A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性研究

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A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制黄镇;钱雯;袁琳;施競;陈燕;陈南萍;周红军;李文春;杨美峰;刘红岩【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2005(18)6【摘要】目的研制A+C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗。

方法A群和C群脑膜炎球菌多糖在溴化氰(CNBr)的活化下,以1,6己二酰肼(ADH)作为连接子,与精制破伤风类毒素(TT)在碳二亚胺(EDAC)作用下结合,再按一定的比例将两者混合,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液,加保护剂冻干后,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。

结果经检定,A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗各项指标均达到了质控标准。

该疫苗安全性及免疫原性良好。

结论已成功研制出冻干A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗,该制备工艺是可行的。

【总页数】4页(P483-486)【关键词】A+C群脑膜炎球菌多糖;结合疫苗;破伤风类毒素;免疫原性;制备工艺【作者】黄镇;钱雯;袁琳;施競;陈燕;陈南萍;周红军;李文春;杨美峰;刘红岩【作者单位】云南沃森生物技术有限公司;云南大学药学院;云南大学生物制药创新人才培养基地【正文语种】中文【中图分类】R512.3;R517.3【相关文献】1.066 A+C群脑膜炎球菌多糖-DT结合疫苗与多糖疫苗诱导的抗多糖抗体间的功能活性差异 [J],2.072 A+C群脑膜炎球菌结合疫苗与多糖疫苗初免及加强免疫英国大学生的粘膜免疫应答 [J],3.A+C群脑膜炎球菌结合疫苗与多糖疫苗初免及加强免疫英国大学生的粘膜免疫应答 [J], 倪红霞4.A+C群脑膜炎球菌多糖-DT结合疫苗与多糖疫苗诱导的抗多糖抗体间的功能活性差异 [J], 陈琼因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

一种A群C群脑膜炎球菌多糖的制备方法[发明专利]

一种A群C群脑膜炎球菌多糖的制备方法[发明专利]

专利名称:一种A群C群脑膜炎球菌多糖的制备方法专利类型:发明专利
发明人:吴强,马礼耕,钟正丹
申请号:CN201610746650.X
申请日:20160829
公开号:CN106367451A
公开日:
20170201
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本发明公开了一种A群C群脑膜炎球菌多糖的制备方法,包括以下步骤:(1)将脑膜炎球菌进行发酵培养并进行杀菌处理,得到已杀菌的培养液;(2)脑膜炎球菌荚膜多糖制备;(3)将粗制多糖溶进行层析洗脱,收集含有多糖的目标峰,再将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液,用超滤膜包进行脱盐,脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液。

本发明首先通过杀菌处理得到灭活的培养液,再制得荚膜多糖,再采用层析法对荚膜多糖进行纯化,避免了传统纯化方法中对苯酚的大量使用,在保证了纯化质量的基础上,有效的避免了苯酚对环境的破坏,并且多糖回收率与传统苯酚抽提法相近,操作简单,适合大规模生产。

申请人:成都欧林生物科技股份有限公司
地址:610000 四川省成都市高新区天欣路99号
国籍:CN
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脑膜炎球菌多糖菌苗(A群)的新材料和新技术研究

