected at all at the doughnut hole.Therefore，by increasing the intensity of the doughnutshaped STEDpulse，the fluorescent spot can be gradually shrunk down，theoretically，even up to the size of a single molecule.This intriguing concept is manifesting the fundamental smashing of the diffraction barrier.The crucial element is the saturated diminishing of the fluorescence at any coordinate except the focal point.This microscopy technique is unique in a way that presently the well known super resolution methods like multiphoton fluorescence，the confocal or related microscopes，which can never transcend Abbe’s barrier by more than a factor of 2.In a way，confocal fluorescence and twophoton microscopes just cross the border of the diffraction limitation，without breaking it[11].The resolution of these systems is still restricted by diffraction，as opposed to the STEDmicroscope[12].The actual physical reason behind the breakage of the diffraction barrier is not that fluorescence is hindered，but the saturation of the fluorescence diminishing.Fluorescence diminishing alone is not conducive to the breakage of the diffraction barrier since the focused STEDpulse is also limited by diffraction.However，in this context，saturation means that when the fluorescence at the middle of the doughnut is intact，it is completely stopped at the closest proximity of the doughnut.Thus the fluorescent region is gradually shrunk down without any limit[13].3Photoactivated localization microscopy（PALM） & stochastic optical reconstruction microscopy（STORM）Superresolution optical microscopy technique which is founded on stochastic switching of single molecule fluorescence signal is named as PALM or sometimes also called STORM[14].As in the case of conventional fluorescence microscopy where all fluorophores in the sample are fluorescent and their corresponding images，being diffraction limited，overlap and thus form a smooth but somewhat obscure image.Fluorescent probes are employed by STORM/PALM，which are able to toggle between dark states and fluorescent so that with every snapshot taken，only a tiny，optically resolvable portion of the fluorophores is observed[15].In this way，deduction of their locations with ultra high accuracy from the central locations of the fluorescent spots is possible.With many snapshots of the sample，a final superresolution image can be reenacted from the assembled positions，each catching a random subset of the fluorophores[16].Since its inception in 2006，STORM has gathered many more functionalities[17].With either different emission wavelengths or different activation wavelengths，multicolor imaging can be attained with photoswitchable fluorophores.3D imaging has been actualized with the help of several 3D singleparticle localization methods，inclusive of PSF engineering，biplane imaging，astigmatic imaging and interference.A typical STORM /PALM setup is shown in Fig.4 in which multi color lasers were used.The detail can be found[18].Similarly，Nikon made a new STORM microscope which they name NSTORM with superresolution capable to reconstruct 2D and 3D high resolution images with crystal clear clarity.The detail and specifications can be found here[19].4Structured illumination microscopy（SIM）Structured illumination is awide field technique in which a grid pattern is produced by the interference of diffraction orders which are superimposed on the sample while taking images.The grid pattern is relocated or revolved in steps between recordings of each snapshot set.The snapshot set consists of individual subsets，where each subset is recorded after rotating the grid.Succeeded by the processing