微生物检测之金黄色葡萄球菌

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食品微生物学检验金黄色葡萄球菌

引用的作品
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血浆凝固酶实验
血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上，分别接种到5 mLBHI和营养琼脂小斜面，36 ±1℃培养18 h～24 h 。取新鲜配置兔血浆0.5 mL ，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2mL～0.3mL ，振荡摇匀，置 36 ±1℃温箱或水浴箱内。每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36±1℃培养18 h～48h ，重复试验。
第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数
结果
列出完成实验所使用的所有步骤。切记要为步骤加编号。添加实验照片。
第三法金黄色葡萄球菌MPN计数
最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。 MPN法原理与局限C:\Users\华侃\Desktop\MPN法的原理与局限性分析.pdf

9.8.188.食品微生物快速检测金黄色葡萄球菌定性检测

葡萄球菌的 Nhomakorabea速检测方法
3M™ Petrifilm™ 金黄色葡萄球菌测试片(STX) ▪ 标准Baird-Parker培养基 ▪ 22-29小时确认结果 ▪ 提供确认反应片对可疑菌落作确认性判读
葡萄球菌的快速检测方法
▪ 选择性配方-抑制非目标菌的生长
▪ 金黄色葡萄球菌是唯一能将测试片中的指示剂转化成紫红色色素的细菌。
▪ 可能出现黑色或蓝绿色菌落。 ▪ 先将紫红色菌落圈出，再加确认
反应片，1–3h,粉红色晕圈。
▪ 合理计数范围15-150。
粉红色晕圈
总结
思考题
1.金黄色葡萄球菌有哪些危害？ 2.如何利用金黄色葡萄球菌快速检测试纸进行定性鉴定？ 3.金黄色葡萄球菌快速检测适合在那些领域使用？
谢谢观看
金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus )
Staphyle -“葡萄串”
Coccus—“浆果”
▪ 球菌科的一个属 ▪ 革兰氏阳性球菌 ▪ 直径0.5 - 1.5 微米 ▪ 单个, 成对, 不规则成群 ▪ 过氧化氢酶阳性 ▪ 非动力 ▪ 兼性厌氧
葡萄球菌的检测方法
36℃±1℃
18h~24h
血浆凝固酶试验
报告
金黄色葡萄球菌检测程序
葡萄球菌的检测方法
初步鉴定溶血情况，金黄色葡萄球菌在BP平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径在2~3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈，外有清晰带。
葡萄球菌的检测方法
在血平板上，形成菌落较大，圆形，光滑凸起、湿润、金黄色，菌落周围可见透明溶血圈。
食品中金黄色葡萄球菌的定性测定依据 GB 4789.10-2016 食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌的检查

金黄色葡萄球菌的检查同学们，这一节我们一起来学习一下第四章微生物限度检查法中的金黄色葡萄球菌的检查。

金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属中的一种。

本菌在自然界分布甚广，空气、土壤、水和日常用具，人的皮肤。

看，这就是金黄色葡萄球菌，它是一种革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。

该菌是葡萄球菌中致病力最强的一种，可经皮肤、粘膜侵入人体引起化脓性病变等局部及全身化脓性炎症，严重时可导致败血症。

所以，国家规定外用药品和一般滴眼剂、眼膏剂、软膏剂等规定不得检出金黄色葡萄球菌，检验金黄色葡萄球菌有重要意义。

金黄色葡萄球菌的操作流程如图所示，与之前讲述过的其他控制菌的检查一样：在完成培养基的配制和供试品的处理后，用营养肉汤于30～35℃增菌培养18～24小时，必要时可延至48小时。

增菌培养的目的使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。

接着，进行分离纯化，其目的是使被检菌从混合菌中分离出来。

以接种环沾取以接种环沾取1～2环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置30～35℃培养24～72小时。

当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表中所列特征，可判为未检出金黄色葡萄球菌。

若供试品分离平板生长的菌落与表中所列特征相似疑似时，应选取2～3个以上菌落，分别接种于营养琼脂斜面上，于30～35℃培养18～24小时，取其培养物做以下检查。

1. 革兰染色镜检革兰染色镜检观察显微镜下的细菌结构是否符合金黄色葡萄球菌的形态特征：金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，无荚膜。

排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列，菌体较小。

2. 血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，能将血浆里的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血浆凝固。

检查时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察，阴性对照管血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固状，若试验管液血浆凝固为血浆凝固酶试验阳性；否则为阴性。

金黄色葡萄球菌标准菌株

金黄色葡萄球菌标准菌株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的细菌，它可以在人体的皮肤和黏膜上找到。

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，通常呈现为球状，呈金黄色。

它是一种条件致病菌，可以引起多种感染，包括皮肤感染、食物中毒和严重的系统性感染。

金黄色葡萄球菌的标准菌株是指在实验室中被广泛使用的一种金黄色葡萄球菌菌株，它具有代表性，可以用于研究金黄色葡萄球菌的生物学特性、致病机制以及药物敏感性等方面的研究。