脑膜炎球菌多糖菌苗(A群)的新材料和新技术研究

脑膜炎球菌多糖菌苗(A群)的新材料和新技术研究在脑膜炎球菌相关研究领域,新材料和新技术的应用一直是科学家们追求的目标。

脑膜炎球菌多糖菌苗(A群)的研究旨在开发新的材料和技术,以改善现有疫苗的效力和安全性。

脑膜炎球菌感染是一种严重的疾病,常常引起脑膜炎、败血症和其他严重并发症。

在过去的几十年里,脑膜炎球菌疫苗已经取得了一定的成功,但仍然存在一些挑战,例如传统疫苗的制备过程复杂,疫苗效力有限,而且不同菌株的变异性也增加了疫苗的难度。

针对这些挑战,科学家们正在努力开发新的材料和技术,以提高脑膜炎球菌多糖菌苗(A群)的效力和安全性。

其中之一的新材料是聚糖纳米颗粒,它被用作载体来提供多糖抗原,在免疫系统中诱导更强的免疫反应。

聚糖纳米颗粒具有较大的比表面积和高度可调控性,这使得它们成为一种非常有潜力的疫苗材料。

此外,新的佐剂技术也被引入到脑膜炎球菌多糖菌苗(A群)的研究中,以增强免疫反应。

佐剂是一种辅助物质,用于增强疫苗的免疫原性。

近年来,科学家们已经开发出很多种佐剂,如脂质体、尖晶石和脂多糖等。

这些佐剂可以通过不同的机制提高疫苗的免疫原性和保护效果,从而增强免疫反应。

此外,新的技术手段也正被广泛应用于脑膜炎球菌多糖菌苗(A群)的研究中。

例如,基因工程技术和重组蛋白技术已经被应用于多糖抗原的制备。

通过这些技术手段,科学家们可以更精确地合成和表达多糖抗原,从而提高疫苗的质量和效力。

此外,脑膜炎球菌多糖菌苗的载体也是新技术研究的重点之一。

利用纳米技术,科学家们可以将多糖抗原装载到纳米颗粒中,从而增加疫苗的稳定性和抗原性。

此外,载体还可以对疫苗进行控释,以延长免疫反应的持续时间,从而提高疫苗的保护效果。

除了新材料和新技术的研究,科学家们还在不断探索新的免疫增强策略。

一种策略是多糖-蛋白联合疫苗的开发,通过将多糖抗原与蛋白抗原结合,可以同时激活体液免疫和细胞免疫,从而提高疫苗的效力。

另一种策略是引入新的免疫佐剂,如病毒样颗粒和免疫刺激剂,以增强疫苗的免疫原性和保护效果。

用多糖-破伤风类毒素结合苗制备抗流行性脑膜炎球菌多糖单克隆抗体

用多糖-破伤风类毒素结合苗制备抗流行性脑膜炎球菌多糖单克隆抗体

用多糖-破伤风类毒素结合苗制备抗流行性脑膜炎球菌多糖单克隆抗体李佩珊;张春燕;李时君;陈妍;项美娟;李方和;张洪【期刊名称】《医药导报》【年(卷),期】2011(30)6【摘要】目的研制抗A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体(GAMP mAb).方法以A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(GAMP-TT)耦联物免疫BALB/c 小鼠,用常规细胞融合与克隆化技术获得一株能稳定分泌抗GAMP mAb的杂交瘤细胞株(2E7).采用秋水仙素阻断法测定其染色体数目,降植烷诱导法制备含该抗体的小鼠腹腔积液,辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)灰度扫描测定提取物纯度,改良过碘酸盐氧化法制备辣根过氧化物酶(HRP)标记抗GAMP mAb,并采用中和法及其抗原替代法对抗GAMP mAb的特异性进行初步的鉴定.结果所获得的杂交瘤细胞(2E7)具有很好的生长特性,染色体数目约为139.73条;抗体分泌量适中,Ig亚类为IgG1,提取物浓度1.76~2.32m g·mL-1,纯度97.2%,标记抗GAMP mAb的效价为1:25 600;抗原替代实验与中和实验对其特异性考核,初步结果证实2E7 mAb具有很好的抗GAMP特异性.结论成功制备抗GAMP mAb,为GAMP-TT疫苗的生产监测及产品质量控制提供了必要的物质基础.%Objective To prepare monoclonal antibodies against Neisseria meningococcal serogroup A polysaccharide ( GAMP ). Methods BALB/c mouse was immunized by GAMP-Tetanus Toxoid( TT ). Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies against GAMP were screened after the fusion of mouse splenic cells with SP2/0 cells. The number ofchromosome in hybridoma cell was tested by colchicines-interception, and the ascite of mice was prepared by pristane-inducing method. The mAb was purified hy octansic acid-ammonium sulfate precipitation, and purity of the extracted protein was measured by gray scale-scanning assay of SDS-PAGE. The specificity of anti-GAMP mAb was identified by neutration of antigen and antigen-substitute method. Results The hybridoma ( 2E7 ) had a healthy growth state, and the chromosome of which was 139.73. It produced proper amount of mAh, which was identified to be IgG1. The concentration of extracts was 1. 