with a specially designed algorithm[20]，highfrequency information can be extricated from the raw data to develop a reconstructed image with a lateral resolution roughly twice to that of diffractionlimited microscopes[21] and an axial resolution between 150 and 300 nm.Fig.4A PALM and STORM layout in which multi color lasers were used taken from referenceStructuredillumination（SI） leans on both exclusive microscopy procedures and extensive software analysis after exposure.But，because SI is a widefield technique，it is normally capable to capture images at a higher rate than confocalbased schemes like STED[22].The leading concept of SI is to illuminate a sample with patterned light and increase the resolution by measuring the fringes in the Moiré pattern[23] and sample information（which is otherwise unobservable） is extracted from these fringes and computationally reinstated[24].There are some limitations associated with SI.Firstly，the saturating excitation powers induce more photo damage and decline fluorophore photo stability.Secondly，sample drift must be retained well below the resolving distance which is also very challenging.The first limitation can be resolved by combining with other microscopy techniques which use some other nonlinearity like reversible photo activation and stimulated emission depletion.The second limitation delimits livecell imaging and may necessitate faster frame rates.In spite of that，SI is undoubtedly，a strong rival in the competition of applications in the field of superresolution microscopy[25].A comparison table of pros and cons of all of these microscopy techniques given above together with many others can be found at reference[26].5ConclusionAfter discussing these four very powerful techniques，nearfield scanning optical microscopy （NSOM），stimulated emission depletion（STED） microscopy，photoactivated localization microscopy（PALM） & stochastic optical reconstruction microscopy（STORM） and structured illumination microscopy（SIM），of breaking the diffraction limit，we conclude STORM has the high potential to effectively break the conventional diffraction barrier with less hurdles.However，this conclusion is relative as it depends upon the application for which a microscope is required.参考文献：[1]PAWLE Y J.Handbook of biological confocal microscopy[M].New 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突破衍射极限的光子聚束效应
学号： ************ 分类号：硕士学位论文突破衍射极限的光子聚束效应研究生姓名：田会芬指导教师：徐宝龙曹德忠学科门类：理学专业名称：无线电物理论文提交日期：2012年4月2日学号：分类号：硕士学位论文热光关联空间滤波与亚波长干涉研究生姓名：田会芬指导教师：徐宝龙曹德忠学科门类：理学专业名称：无线电物理论文提交日期：2012年4月2日摘要在经典光学中，一束光会聚成的光斑大小最终受衍射极限的限制。
突破经典衍射极限从而得到更小的会聚斑点对光学刻录，大规模光学存储器，集成电路设计以及高分辨率成像有极其重要的意义。
在最近的十年中，理论和实验研究都证明了热光光源可以产生与纠缠的双光子源类似的量子效应，比如：鬼干涉，鬼成像以及亚波长干涉。
这些效应涉及到热光的空间强度关联。
在这些效应中，双缝的亚波长干涉为突破瑞利衍射极限提供了可能性。
在早期的亚波长干涉实验中，只能在两个探测器沿相反方向移动的情况下才能观察到亚波长干涉图样。
而且测量高阶强度关联可以提高可见度和分辨率。
与双光子纠缠源不同的是，由于两个探测器是分开的，这种方案不能应用于双光子刻录技术。
最近，我们提出了一种实验方案来实现热光的双光子刻录，方案的核心在于将一束光的波前反转然后与另一束光相互叠加，进行同一位置的双光子测量即可得到亚波长干涉条纹。
在N光子过程中，N光子的衍射极限是经典衍射极限的N倍。
因此，与经典方案比较，利用N光子关联效应可获得更为精细的会聚斑点。
本课题拟采用N光子关联的聚束效应，改善光学刻录的精度。
本文拟采用理论实验相结合的方式进行研究。
理论上，根据热光关联的共轭关系，设计理论模型，分析系统的多光子关联结构，探索N光子聚束效应的最佳方案。
在实验上，设计一种新的热光干涉仪，两束光分别使用直角反射镜将其波前相位反转，并将反转后的两束光相互叠加，由探测器接收，在此干涉仪的基础上，研究大孔径光束照射时，探测平面的光斑分布。
使用二元光学元件或透镜超越瑞利衍射极限要依赖于特殊材料制作的元件的良好设计，并且只适用于近场，而本文的实验装置中没有使用二元光学元件和透镜。
突破光学衍射极限
为了实现这一想法，需要寻找一种各向异性且电导率（磁导 率）为负值的介质。这就是所谓的“完美透镜”理论。本来 在介质中衰减的高频分量得到了放大，不过相应地本来正常 传输的频率能量将会衰减。 在此基础上还出现了在出射面叠加调制光栅，将高频分量调 制成低频信号传输，并在像方对其进行还原。
2、突破光学衍射极限的方法
2、另一种通过改变光学的点扩散函数大小来提高分辨率的 方法称为结构照明显微成像技术(SIM)，最早是由美国的 Gustafsson 教授实现的。其原理是通过有结构的光学照明产 生的莫列波紋来提高图像的分辨率。通过结构照明的方法， 能将分辨率提高 2 倍。如果想再提高，则需要用到饱和结构 照明成像技术(SSIM)。其原理是利用了荧光发射对照明光的 非线性效应，分辨率可以达到约为 50 纳米.