标准菌株的选取对于科研工作具有重要意义，它可以保证实验结果的可重复性和可比性，是科学研究中的重要基础。

金黄色葡萄球菌标准菌株的选取需要考虑多个因素，包括菌株的来源、鉴定方法、保存条件等。

首先，菌株的来源需要可靠，最好是从公认的菌种保藏中心或者专业实验室获取。

其次，菌株的鉴定方法需要准确，可以通过生化鉴定、分子生物学方法或质谱分析等手段进行确认。

此外，菌株的保存条件也是选择标准菌株时需要考虑的因素，菌株的保存条件包括温度、培养基、保存液等，需要根据菌株的特性进行合理选择。

金黄色葡萄球菌标准菌株在科研工作中具有重要的应用价值。

首先，它可以作为阳性对照菌株，用于评估新的检测方法的准确性和灵敏度。

其次，金黄色葡萄球菌标准菌株可以用于研究金黄色葡萄球菌的毒力因子和致病机制，有助于深入了解金黄色葡萄球菌引起感染的原因和发展新的治疗方法。

此外，金黄色葡萄球菌标准菌株还可以用于药物敏感性试验，帮助临床医生选择最有效的抗生素治疗金黄色葡萄球菌感染。

总之，金黄色葡萄球菌标准菌株的选择和应用对于科研工作具有重要意义，它可以保证实验结果的可靠性和可比性，有助于推动金黄色葡萄球菌相关研究的进展，为预防和治疗金黄色葡萄球菌感染提供重要的科学依据。

在今后的研究工作中，科研人员需要根据具体的研究目的和要求选择合适的金黄色葡萄球菌标准菌株，并结合先进的实验技术，开展深入系统的研究工作，为保障人类健康做出更大的贡献。

微生物-金黄色葡萄球菌

整理版ppt
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
25g样品+ 225ml 生理盐水
5mL样品匀液（1:10）+ 50mL胰酪胨大豆肉汤
36± 1℃ 24hr
定性检测
血平板
BP平板
36± 1℃ 24hr 镜检与肉浸液肉汤培养
36± 1℃ 24hr
血浆凝固酶试验
36± 1℃ 6hr
整理版ppt
整理版ppt
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
大多数菌株最适生长温度30-37℃，最适pH为7.0-7.5；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。
一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5% 氯化钠肉汤增菌。
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食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
整理版ppt
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验 B-P平板
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食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验检验程序 ——鉴定之革兰氏染色镜检
革兰氏阳性，球形，组成葡萄状
整理版ppt
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验检验程序 ——鉴定之凝固酶试验
金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶，因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶。
36± 1℃ 24hr
血平板
36± 1℃ 24hr
7．5％氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤
36± 1℃ 24hr
血平板，Baird-parker
涂片染色
观察溶血
血浆凝固酶试验
报告整理版ppt
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验检验程序 ——增菌培养

金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析

金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析【摘要】金黄色葡萄球菌是导致多种感染的重要病原体，对其进行准确快速的检验至关重要。

本文首先介绍了金黄色葡萄球菌检验技术的原理，包括典型菌株鉴定和培养特点；其次详细描述了金黄色葡萄球菌检验方法，包括传统和分子生物学技术；接着分析了检验结果的意义和如何应对不同结果；最后探讨了金黄色葡萄球菌检验技术的优势和在临床应用中的意义。

在文章讨论了金黄色葡萄球菌检验技术的发展前景以及其局限性和未来发展方向。

通过本文的介绍和分析，读者将更全面地了解金黄色葡萄球菌检验技术，有助于提高对该病原体的检测与管理水平，促进临床诊疗水平的提升。

【关键词】金黄色葡萄球菌、检验技术、原理、方法、结果分析、优势、临床应用、发展前景、局限性、未来发展方向1. 引言1.1 背景介绍金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可导致多种感染性疾病，如皮肤感染、败血症等。

因其对抗生素的抗性逐渐增加，使得对其进行有效检验和监测显得尤为重要。

金黄色葡萄球菌检验技术是一种能够快速准确检测金黄色葡萄球菌的方法，对于临床诊断和治疗具有重要意义。

背景介绍的部分主要从以下几个方面展开：介绍金黄色葡萄球菌的基本特征，包括其形态特征、生长条件等；说明金黄色葡萄球菌对人体的危害和致病机制，引出对其进行检验的必要性；介绍目前金黄色葡萄球菌感染的流行状况和抗生素抗性情况，指出对其进行检验的紧迫性；简要介绍当前金黄色葡萄球菌检验技术的发展现状和存在的问题，为后续正文内容做铺垫。

通过背景介绍，读者可以对金黄色葡萄球菌检验技术的研究和应用有一个初步的了解，为后续内容的阐述提供了必要的背景信息。

1.2 研究意义金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，在医疗卫生领域中具有重要的病原检测价值。

