DNA条形码-植物

PCR
步骤与原理
原理：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶 链式反应，是指在耐热DNA聚合酶与启动子的参与下，以 母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退 火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链 DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异
标准
概述
在种间有明显的遗传差异和分化，同时种内变异 足够小
片段足够短，便于一个反应完成测序工作，而且便 于DNA提取和PCR扩增 ，尤其是存在降解的材料
存在保守区域，便于设计通用引物
来自百度文库 现状
概述
在上世纪末期，科学工作者就已经采用小的基因片段对细菌、病毒、
原生生物等缺乏足够形态特征的类群进行识别研究。
15min 沉淀70％醇
洗2次
10000rpm 离心15min ，即得
-20 ℃冰箱保存
DNA检测 步骤与原理
DNA检测方法主要有：凝胶电泳法和紫外测DNA的OD值
主要步骤：取5ul提取的DNA溶液上样进行电泳检测。电泳条 件为：0.5*TBE电泳缓冲液，1％琼脂糖凝胶，120v恒压电泳 20min。Goldview染色。凝胶成像系统拍照。
截止目前，在DNA条形码数据库收录的，符合条形码标准的，有90 ％以上都是来自动物界(其中昆虫纲最多)。
现状
概述
现状
不过，COⅠ在植物中应用效果较差，因此，核糖体 ITS 序列和质体rbcL、matK 和trnH-psbA 等序列也相 继被引入植物的DNA 条形码研究，并处于热门研究中。
优点
概述
Clustal X 建树
打开Clustal 程序 载入源文件
序列比对
掐头去尾
Trees-Draw N-J Trees
Trees-Output Format Options
Trees View
重新载入剪切 后的序列
测序与分析 步骤与原理
Mega 建树
用Clustal X 程序进行比对 剪切后生成aln文件
测序与分析 步骤与原理
2、建树的相关软件和步骤
构建进化树的主要步骤是比对，建立取代模型，建立进化 树以及进化树评估。鉴于以上对于构建系统树的评价，结合本 实验室实际情况，以下主要介绍N-J Tree构建的相关软件和操 作步骤。
Clustal X 和 MEGA 构建N-J系统树
测序与分析 步骤与原理
将提取的DNA溶液稀释100倍，用GeneQuant pro DNA/RNA calculator（Amersham Pharmacia Biotech）测定 A260、A280值。根据A260/A280判断DNA的纯度， A260/A280的值在1.7～1.9之间为合格，根据A260值计算 DNA浓度和得率。
PCR条形码设计 步骤与原理
主要步骤：
找到Primer3站点
贴上模板序列
ITS 、rbcL和trnH-psbA均 有较好的通用引物， matK 则无。
重要参数设定
收获引物
引物设计检验
PCR操作 步骤与原理
PCR体系（总体积20μl）：
ddH2O
适量
10×PCR buffer 2μl
dNTP mix (2.5mM ) 2μl
基本步骤：以NCBI为例
登录NCBI主页
点击BLAST
点击 Nucleotide BLAST
点击Format
点击BLAST!
得到result of BLAST
在Search文本框中 粘贴检测序列
测序与分析 步骤与原理
2) 序列格式：FASTA格式 又称Person格式
由于EMBL和GenBank数据库格式较为复杂，所以为了分析方便就出现 了十分简单的FASTA数据格式
测序与分析 步骤与原理
系统发育树(phylogenetic tree)
在研究生物进化和系统分类中，常用一种类似树状分支的 图形来概括各种（类）生物之间的亲缘关系，这种树状分支的 图形称为系统发育树。
通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分 子系统树(molecular phylogenetic tree) 。图型中，分支的末 端和分支的联结点成为结（node），代表生物类群，分支末端 的结代表仍生存的种类。
FASTA格式：第一行为说明行，以“＞”符号开始，后面是序列的名称、 说明等，其中“>”是必需的，名称及说明等可以是任意形式，换行之后是序 列。
最后，将检测序列和搜索到的同源序列以FASTA格式编辑成为一个 文本文件(例：C:\temp\jc.txt)，即可导入Clustal X等程序进行比对建树。
构建系统发育树步骤
1、建树前的准备工作
1) 相似序列的获得：BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 是目前常用的数据库搜索程序
基本思路：首先找出检测序列和目标序列之间相似性程度最高的片段， 并作为内核向两端延伸，以找出尽可能长的相似序列片段。
测序与分析 步骤与原理
稷 下 学 宫 ，又 被称作 稷下之 学。齐 国稷下 学宫是 世界上 第一所 由官方 举办、 私 家 主 持 的 特殊形 式高等 学府。 它位于 齐国的 国都临 淄稷门 附近。 齐国稷 下学宫 究 竟 是 怎 么 一回事 儿呢？ 下面就 来了解 一下这 齐国稷 下学宫 吧。 先 来 看 看稷 下 学 宫 这 个 名字是 怎么来 的吧。 稷下学 宫的“ 稷”， 是齐国 国都临 淄城一 处城门 的 名 称 ， 而 “稷下 ”指的 就是齐 国国都 临淄城 的城门 附近的 意思， “学宫 ”就是 学 习 的 地 方 。齐国 的君主 在齐国 的国都 临淄稷 门附近 设立了 一座学 宫，就 有了稷 下 学 宫 这 个 名字。 稷下学 宫也被 叫做稷 下之学 。 齐 国 的 稷 下学 宫是一 所官办 的 高 等 学 府 。但是 它并不 是在齐 国成立 之初就 存在的 。它创 建于齐 威王初 年，是 齐 威 王 变 法 的产物 ，是他 为了巩 固田氏 政权的 统治的 一向重 大举措 。当然 ，这一 举 措 并 不 是 齐威王 自己凭 空想出 来的， 那时候 的齐威 王受到 了魏文 侯尊礼 子夏建 立 西河之 学的影 响，加 上想要 广开言 路，于 是就设 立了稷 下学宫 。在稷 下学宫 中， 推 行 的 官 学 乃是黄 老之学 ，因为 其方举 办、私 家主持 的特殊 形式， 当时的 稷下学 宫 几 乎 容 纳 了“诸 子百家 ”的所 有门派 ，为之 后的“ 百家争 鸣”创 造了条 件。稷 下 学 宫 的 开 设，大 大的增 强了人 们的学 习热情 ，大量 学术著 作相继 问世， 大大地
按照同种植物尽量增加产地数，每个产地采集1-2个物 种的原则。
DNA提取 步骤与原理