成为一个理想的点，则可以使光学系统突破衍射极限。 为了实现这一想法有两种可行的方法：
1、通过物理手段减小点扩散函数，其典型的应用是受激发射损耗荧光显微 成像技术（STED）。其原理是：在用普通的激发光使荧光物质发光的同时， 用波长较长的高能量脉冲激光器产生一束环形的耗竭光将荧光物质猝灭，从 而减小荧光点的发光面积，显著提高分辨率。 其点扩散函数半高宽可以表示为：
x , d ~ y exp j 2 x ~ x ~ x y Pd ~
i i i 0
i
~ y0 ~ y d~ x d~ y
即脉冲响应由点变为了艾里斑，故分辨率受限
2、突破光学衍射极限的方法
2、突破光学衍射极限的方法
kx
kz
kx
kz
2、突破光学衍射极限的方法
M ( xi ~ x0 , yi ~ y0 )
~ ~ ~ ~ ~ ~ exp j 2 [( x x ) x ( y y ) y ] d x d y i 0 i 0
突破衍射极限的方法
突破衍射极限的方法1.近场成像基本思路是利用高空间频率信号来获得清晰的物象。
由于需要非常接近样本，因而对于实际应用造成了很大的障碍。
1) superlensZhang X, Liu Z. Superlenses to overcome the diffraction limit.[J]. Nature Materials, 2008, 7(6):435-441.使用负折射率超材料（完美透镜）增强原子力显微镜/显微镜的分辨率。
将负折射率材料靠近目标物体，近场消逝波将被增强。
完美透镜的分辨率不取决于衍射极限，而是取决于放大率和多少消失模被存储2) hyperlensLu D, Liu Z. Hyperlenses and metalenses for far-field super-resolution imaging[J]. Nature Communications, 2012, 3(6):1205.3) microsphere assist imagingWang Z, Guo W, Li L, et al. Optical virtual imaging at 50 nm lateral resolution with a white-light nanoscope[J]. Nature Communications, 2011, 2(1):385-396.4) nearfield scanning optical microscopy2.远场成像可以做到远场高分辨，达到几十纳米的分辨率，通过选择性激活或者灭活荧光团但是这些成像技术仅适用于生物组织样本1)STEDStimulated emission depletion microscopy受激发射减损显微镜https:///wiki/STED_microscopy2) PALMphoto-activated localization microscopy光激活定位显微镜https:///wiki/Photoactivated_localization_microscopy3) STORM随机光学重构显微技术Stochastic optical reconstruction microscopyhttps:///wiki/Super-resolution_microscopy#Stochastic_optical_reconstruct ion_microscopy_.28STORM.293.SOLsuper-oscillatory lens超震荡透镜Berry M V. Exact nonparaxial transmission of subwavelength detail using superoscillations[J]. Journal of Physics A Mathematical & Theoretical, 2013,46(20):2140-2154.。
突破光学衍射极限_发展纳米光学和光子学_干福熹
干福熹等 :
突破光学衍射极限 , 发展纳米光学和光子学
分辨功能材料薄膜的超分辨率方案目前已经成为国 际公认的最具实用性的下一代大容量光盘存储的重 要技术方案之一 , 通过拓展可望在超分辨纳米光学 制造、 光学成像等领域中获得应用。 单一地从远场、 近场或材料着手, 大幅度提高分 辨率是非常困难的 , 因此必须从一个全新的角度去 看待这个问题。通过两种或以 上超分辨技术 的组 合, 在激光与材料相互作用中实现超分辨率是一个 重要的突破途径。近年来在纳米光刻领域引起重点 关注 的 双 光 束 刻 录 技 术
) , 男 , 光学和材料学家。 1980 年当选为中国科学院院士 ( 学部委员 ) 。 1993 年当 选为第三世 界
科学院院士。1957 年建立了我国第一个光学玻璃试制基地 ; 建立了我国耐辐射光学玻璃系列。研制掺钕 激光玻璃 , 国内第 一 个获得激光输出并建立了激光钕玻璃系列。是我国光 信息存 储领域 的开拓者。 曾获国 家自然 科学三 等奖、 国家科 学进步 二 等奖、 中国科学院科技进步一等奖、 国家优秀科技图书特等奖等。 1997 年获何梁何利科学和技术进步奖 。2001 年获国际玻璃 界的终身成就奖国际玻璃协会主席奖。 E - mail: fx gan@ mail. shcnc. ac. cn 0900104 -1