对于金黄色葡萄球菌的检测技术的研究意义主要可以从以下几个方面来看：1. 临床诊断：金黄色葡萄球菌是导致各种感染的主要细菌之一，如皮肤感染、呼吸道感染等。

准确检测金黄色葡萄球菌的存在可以帮助医生及时诊断并采取相应的治疗措施，有助于提高治疗效果和减少治疗成本。

金黄色葡萄球菌检验

【GB/T 4789.10—1994】金黄色葡萄球菌检验1主题内容与适用范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。

本标准适用于食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检验。

2引用标准GB 4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料 3.1显微镜。

3.2温箱：36±1℃。

3.3离心机。

3.4灭菌吸管：1mL、10mL。

3.5灭菌试管。

3.6灭菌平皿。

3.7均质器。

3.8载玻片。

3.9L型涂布棒。

3.10酒精灯。

3.11接种环。

4培养基和试剂4.1胰酪陈大豆肉汤：按GB 4789.28中4.59规定。

4.27.5%氯化钠肉汤：按GB 4789.28中4.61规定。

4.3血琼脂平板：按GB 4789.28中4.6规定。

4.4Baird－Prker琼脂平板：按GB 4789.28中4.60规定。

4.5肉浸液肉汤：按GB 4789.28中4.1规定。

4.6灭菌盐水。

4.7兔血浆：按GB 4789.28中 4.63规定。

5检验程序金黄色葡萄球菌检验程序如下：（图略）6操作步骤 6.1增菌培养法 6.1.1检样处理称取25g固体样品；吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。

6.1.2增菌及分离培养吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤50mL培养基内，置36±1℃温箱培养24h，转种血平板和Baird－Parker平板，36±1℃培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

6.1.3形态本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1μm。

6.1.4在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。

食品中微生物的检测-金黄色葡萄球菌检验

免疫学方法
抗原制备
从金黄色葡萄球菌中提取特异性抗原，制备成免疫原。
抗体制备
利用抗原抗体特异性结合的原理，通过凝集反应、沉淀反应等方法检测样品中的金黄色
葡萄球菌。
抗原抗体反应
将免疫原注射到动物体内，刺激机体产生特异性抗体。
结果判定
根据反应结果判断样品中是否含有金黄色葡萄球菌。
分子生物学方法
食品中微生物的检测-金黄色葡萄球菌检验
目录
• 引言 • 金黄色葡萄球菌概述 • 样品采集与处理 • 微生物学检测方法 • 理化检测方法 • 结果分析与报告 • 质量控制与实验室安全
01
引言
目的和背景
保障食品安全
金黄色葡萄球菌是一种常见的食品污染源，可引起食物中毒，对公众健康构成威胁。因此，检测食品中的金黄色葡萄球菌对于保障食品安全具有重要意义。
适量性
根据检测方法和目的，采集适量样品，以满足检测需求。
样品保存与运
低温保存
样品应尽快放入低温环境（如4℃冰箱）中保存，以减缓微生物的生长速度。
避免反复冻融
尽量避免样品在保存过程中反复冻融，以免影响微生物的存活和检测结果的准确性。
快速运输
样品在运输过程中应保持低温，并尽快送达实验室进行检测。
04
微生物学检测方法
传统培养法
增菌培养
将液体样品接种到选择性增菌液中，于适宜温度下培养一定时间，使金黄色葡萄球菌得以增殖。
鉴定
通过观察菌落形态、革兰氏染色、血浆凝固酶试验等生化特征进行鉴定。
01
02
样品处理
取适量食品样品，进行均质化处理，得到均匀一致的液体样品。
03
04

实验十二金黄色葡萄球菌

可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂，产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱。
致病性金葡菌可产生血浆凝固酶。
精品课件
5
金葡菌镜下特征
精品课件
6
操作流程
检样25g(mL) +稀释液225mL，均质
7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤）
36℃±1 ℃， 18h~24h
Baird-Parker平板，血平板
36℃±1 ℃
B-P平板18h~24h或45h~48h 血平板 18h~24h
涂片染色
观察溶血
BHI肉汤和营养琼脂斜面血浆凝固酶试验
结果报告
精品课件
7
菌落特征
Baird-Parker平板：呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径 2mm~3mm。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
精品课件
23
取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入 BHI培养物 0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，置 36 ±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。
精品课件
3
生化特性
典型的金葡菌呈球形，大小0.5×1.0μm。致病性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长，常呈双球菌或短链状排列。
本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜。革兰氏染色阳性。
金葡菌耐盐性强，最适宜生长的盐浓度为 5%～7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌，抑制杂菌。

食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验

金黄色葡萄球菌的流行病学
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上， 50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。
金黄色葡萄球菌的流行病学
近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。
目前，随着研究的深入，一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。比如：法国梅里埃公司生产的RPF培养基、API检测系统等。梅里埃公司生产的mini VIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌肠毒素，在仪器上45 min可以得到结果。
金黄色葡பைடு நூலகம்球菌的致病性
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F六种血清型。
金黄色葡萄球菌的流行病学特点