76-2. 32 mg · mL-1 , and the purity was 97. 2% . The potency of HRP-marked anti-GAMP mAb was 1 ∶ 25 600 , and the anti-GAMP E7 mAb showed a specificity for GAMP by antigen substitution and neutralization assay. Conclusion The anti-GAMP E7 mAb has been successfully obtained, and it makes a necessary foundation for the quality control and manufacture monitoring during preparation of the GAMP-TT vaccine.【总页数】4页(P709-712)【作者】李佩珊;张春燕;李时君;陈妍;项美娟;李方和;张洪【作者单位】武汉大学第一临床学院药剂科,430060;华中科技大学同济医学院附属同济医院实验医学研究中心,武汉,430030;武汉大学第一临床学院药剂科,430060;华中科技大学同济医学院附属同济医院实验医学研究中心,武汉,430030;武汉大学第一临床学院药剂科,430060;华中科技大学同济医学院附属同济医院实验医学研究中心,武汉,430030;武汉大学第一临床学院药剂科,430060【正文语种】中文【中图分类】R979.5;R943【相关文献】1.GBSⅢ荚膜多糖-精制破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性研究 [J], 杨育芳;梁琳琳;孙雪南;孙述学2.6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性 [J], 栗克喜;谈宁芝;刘玉清;冯晓虎;蔡勤;王国钦;余文山3.抗 A、B 和 C 群脑膜炎球菌多糖单克隆抗体的制备及鉴定 [J], 余模松;陈克金;童飞虹;范富林4.甲型副伤寒多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及安全性和免疫原性 [J], 秦敏;杨国友;涂小萍;杨蒲;林丽;黄锴5.A+C群脑膜炎球菌多糖-DT结合疫苗与多糖疫苗诱导的抗多糖抗体间的功能活性差异 [J], 陈琼因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

流脑疫苗的制备

流脑疫苗的制备

A群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备摘要流脑疫苗,流行性脑脊髓膜炎(简称流脑),是由脑膜炎双球菌引起的化脓性脑膜炎。

多见于冬春季,儿童发病率高,注射流脑疫苗是预防流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)。

可以通过将A群脑膜炎球菌多糖以已二酰肼作为多糖和蛋白之间的连接子与精制破伤风类毒素结合,形成A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液,加保护剂后冻干制成A 群脑膜炎球菌多糖结合疫苗,检测其生化、生物学特性和安全性,并考察制品的稳定性的方法来制备。

关键词脑膜炎球菌疫苗制备1 制备原理A群脑膜炎球菌多糖为半抗原,为非T细胞依赖性抗原,当与蛋白结合后,可转化为T 细胞依赖性抗原,可刺激机体产生高水平的保护抗体,重复接种有记忆抗体产生,从而在注射后可以制备出能够使人产生抗体的A群脑膜炎球菌多糖疫苗。

2 制备流程2.1 生产菌种生产用菌种为A群脑膜炎球菌CMCC29201(A4)菌株。

2.2 制备方法经溴化氰活化的A群脑膜炎球菌多糖与己二酰肼(ADH)在合适的条件下形成多糖-酰肼基衍生物然后在碳二亚胺(EDAC)的作用下与破伤风类毒素偶联,形成多糖-蛋白结合物,经Sepharose4FF(5 cm×100 cm)纯化,收集主峰洗脱液,用0·22μm膜除菌过滤即为A 群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液; A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液加入适量保护剂稀释后冻干,即为A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品。