Breaking Through the Optical Diffraction Limits, Developing the Nano - Optics and Photonics
Gan Fuxi
1 2
1, 2
Wang Yang
1
Sha ngha i Instit ut e of Opt ics a nd F in e Mecha n ics , Chin ese Academ y of Scien ces , Shan ghai 201800, Chin a School of In f or m at ion Scien ce a n d Engin eer in g , F uda n Un iver sity , Shan ghai 200433, Chin a
突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展 (修改)
结课论文题目突破衍射极限的超高分辨率成像的技术进展学生学号学院专业班级二〇一五年十二月一引言1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久的历史，但一直以来，光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200 nm。
后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，但是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。
值得庆贺的是近年来，超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达到了20 nm以下。
其中德国科学家Stefan Hell、美国科学家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出贡献获得了2014年的诺贝尔化学奖。
在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用，并对诸位大师致以敬意。
1.2技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y平面分辨率与Z轴分辨率大小来判定，分辨率越高数值越小。
下表是各种显微成像技术的分辨率指标。
二衍射极限2.1 衍射极限我们能看到什么？看到多小的围？看得有多清楚？几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。
人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。
1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄的软木塞切片。
虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。
此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。
那么，光学显微镜是否可以无止境地“放大”下去，让我们想看到多小就能看到多小？科学家为此做了很多尝试，最终发现，存在一道法逾越的“墙”—衍射极限。
1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。
实现这个“真正突破”竟用了百年
实现这个“真正突破”竟用了百年突然袭来的新冠肺炎疫情让人类又一次见识了“病毒”的威力。
肉眼看不到的病毒作为一个物种，很可能从地球生命诞生之初就已经存在，而人类从意识到有病毒存在→看到病毒的模样→弄清病毒的内部结构成分却经历了漫长的过程。
病毒在19世纪末已被证实肯定存在，但因“阿贝极限”使光学显微镜无法达到更高的分辨率，始终看不到病毒的踪影。
20世纪30年代，电子显微镜的发明使神秘的病毒终于现出了真身，只是电子显微镜的原理决定了它无法用于活细胞的观察及获取生物活动的动态信息，而攻克致病病毒，需要深入了解病毒在活细胞内感染、复制及释放的动态过程。
科学界期待着能有可获取生物过程动态信息的、更高分辨率的光学显微镜。
光学显微镜的“阿贝极限”究竟有没有可能被突破呢？尽管每项科学技术的发展都会历尽艰辛，只是没想到，真正突破“阿贝极限”竟用了百余年，在此期间数项新技术的发明起到了极为关键的作用！相衬“相衬”是显微技术中的一个重大进步。
光学显微镜观察细胞时一般都需要染色，这是因为细胞结构中大部分组分都是透明的。
透明度高的物体也称为位相物体，光波通过位相物体时不改变振幅(光的强弱)只改变位相，但人眼只能辨别出振幅的变化，因此在光学显微镜下难以区分不同的细胞组分。
用有机染料对不同的细胞组分进行选择性染色后，可借助不同的颜色反衬来提高细胞不同组分图像的对比度，便于更清楚地进行观察和研究。
但染色是一个非常困难和耗时的过程，常常会对观察的生物样本产生伤害，甚至杀死细胞。
波的位相示意图有没有办法让光学显微镜的生物样本可以不经染色而直接清楚地观察到活细胞的内部结构呢？20世纪30年代初，荷兰的弗里茨·泽尼克(Frits Zernike)在实验中偶然发现：不可见的光相位变化可以转变为可见的振幅变化，他根据位相理论研究出了位相反衬法(一种光学信息处理方法)，通过某种空间滤波器将位相变化产生的不可见信息转化为与之等价的可见的振幅信息，改善透明物体成像的反衬度，可大大提高透明物体的可分辨性。