GB 4789.10-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验

中华人民共和国国家标准G B4789.10 2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会前言本标准代替G B4789.10 2010‘食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验“㊁S N/T0172 2010‘进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法“㊁S N/T2154 2008‘进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术“㊂本标准与G B4789.10 2010相比,主要变化如下:试验用增菌液统一为7.5%氯化钠肉汤㊂食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验1范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)的检验方法㊂本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品中金黄色葡萄球菌的计数㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂2.2冰箱:2ħ~5ħ㊂2.3恒温水浴箱:36ħ~56ħ㊂2.4天平:感量0.1g㊂2.5均质器㊂2.6振荡器㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂2.8无菌锥形瓶:容量100m L㊁500m L㊂2.9无菌培养皿:直径90mm㊂2.10涂布棒㊂2.11p H计或p H比色管或精密p H试纸㊂3培养基和试剂3.17.5%氯化钠肉汤:见A.1㊂3.2血琼脂平板:见A.2㊂3.3 B a i r d-P a r k e r琼脂平板:见A.3㊂3.4脑心浸出液肉汤(B H I):见A.4㊂3.5兔血浆:见A.5㊂3.6稀释液:磷酸盐缓冲液:见A.6㊂3.7营养琼脂小斜面:见A.7㊂3.8革兰氏染色液:见A.8㊂3.9无菌生理盐水:见A.9㊂第一法金黄色葡萄球菌定性检验4检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1㊂图1金黄色葡萄球菌检验程序5操作步骤5.1样品的处理称取25g样品至盛有225m L7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或放入盛有225m L7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~ 2m i n㊂若样品为液态,吸取25m L样品至盛有225m L7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀㊂5.2增菌将上述样品匀液于36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长㊂5.3分离将增菌后的培养物,分别划线接种到B a i r d-P a r k e r平板和血平板,血平板36ħʃ1ħ培养18h~ 24h㊂B a i r d-P a r k e r平板36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂5.4初步鉴定金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,表面光滑㊁凸起㊁湿润㊁菌落直径为2mm~3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带㊂当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感㊂有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同㊂从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥㊂在血平板上,形成菌落较大,圆形㊁光滑凸起㊁湿润㊁金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈㊂挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验㊂5.5确证鉴定5.5.1染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5μm~1μm㊂5.5.2血浆凝固酶试验:挑取B a i r d-P a r k e r平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接种到5m LB H I和营养琼脂小斜面,36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂取新鲜配制兔血浆0.5m L,放入小试管中,再加入B H I培养物0.2m L~0.3m L,振荡摇匀,置36ħʃ1ħ温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果㊂同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照㊂也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验㊂结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5m LB H I,36ħʃ1ħ培养18h~48h,重复试验㊂5.6葡萄球菌肠毒素的检验(选做)可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录B检测葡萄球菌肠毒素㊂6结果与报告6.1结果判定:符合5.4㊁5.5,可判定为金黄色葡萄球菌㊂6.2结果报告:在25g(m L)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌㊂第二法金黄色葡萄球菌平板计数法7检验程序金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序见图2㊂图2金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序8操作步骤8.1样品的稀释8.1.1固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或置于盛有225m L稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂8.1.2液体样品:以无菌吸管吸取25m L样品置于盛有225m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂8.1.3用1m L无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L 无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂8.1.4按8.1.3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液㊂每递增稀释一次,换用1次1m L无菌吸管或吸头㊂8.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1m L样品匀液以0.3m L㊁0.3m L㊁0.4m L接种量分别加入三块B a i r d-P a r k e r平板,然后用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘㊂使用前,如B a i r d-P a r k e r平板表面有水珠,可放在25ħ~50ħ的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失㊂8.3培养在通常情况下,涂布后,将平板静置10m i n,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36ħʃ1ħ培养1h;等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂8.4典型菌落计数和确认8.4.1金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,表面光滑㊁凸起㊁湿润㊁菌落直径为2mm~ 3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带㊂当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感㊂有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同㊂从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥㊂8.4.2选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20C F U~ 200C F U之间的平板,计数典型菌落数㊂8.4.3从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验㊂分别做染色镜检,血浆凝固酶试验(见5.5);同时划线接种到血平板36ħʃ1ħ培养18h~24h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌菌落较大,圆形㊁光滑凸起㊁湿润㊁金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈㊂9结果计算9.1若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20C F U~200C F