2.3 原液和成品检测检测项目及标准2.4 生化测定A群脑膜炎球菌多糖与蛋白结合的确立及kd值和回收率的计算,采用SephroseCL-4B凝胶柱测定,用紫外检测器于206 nm和280 nm检测, kd≤0·2的多糖回收率应>60%; A群脑膜炎球菌多糖的含量测定是通过Chen氏法测定其磷含量;蛋白含量测定用Lorry 法,多糖和蛋白之比应为0·3~0·7;游离多糖的测定,采用乙醇沉淀法,游离多糖应≤25%。

A群脑膜炎球菌多糖疫苗

A群脑膜炎球菌多糖疫苗

A群脑膜炎球菌多糖疫苗4. 内容:4.1 产品名称及剂型4.1.1 产品名称:A群脑膜炎球菌多糖疫苗4.1.2 产品剂型:冻干粉针剂型4.2 产品概述:本品系用A群脑膜炎奈瑟菌培养液,经提取获得的夹膜多糖抗原,纯化后加入适宜稳定剂后冻干制成,不含防腐剂。

用于预防A群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎。

4.3 生产工艺流程图:菌种(CMCC A4-29201株)↓传代(1代、2代)↓小罐液体培养↓大罐液体培养↓杀菌、去菌体、收集多糖↓纯化↓除菌过滤↓原液检定↓稀释↓半成品检定↓分装↓成品检定↓包装↓成品4.4 生产、分包装和检定操作过程及工艺条件:4.4.1 菌种生产用菌种应符合《中国药典》2010年版三部中“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。

4.4.1.1 菌种名称生产用菌种为A群脑膜炎奈瑟氏球菌CMCC 29201(A4)株。

4.4.1.2 工作种子批的建立工作种子批菌种来源于主种子库。

主种子库菌种经开启,传代扩增后冻干,冻干菌种经检定合格后为工作种子批。

4.4.1.2.1 主种子库菌种传代主种子库菌种启开后传一代于10%羊血N5营养琼脂培养基置35~37℃ CO环境2培养16~48小时,传二代于10%羊血N5营养琼脂培养基置35~37℃培养8~16小时。

4.4.1.2.2 工作种子批菌种的冻干制备生长良好的二代菌种,混悬于脱脂牛奶保护剂中冻干。

4.4.1.2.3 工作种子批菌种的检定4.4.1.2.3.1 培养特性及染色镜检菌种接种于10%羊血N5营养琼脂培养基上脑膜炎球菌25℃不生长,35~37℃ CO 环境培养16~20小时,长出光滑湿润的灰白色圆形菌落。

菌苔易取下,在0.9% 2无菌氯化钠溶液中呈均匀混悬液。

染色镜检应为革兰阴性双球菌或单个球菌。

4.4.1.2.3.2 生化特性接种于葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、果糖、蔗糖于35~37℃培养5~7日,发酵葡萄糖、麦芽糖、(产酸不产气);不发酵甘露醇、果糖、蔗糖(《中华人民共和国药典》2010年版三部中附录ⅩⅣ)。

甲型副伤寒多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及安全性和免疫原性

甲型副伤寒多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及安全性和免疫原性

甲型副伤寒多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及安全性和免疫原性秦敏;杨国友;涂小萍;杨蒲;林丽;黄锴【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2006(19)6【摘要】目的制备甲型副伤寒多糖-破伤风类毒素结合疫苗,并检测其安全性与免疫原性。

方法副甲O-SP溶液加入CDAP活化,己二酰肼(ADH)衍化,在碳二亚胺(EDAC)作用下与破伤风类毒素(TT)偶联,反应物经柱层析纯化,制得多糖蛋白结合物,经质量检测后,进行安全性及免疫原性试验。