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光学衍射极限的突破
纪岚森，仵云龙，李岷池，贺杰
（青岛大学物理科学学院2011级材料物理1班）
摘要：由于光学衍射极限的存在，使得在电子科技上边很难达到人们期望的高分辨率，然而
光学衍射极限并不是不能克服的。
除了减小光波长与增加孔径外，我们还可以通过改变光路
来突破艾里斑衍射极限。
减小艾里斑在很多的方面都有极其重要的意义，这里讲述的是艾里
斑对显微镜技术突破的一些介绍。
关键词：艾里斑，显微镜，光学衍射极限
1引言：
在大量的电子图像应用领域，人们经常期望得到高分辨率（简称HR）图像。
高分辨率意味着图像中的像素密度高，能够提供更多的细节，而这些细节在许多实际应用中不可或缺。
例如，高分辨率医疗图像对于医生做出正确的诊断是非常有帮助的；使用高分辨率卫星图像就很容易从相似物中区别相似的对象；如果能够提供高分辨的图像，计算机视觉中的模式识别的性能就会大大提高。
同时随着生命科学的迅猛发展三维光学显微技术也已经成为研究生命过程的一种极为有效的工具，但是传统的基于荧光共焦技术的成像方案受到光学衍射极限的限制，其横向和纵向的数量级均在百纳米，因而无法满足科学技术发展的需要，利用各种非线性光学荧光激发方案已经打破光学极限的方案已经实现，然而这种光路较为复杂，通过其他的方法构造出来的奇异光线也是能够实现科学家长期最求的三维远场光学的超分辨成像。
根据瑞利衍射极限任意的光学系统成像就会在像方产生一个光斑，而这个光斑是无法通过改变显微镜的结构来实现的，也就是说，无论是共焦显微镜或是宽场显微镜这个光斑都是存在的，而这个光斑就是我们所说的爱里斑(Airy disc) 由于光的波动性，光通过小孔会发生衍射，明暗相间的条纹衍射图样，条纹间距随小孔尺寸的减少而变大。
大约有84%的光能量集中在中央亮斑，其余16%的光能量分布在各
级明环上。
衍射图样的中心区域有最大的亮斑，称为
爱里斑。
爱里斑的角度与波长(λ)及小孔的直径(d)
满足关系：sinθ=1.22λ/d，θ即第一暗环的衍
射方向角（即从中央亮斑的中心到第一暗环对透镜光
心的张角），因为θ角一般都很小，有sinθ≈θ，故
θ≈1.22λ/d。
对于光学成像系统而言，用艾里
斑直径衡量成像面分辨率的极限，艾里斑半径为
r=1.22λf/d。
2缩小艾里斑的方法
因此如何缩小艾里斑的极限便是科学发展显微技术成像的一个大的攻坚战，由艾里斑的半径公式我们可以看出我们可以通过减小焦距与增加孔径的方法来缩小艾里斑的半径，但是增加孔径和减小焦距是有限的，我们不能通过无限增加孔径或者减小焦距来实现增加分辨率的极限，下面我们就增加分辨率的另外一种方法来做叫要的叙述。
我们生活在物质的世界中，而物质本身是量子的，这就意味着物质本身与波动有着密不可分的联系，而量子物理中的测不准原理又给光学显微成像带来了一个无可逾越的屏障，这意味着，我们只能分辨出的最小距离只能是光波长的一班，然而在20世纪90年代这种观点才被终结，由于在激光器产生之前，我们无法得到单色性较好的光源，所以随着激光技术的发展，我们的非线性光学的发展也是迅速的，在一系列的非线性光学现象的发现中，我们看到了减小分辨率极限的希望。
3真正意思上的衍射极限的突破：
真正能够实现显微成像分辨率显著提高的并在原理上彻底打破光学远场成像技术的是直到1994年才被提出的，Hell先生建议使用通过扫描一束聚焦激光来对样本进行逐点成像，成像的三维分辨率取决于聚焦激光的焦斑内荧光分子所占据的体积，因此通过较小荧光分子的体积，采用两束组合激光，即一束光被聚焦成正常的极限光斑，而另一束光先去在与荧光分子发射的荧光波长的范围的附近的光，确是与第一束光相互接近的中空的焦斑。
利用第二束光将第一束光抽运到激发态的荧光分子从激发态猝灭到基态。
第二束光只要足够强，便可以把激发态的荧光分子的体积压缩到极小范围内。
SEDM（Stimulated Emission Depletion Microscopy）显微原理的应用，突破了光学衍射数百纳米的限制。
在这之后，不同于荧光饱和猝灭的高度非线性，SPEM(Saturated Patterned Excitation Microscopy)技术运用荧光饱和激发的高度线性，将光学显微成像的分辨率提高到了50纳米。
和SEDM一样，从原理上根本性的突破了光学衍射极限的限制。
由于单个发光点所成的艾里斑像的中心能够被精确的定位，便产生了与SEDM和SEPM 本质上不同的成像技术。
基于这一原理，STORM和PALM成像技术使各个荧光分子所成的像不再相互干扰，将每个荧光分子逐个定位。
如此，一幅超越衍射极限的图像即已完成。
以上两类超分辨成像技术，相比与常规显微镜技术，都有其自身的复杂性。
首先，SEDM 和SEPM采用较高的饱和猝灭或激发光强，对荧光分子和生物样品带来了光漂白、光毒性等副作用。
其次，他们大都需要不同波长的相干光源作为激发光。
为了减少以致避免这些负面影响，我们将视线转移到了传统光学显微系统，实现三维超分辨显微成像。
上述两类超分辨成像方法为了实现非线性光学效应，突破在线性光学条件下获得超分辨的限制
参考文献:
1：《共焦显微系统中光学超分辨光瞳滤波器的设计》王美，云茂金等
2：《利用具有奇异非线性光学特性的纳米粒子突破光学衍射极限》3《百度文库，百度知道>。