U之间,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.2 若最低稀释度平板的典型菌落数小于20C F U ,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.3 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200C F U ,但下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.4 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200C F U ,而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20C F U~200C F U 范围内,应计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.5 若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20C F U~200C F U 之间,按式(2)计算㊂9.6 计算公式式(1):T =A BC d(1)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A某一稀释度典型菌落的总数;B某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;C某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;d 稀释因子㊂式(2):T =A 1B 1/C 1+A 2B 2/C 21.1d(2)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A 1第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B 1第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C 1第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;A 2第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B 2第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C 2第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;1.1计算系数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂10 报告根据9中公式计算结果,报告每g (m L )样品中金黄色葡萄球菌数,以C F U /g(m L )表示;如T 值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告㊂第三法金黄色葡萄球菌M P N 计数11 检验程序金黄色葡萄球菌M P N 计数检验程序见图3㊂图3金黄色葡萄球菌M P N法检验程序12操作步骤12.1样品的稀释按8.1进行㊂12.2接种和培养12.2.1根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种1m L样品匀液至7.5%氯化钠肉汤管(如接种量超过1m L,则用双料7.5%氯化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物36ħʃ1ħ培养,18h~24h㊂12.2.2用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于B a i r d-P a r k e r平板36ħʃ1ħ培养,24h~48h㊂12.3典型菌落确认按8.4.1㊁8.4.3进行㊂13结果与报告根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数,查M P N检索表(见附录C),报告每g(m L)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数,以M P N/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.17.5%氯化钠肉汤A.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠75g蒸馏水1000m LA.1.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.4ʃ0.2,分装,每瓶225m L,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.2血琼脂平板A.2.1成分豆粉琼脂(p H7.5ʃ0.2)100m L脱纤维羊血(或兔血)5m L~10m LA.2.2制法加热溶化琼脂,冷却至50ħ,以无菌操作加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板㊂A.3B a i r d-P a r k e r琼脂平板A.3.1成分胰蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母膏1.0g丙酮酸钠10.0g甘氨酸12.0g氯化锂(L i C l㊃6H2O)5.0g琼脂20.0g蒸馏水950m LA.3.2增菌剂的配法30%卵黄盐水50m L与通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液10m L混合,保存于冰箱内㊂A.3.3制法将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,调节p H至7.0ʃ0.2㊂分装每瓶95m L,121ħ高压灭菌15m i n㊂临用时加热溶化琼脂,冷至50ħ,每95m L加入预热至50ħ的卵黄亚碲酸钾增菌剂5m L摇匀后倾注平板㊂培养基应是致密不透明的㊂使用前在冰箱储存不得超过48h㊂A.4脑心浸出液肉汤(B H I)A.4.1成分胰蛋白质胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(12H2O)2.5g葡萄糖2.0g牛心浸出液500m LA.4.2制法加热溶解,调节p H至7.4ʃ0.2,分装16mmˑ160mm试管,每管5m L置121ħ,15m i n灭菌㊂A.5兔血浆取柠檬酸钠3.8g,加蒸馏水100m L,溶解后过滤,装瓶,121ħ高压灭菌15m i n㊂兔血浆制备:取3.8%柠檬酸钠溶液一份,加兔全血4份,混好静置(或以3000r/m i n离心30m i n),使血液细胞下降,即可得血浆㊂A.6磷酸盐缓冲液A.6.1成分磷酸二氢钾(K H2P O4)34.0g蒸馏水500m LA.6.2制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500m L蒸馏水中,用大约175m L的1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至7.2,用蒸馏水稀释至1000m L后贮存于冰箱㊂稀释液:取贮存液1.25m L,用蒸馏水稀释至1000m L,分装于适宜容器中,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.7营养琼脂小斜面A.7.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g~20.0g蒸馏水1000m LA.7.2制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2m L调节p H至7.3ʃ0.2㊂加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化,分装13mmˑ130mm试管,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.8革兰氏染色液A.8.1结晶紫染色液A.8.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20.0m L1%草酸铵水溶液80.0m LA.8.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.8.2革兰氏碘液A.8.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.8.2.2制法将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.8.3沙黄复染液A.8.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LA.8.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.8.4染色法a)涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1m i n,水洗㊂b)滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂c)滴加95%乙醇脱色约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂d)滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A.9无菌生理盐水A.9.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000m LA.9.