结果所制备的结合物多糖蛋白比稳定在0.6~0.8之间,CL-4B检测Kd≤0.2时的回收率大于75%,高相对分子质量结合物含量不低于90%。

免疫双扩散试验显示结合物与副甲家兔超免血清和TT抗血清均产生可见沉淀线。

动物安全试验均合格。

结合物免疫小鼠后,其血清副甲LPS抗体滴度显著增长。

阳转率达到100%。

结论用CDAP活化多糖制备的甲型副伤寒-破伤风类毒素结合疫苗质量稳定,安全可靠,且具有良好的免疫原性。

【总页数】3页(P594-596)【关键词】甲型副伤寒;破伤风类毒素;结合疫苗;安全性;免疫原性【作者】秦敏;杨国友;涂小萍;杨蒲;林丽;黄锴【作者单位】成都生物制品研究所菌苗室【正文语种】中文【中图分类】R512.63【相关文献】1.2型肺炎链球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及免疫原性研究 [J], 张明华;郝倩;魏文进;刘学龙;郑海发;任涛;唐秀丽;韩菲;胡鹏;张美香;曹欣2.007 O139型霍乱弧菌多糖与破伤风类毒素结合疫苗的制备及其对小鼠的免疫原性和保护力研究 [J],3.GBSⅢ荚膜多糖-精制破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性研究 [J], 杨育芳;梁琳琳;孙雪南;孙述学4.甲型副伤寒菌O-特异性多糖与破伤风类毒素结合菌苗的制备及其在小鼠体内的免疫原性 [J], 魏滨;谢贵林;王燕;田玉珍;王先荣因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

A族链球菌多价疫苗的完善制备及其动物免疫保护作用研究

A族链球菌多价疫苗的完善制备及其动物免疫保护作用研究

A族链球菌多价疫苗的完善制备及其动物免疫保护作用研究一、引言链球菌属于革兰氏阳性细菌,其中A族链球菌是一种重要的病原菌,可以引起多种疾病,包括咽喉炎、中耳炎、皮肤感染、败血症、脑膜炎等。