CTAB法原理:CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium
bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂, 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。 在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质 和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可 使核酸分离出来。
PCR产物 步骤与原理
PCR产物检测： 采用凝胶电泳法，方法同DNA检测。
PCR产物纯化： 产物的纯化常使用QIAEX Ⅱ琼脂糖凝胶提取试剂盒(Qiagen)
测序与分析 步骤与原理
测序： PCR产物纯化后送生物试剂公司测序
分析： 测序结果的碱基序列采用MEGA或PAUP计算种内和
中间的K2P距离，并根据计算结果构建N-J系统发育树
DNA提取 步骤与原理
0.1g叶片 液氮研磨
加入CTAB液
转入2ml EP管
600ul
重复操作一次
65℃温育 间或震摇 20-40min
10000rpm离心
加等体积氯仿-异戊醇
取上清液于新管
(24:1)
15min
加0.7体积预冷 异丙醇
4 ℃冰箱放置 10000rpm离心 弃上清液
20min-2h
2、DNA样品不纯，DNA降解，抑制后续酶解和PCR反应
解决方法：
尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融； 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液； 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含 量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔； 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌； 将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融； 高温裂解时，时间适当延长； 增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。
打开BioEdit程序，将目标 文件转化为FASTA格式
粘贴至Word文档进行 编辑
打开Mega 程序，转化为 Mega格式，并激活文件
提交序列 步骤与原理
最后，将分析完成的序列，采用Sequin 软件向GenBank 提交基因序列，获得相应的序列登记号。
测序与分析 步骤与原理
步骤：
Sequin开始界面
2003 年，加拿大Guelph 大学Hebert 等首次正式提出了DNA 条形码 概念，2004 年成立了生物条形码联盟，目前有来自50 个国家的两百多 个组织成为其成员，2007 年5 月加拿大Guelph 大学组建了世界上第一 个DNA barcoding 鉴定中心，2009 年1 月正式启动“国际生命条形码计 划”，中国科学院代表中国与加拿大、美国和欧盟共同为iBOL 4 个中心 节点。线粒体细胞色素C氧化酶基因COⅠ具有引物通用性高和进化速率 快等优点，是理想的动物DNA 条形码。而且，大量研究结果证明了 COⅠ条形码对动物物种的识别和鉴定切实可行
树可分为“有根树”和“无根树”两类。 有根树是具有方向的树，包含唯一的节点，将其作为树中 所有物种的最近共同祖先。把有根树去掉根即成为无根树 一棵无根树在没有其他信息（外群）或假设（如假设最大 枝长为根）时不能确定其树根。无根树是没有方向的，其中线 段的两个演化方向都有可能。
测序与分析 步骤与原理
优点
准确性高 快捷，鉴定效率高
样品要求低 用于传统形态学分类难区分的物种
不受个体发育阶段影响 发现、鉴定新物种与隐存种
步骤与原理
收集样品
DNA提取
纯度检测
PCR引物 设计
提交序列
测序及 序列分析
PCR扩增 及产物纯化
样品采集 步骤与原理
采集信息主要包含研究人员的野外采集记录、标本信 息、鉴定信息等。
输入Title，作者， 联系方式等
添加序列
保存序列
GenBank格式的界面 最后修改
发送邮件，提交序列
添加序列的 注释信息
取样
问题及解决方法
注意：
1、尽可能增加种内的取样个数，至少3-5个产地，每种1-2个体 2、详细记录野外采集记录、标本信息、鉴定信息
DNA提取 问题及解决方法
1、CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物 材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃
促 进 了 先 秦 时期学
汇报题目
植物DNA条形码的研究
作者：刘 锋
汇报内容
1
DNA条形码概述
2
步骤及原理
3 常见问题及解决方法
4
思考及展望
概念
概述
DNA条形码（DNA barcode）是指生物体内 能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易 扩增且相对较短的DNA片段
是利用一个或少数的几个DNA片段对地球上 现有物种进行识别和鉴定的一项新技术，是近年 来进展最迅速的学科前沿之一。
地在体外扩增任何目的DNA。
PCR引物设计 步骤与原理
引物设计原则
“黄金11条”
1.引物最好在模板DNA的保守区内设计； 2.引物长度一般在15~30碱基之间 ； 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃； 4.引物3′端要避开密码子的第3位； 5.引物3′端不能选择A，最好选择T； 6. 碱基要随机分布； 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列； 8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低； 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰； 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构； 11. 引物应具有特异性。
primer1(10pmol/μl) 2μl
primer2(10pmol/μl) 2μl
Taq 酶
1-2U
Template
1ul（质粒10ng足够，不要超过1ug）
加样顺序依上述体系从上至下顺序，加入到PCR管中.进行PCR, 设计相对应的扩增程序。
一般条件：94℃5min-- (94℃30s 55℃30s 72℃30s-1min)2030次循环-- 72℃7min-- 4℃ 5min