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000m L蒸馏水中,121ħ高压灭菌15m i n㊂附录B葡萄球菌肠毒素检验B.1试剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯,试验用水应符合G B/T6682对一级水的规定㊂B.1.1 A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型E L I S A检测试剂盒㊂B.1.2p H试纸,范围在3.5~8.0,精度0.1㊂B.1.30.25m o l/L㊁p H8.0的T r i s缓冲液:将121.1g的T r i s溶解到800m L的去离子水中,待温度冷至室温后,加42m L浓H C L,调p H至8.0㊂B.1.4p H7.4的磷酸盐缓冲液:称取N a H2P O4㊃H2O0.55g(或N a H2P O4㊃2H2O0.62g)㊁N a2H P O4㊃2H2O2.85g(或N a2H P O4㊃12H2O5.73g)㊁N a C l8.7g溶于1000m L蒸馏水中,充分混匀即可㊂B.1.5庚烷㊂B.1.610%次氯酸钠溶液㊂B.1.7肠毒素产毒培养基B.1.7.1成分蛋白胨20.0g胰消化酪蛋白200m g(氨基酸)氯化钠5.0g磷酸氢二钾1.0g磷酸二氢钾1.0g氯化钙0.1g硫酸镁0.2g菸酸0.01g蒸馏水1000m Lp H7.3ʃ0.2B.1.7.2制法将所有成分混于水中,溶解后调节p H,121ħ高压灭菌30m i n㊂B.1.8营养琼脂B.1.8.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g~20.0g蒸馏水1000m LB.1.8.2制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2m L校正p H至7.3ʃ0.2㊂加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化㊂分装烧瓶,121ħ高压灭菌15m i n㊂B.2仪器和设备B.2.1电子天平:感量0.01g㊂B.2.2均质器㊂B.2.3离心机:转速3000g~5000g㊂B.2.4离心管:50m L㊂B.2.5滤器:滤膜孔径0.2μm㊂B.2.6微量加样器:20μL~200μL㊁200μL~1000μL㊂B.2.7微量多通道加样器:50μL~300μL㊂B.2.8自动洗板机(可选择使用)㊂B.2.9酶标仪:波长450n m㊂B.3原理本方法可用A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型酶联免疫吸附试剂盒完成㊂本方法测定的基础是酶联免疫吸附反应(E L I S A)㊂96孔酶标板的每一个微孔条的A~E孔分别包被了A㊁B㊁C㊁D㊁E 型葡萄球菌肠毒素抗体,H孔为阳性质控,已包被混合型葡萄球菌肠毒素抗体,F和G孔为阴性质控,包被了非免疫动物的抗体㊂样品中如果有葡萄球菌肠毒素,游离的葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的特定抗体结合,形成抗原抗体复合物,其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉;抗原抗体复合物再与过氧化物酶标记物(二抗)结合,未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉;加入酶底物和显色剂并孵育,酶标记物上的酶催化底物分解,使无色的显色剂变为蓝色;加入反应终止液可使颜色由蓝变黄,并终止了酶反应;以450n m波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值,样品中的葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比㊂B.4检测步骤B.4.1从分离菌株培养物中检测葡萄球菌肠毒素方法待测菌株接种营养琼脂斜面(试管18mmˑ180mm)36ħ培养24h,用5m L生理盐水洗下菌落,倾入60m L产毒培养基中,36ħ振荡培养48h,振速为100次/m i n,吸出菌液离心,8000r/m i n 20m i n,加热100ħ,10m i n,取上清液,取100μL稀释后的样液进行试验㊂B.4.2从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法B.4.2.1牛奶和奶粉将25g奶粉溶解到125m L㊁0.25M㊁p H8.0的T r i s缓冲液中,混匀后同液体牛奶一样按以下步骤制备㊂将牛奶于15ħ,3500g离心10m i n㊂将表面形成的一层脂肪层移走,变成脱脂牛奶㊂用蒸馏水对其进行稀释(1ʒ20)㊂取100μL稀释后的样液进行试验㊂B.4.2.2脂肪含量不超过40%的食品称取10g样品绞碎,加入p H7.4的P B S液15m L进行均质㊂振摇15m i n㊂于15ħ,3500g离心10m i n㊂必要时,移去上面脂肪层㊂取上清液进行过滤除菌㊂取100μL的滤出液进行试验㊂B.4.2.3脂肪含量超过40%的食品称取10g样品绞碎,加入p H7.4的P B S液15m L进行均质㊂振摇15m i n㊂于15ħ,3500g离心10m i n㊂吸取5m L上层悬浮液,转移到另外一个离心管中,再加入5m L的庚烷,充分混匀5m i n㊂于15ħ,3500g离心5m i n㊂将上部有机相(庚烷层)全部弃去,注意该过程中不要残留庚烷㊂将下部水相层进行过滤除菌㊂取100μL的滤出液进行试验㊂B.4.2.4其他食品可酌情参考上述食品处理方法㊂B.4.3检测B.4.3.1所有操作均应在室温(20ħ~25ħ)下进行,A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型E L I S A检测试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温方可使用㊂测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头,用过的吸头以及废液处理前要浸泡到10%次氯酸钠溶液中过夜㊂B.4.3.2将所需数量的微孔条插入框架中(一个样品需要一个微孔条)㊂将样品液加入微孔条的A~G 孔,每孔100μL㊂H孔加100μL的阳性对照,用手轻拍微孔板充分混匀,用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发,置室温下孵育1h㊂B.4.3.3将孔中液体倾倒至含10%次氯酸钠溶液的容器中,并在吸水纸上拍打几次以确保孔内不残留液体㊂每孔用多通道加样器注入250μL的洗液,再倾倒掉并在吸水纸上拍干㊂重复以上洗板操作4次㊂本步骤也可由自动洗板机完成㊂B.4.3.4每孔加入100μL的酶标抗体,用手轻拍微孔板充分混匀,置室温下孵育1h㊂B.4.3.5重复B.4.3.3的洗板程序㊂B.4.3.6加50μL的TM B底物和50μL的发色剂至每个微孔中,轻拍混匀,室温黑暗避光处孵育30m i n㊂B.4.3.7加入100μL的2m o l/L硫酸终止液,轻拍混匀,30m i n内用酶标仪在450n m波长条件下测量每个微孔溶液的O D值㊂B.4.4结果的计算和表述B.4.4.1质量控制测试结果阳性质控的O D值要大于0.5,阴性质控的O D值要小于0.3,如果不能同时满足以上要求,测试的结果不被认可㊂对阳性结果要排除内源性过氧化物酶的干扰㊂B.4.4.2临界值的计算每一个微孔条的F孔和G孔为阴性质控,两个阴性质控O D值的平均值加上0.15为临界值㊂示例:阴性质控1=0.08阴性质控2=0.10平均值=0.09临界值=0.09+0.15=0.24B.4.4.3结果表述O D值小于临界值的样品孔判为阴性,表述为样品中未检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素;O D值大于或等于临界值的样品孔判为阳性,表述为样品中检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素㊂B.5生物安全因样品中不排除有其他潜在的传染性物质存在,所以要严格按照G B19489‘实验室生物安全通用要求“对废弃物进行处理㊂附录C金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)检索表每g(m L)检样中金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)的检索见表C.1㊂表C.1金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)检索表阳性管数0.100.010.001M P N 95%置信区间下限上限000<3.0 9.5 0013.00.159.6 0103.00.1511 0116.11.218 0206.21.218 0309.43.638 1003.60.1718 1017.21.318 102113.638 1107.41.320 111113.638 120113.642 121154.542 130164.542 2009.21.438 201143.642 202204.542 210153.742 211204.542 212278.794阳性管数0.100.010.001M P N95%置信区间下限上限220214.542 221288.794 222358.794 230298.794 231368.794 300234.694 301388.7110 3026417180 310439180 3117517200 31212037420 31316040420 3209318420 32115037420 32221040430 323290901000 330240421000 331460902000 33211001804100 333>1100420注1:本表采用3个稀释度[0.1g(m L)㊁0.01g(m L)和0.001g(m L)]㊁每个稀释度接种3管㊂注2:表内所列检样量如改用1g(m L)㊁0.1g(m L)和0.01g(m L)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g (m L)㊁0.001g(m L)㊁0.0001g(m L)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推㊂。

金黄色葡萄球菌的测定

金黄色葡萄球菌的测定1 卫生学意义金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。

2 检验方法2.1 术语与定义金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。

显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。

是常见的引起食物中毒的致病菌。

常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。

2.2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：（1）恒温培养箱：36℃±1℃。

（2）冰箱：2℃～5℃。

（3）恒温水浴箱：37℃～65℃。

（4）天平：感量0.1g。

（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

（6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。

（7）无菌培养皿：直径90mm。

（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.3 培养基和试剂（1）7.5%氯化钠肉汤1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4；2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。

（2）B－P琼脂平板1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.22）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。

3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。

分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。

临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。

培养基应是致密不透明的。

使用前在冰箱储存不得超过48h。

微生物检测技术-金黄色葡萄球菌检测

国内检测标准
GB 4789.10-2010
食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验
GB/T 20944.32008
食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素的测定第3部分：黄曲霉毒素 M1的测定
GB/T 23511.42008
食品安全国家标准食品中脱氢乙酸的测定第4部分：脱氢乙酸含量的测定
样品中的快速检测。
纳米技术
纳米材料如纳米金、纳米孔等在金黄色葡萄球菌检测中展现出巨大潜力，具有高灵敏度、低检测
限和快速响应等优点。
未来研究方向
开发更高效、特异性的检测方法
01
针对金黄色葡萄球菌的不同表型和基因型，开发更高效、特异
性的检测方法，提高检测的准确性和可靠性。
集成化与自动化
02
将多种检测方法集成于一体，实现金黄色葡萄球菌的自动化检
治疗方案的选择。同时，对于流行病学调查和疾病监测也具有重要意义。
05
CATALOGUE
金黄色葡萄球菌检测技术展望
新技术发展与应用
基因组学技术
利用全基因组测序技术，能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌，
并识别其耐药性和毒力基因。
生物传感器技术
生物传感器能够实时、快速地检测金黄色葡萄球菌，具有高灵敏度和特异性，适用于食品和环境
测，提高检测效率，降低人工误差。
多重耐药性研究
03
深入研究金黄色葡萄球菌的多重耐药性机制，为遏制耐药性的
传播提供科学依据和技术支持。
对公共卫生的影响与意义
保障食品安全
金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，通过改进检测技术，能够及时发现和控制食品中的污染，保障公众的食品安全。
预防疾病传播

金黄色葡萄球菌检验与计数,GB4789.10-2016及纸片法-JW

金黄色葡萄球菌的肠毒素
金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物质。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。
近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能产生两种或两种以上的肠毒素。
肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的肽链组成。分子量约为3000左右。易溶于水，难溶于有机溶剂。
分离培养基
Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色葡萄球菌的生长。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约2~3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和透明圈的非典型菌落。
血浆凝固酶试验
挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌落 1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18 h～24 h。
取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.2mL～0.3mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的β溶血环。
血平皿上的形态
血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。
典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，菌落周围有完全透明溶血环。

食品微生物检验：葡萄球菌

的重要指标。

凝固酶较耐热，在l00℃
5、溶纤维蛋白酶

可使人、犬、豚鼠及家兔的已经凝固的纤维蛋白溶
解。溶纤维蛋白酶是一种激酶，可激活血浆蛋白酶原
成为血浆蛋白酶而使纤维蛋白溶解。

凝固酶及溶纤维蛋白酶可在含有血浆的琼脂平板内
同时测定。初次培养后，菌落周围若出现一个不透明圈，表示产生凝固酶，继续培养时，不透明圈消失，说明为溶纤维蛋白酶作用的结果。

（一）形态与染色

典型的葡萄球菌呈球形，直径0.4µm-1.2µm，致病性葡萄
球菌一般较非致病性菌小，且各个菌体的大小及排列也较整
齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂，堆积成为葡萄串
状排列。

在液体培养基中生长，常呈双球或短链状排列，易误认为
链球菌。葡萄球菌无鞭毛及芽胞，一般不形成荚膜，易被碱性染料着色，G+，当衰老、死亡或被白细胞吞噬后常转为革
食品中致病性球菌的检验
一、金黄色葡萄球菌的检验葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品（剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病的腐物寄生菌，也有一些致病的球菌。

食品中生长有金黄色葡萄球菌，是食品卫生的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌可以产生肠毒素，食后能引起食物中毒。因此，检查食品中金黄色葡萄球菌有实际意义。

葡萄球菌的致病力决定于细菌产生的毒素
溶血毒素、杀白血球毒素、肠毒素、血浆凝固酶、溶纤维蛋白酶、透明质酸酶、脱
和酶的能力。
氧核糖核酸酶
1、溶血毒素

多数致病菌株能产生该毒素，使血琼脂平板菌落周溶血毒素是一种外毒素，根据其对动物细胞的溶血

医学金黄色葡萄球菌检验讲解

食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
• 最适生长温度37℃，最适pH为7.4； • 兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好； • 可在高盐环境下生长，15%氯化钠环境下
还能生长； • 一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增
菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
二、检验程序与操作方法
食品安全国家标准GB 4789.10-2016 食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验第一法金黄色葡萄球菌定性检验
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
检样 25g(ml)样品+225ml7.5%氯化钠肉汤，均质
36± 1℃ 18h- 24h
检验程序 ——确证鉴定2.血浆凝固酶试验
金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶，因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶。
试管法挑取BP平板或血平板上至少5个可疑菌落（少于5个
全选，分别接种于BHI肉汤和营养琼脂小斜面， 36±1℃ 培养18h-24h。
取0.5mL无菌生理盐水加入瓶装冻干兔血浆中至完全溶解，加入培养后的BHI肉汤培养物0.2-0.3mL，振荡摇匀，放36±1℃恒温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如凝固体积大于原体积一半时，判定为阳性。
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
金黄色葡萄球菌检验讲
解
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
学习目的与要求
1. 了解金黄色葡萄球菌生物学特性。 2. 掌握金黄色葡萄球菌定性检测程序和检验方法。
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
一、生物学特性——菌体形态及培养特征

金黄色葡萄球菌国家标准检验方法

金黄色葡萄球菌国家标准检验方法一、国家标准检验办法参见GB 4789.10-2010《食品平安国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》其次法和第三法。

1、Baird-Parker平板计数（其次法）本办法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。

1.1、检验流程 1.2、试验步骤 (1）样品的稀释①固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL 缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000-10000r/min均质1-2min，或置盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1：10的样品匀液。

②液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。

③用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL 稀释液的无菌试管中（注重吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合匀称，制成1：100的样品匀液。

④按③操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。

每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

(2）样品的接种按照对样品污染情况的估量，挑选2-3个相宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在举行10倍递增稀释时，每个稀释度分离吸取1mL样品匀液以0.3mL, 0.3mL, 0.4mL接种量分离加入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布囫囵平板，注重不要触及平板边缘。

用法前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25-50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消逝。

(3）培养在通常状况下，涂布后，将平板静置l0min，如样液不易汲取，可将平板放在培养箱（(36±1)℃培养1h；等样品匀液汲取后翻转平皿，倒置于培养箱，(36±1)℃培养，45一48h。

食品中金黄色葡萄球菌检验

式（2）
案例
T A1B1/ C1 A2B2 / C2其中Leabharlann 1.1d样品稀释液
10-1
10-2
典型菌落数
183
21
T：样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
用于做血浆凝固
A1：第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
5
5
酶菌落数
A2：第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1：第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；血浆凝固酶阳性
二、金黄色葡萄球菌定性检测
注意事项
Baird-Parker平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏:提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素丙酮酸钠:生长促进剂亚碲酸盐:对除金黄色葡萄球菌外的其他能分解卵黄菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄:提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂:对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。
36±1℃， 24~48h
圆形，光滑突起，湿润，直径23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。
革兰氏染色
血浆凝固酶鉴别
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢
血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。
36℃±1 ℃
45h~48h
计数及血浆凝固酶试验
GB 4789.10-2016 金黄色葡萄球菌的检验第二法
报告
操作规程
样品稀释同菌落总数检验
选择合适稀释度接种涂布BP平板
三、金黄色葡萄球菌定量检测
样品处理
移1ml