目前,A族链球菌多价疫苗的研发已成为当今医学领域的研究热点之一、本文旨在探讨A族链球菌多价疫苗的制备工艺及其在动物免疫保护方面的作用。

二、A族链球菌多价疫苗的制备1.选取适宜的毒株:制备A族链球菌多价疫苗的首要任务是选取适宜的毒株。

毒株应具有较好的毒力,并且最好覆盖A族链球菌的各个亚型。

2.接种培养:选取的毒株接种到适宜的培养基中进行培养。

在培养的过程中,要注意控制培养条件,如温度、氧气供应等。

3.纯化提取:通过离心、过滤等方法将培养液中的链球菌分离出来,并进行纯化提取。

4.体外鉴定:对提取的链球菌进行体外鉴定,确定其浓度和毒力。

5.制备疫苗:将提取的链球菌制备成多价疫苗,可以添加适当的辅料以增强免疫效果。

6.质量控制:对制备的疫苗进行质量控制,确保其符合所有相关标准。

1.实验设计:选取适当的实验动物,如小鼠、兔子等,进行接种实验。

将实验动物分为实验组和对照组,实验组接种A族链球菌多价疫苗,对照组接种盐水或其他对照物。

2.免疫保护作用评估:通过监测实验动物的抗体水平、免疫细胞活性等指标,评估A族链球菌多价疫苗的免疫保护作用。

3.挑战实验:在完成免疫后,对实验动物进行A族链球菌的挑战实验,观察实验动物是否发病,评估疫苗的保护效果。

4.免疫记忆:通过长期观察实验动物的抗体水平和免疫细胞活性,评估A族链球菌多价疫苗的免疫记忆效应。

5.安全性评估:对接种A族链球菌多价疫苗的实验动物进行安全性评估,检查是否出现不良反应或毒性反应。

四、结论A族链球菌多价疫苗的制备和免疫保护作用研究对于预防和控制A族链球菌感染具有重要意义。

通过研究,可以制备出高效的A族链球菌多价疫苗,并评估其在动物免疫保护方面的作用。

未来的研究可以进一步优化疫苗的制备工艺,提高其免疫效果,为预防A族链球菌感染提供更有效的手段。

1 A+C结合疫苗规程

1 A+C结合疫苗规程
4
液和沉淀后上清中的磷含量 ( 附录 VII A ),计算出 A 群游离多糖的含量, 应不高于 20%; C 群:采用冷酚将结合物原液中与蛋白结合的多糖沉淀,分别测定沉淀前原 液和沉淀后上清中的唾液酸含量( 附录 VI C ),计算出 C 群游离多糖的含 量,应不高于 25%。 同法检测多糖原液沉淀前后的磷含量和唾液酸含量,分别计算多糖回收率, 应为 80%~100%。 3.3.2.5 游离载体蛋白含量 采用高效液相色谱法测定(附录Ⅲ B)。色谱柱 TSK G5000xl(7.8x300); 流 动相为生理氯化钠溶液,pH6.8~7.2;上样量 200μ l,检测波长 280nm,流 速 0.5~0.8ml/min,以破伤风类毒素色谱峰计算理论板数应不低于 500。按 面积归一化法计算,游离载体蛋白含量应不高于 5%。 3.3.2.6 分子大小测定 A 群多糖和 C 群多糖 KD 值在 0.2 以前的洗脱回收率均应≥60%。(附录Ⅷ G)。 3.3.2.7 EDAC 残留量 应不高于 5μ mol/l。(附录 VI Y) 3.3.2.8 氰化物残留量 应不高于 5ng/mg(附录 VI X)。 3.3.4 无菌检查 依法检查(附录Ⅻ A),应符合规定。 3.4 半成品检定 无菌检查 依法检查(附录Ⅻ A)。应符合规定。 3.5 成品检定 除水分、多糖含量、游离多糖含量测定外,按制品标示量加入所附疫苗稀释 液复溶后进行各项检定。 3.5.1 鉴别试验 采用免疫双扩散法测定(附录 VIII C),应分别与 A 群、C 群多糖抗血清及 破伤风抗毒素产生特异性沉淀线。
3.1.2.8 苯酚残留量 A 群、C 群多糖苯酚残留量均应不高于 6.0mg/g(附录Ⅵ M)。 3.1.3 细菌内毒素检查
A 群、C 群多糖均应不高于 25EU/μ g 多糖(附录Ⅻ E)。 3.1.4 无菌检查 依法检查(附录Ⅻ A),应符合规定。 3.2 衍生物检定 3.2.1 衍化率 依法测定(附录 VIII K),应符合批准的要求。 3.3 结合物原液检定 3.3.1 鉴别试验 应用免疫双扩散法(附录 VIII C)测定。多糖-破伤风类毒素结合物应分 别与 A 群脑膜炎球菌抗血清、C 群脑膜炎球菌抗血清、破伤风抗毒素产生特 异性沉淀线。 3.3.2 化学检定 3.3.2.1 多糖含量
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。结果表明, %!&’ 通过与蛋白载体结合, 免
疫原性得到增强, 并产生明显加强效应。 实验研究中用化学方法将 %!&’ 与载体蛋白 质结合形成结合物 ( %!&’($$ ) , 对不同阶段的中间 产物和结合物进行化学特性和抗原性的检测, 并通 过实验动物试验初步观察结合物的免疫原性和产生 的特异性抗体的体外杀菌活性。同时通过不同批次 的 %!&’($$ 比较试验, 以验证其稳定的特异免疫原 性。
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刘方蕾, 吴 兵, 杜 琳, 杨 淼, 王志军, 杨福军, 罗广 ( 兰州生物制品研究所, 兰州! *(##+’ )
! ! 收稿日期: "##$%#&%#’ ;修回日期: "##$%#(%"& ! ! 作者简介: 刘方蕾 ( &)*"%) 女, 硕士, 主要从事细菌性疫苗研究 工作。 万方数据
微生物学免疫学进展 ,##4 年第 )) 卷第 , 期+ + ’<=3 CU &CD<=XC=P />>YU=P, &?O ,##4 , Z=P* )) , .=* ,
摘! 要: 采用溴化氰 ( ,-./) 活化多糖, 以无水己二酸二肼 ( 012) 作为连接剂, &%乙基%&%(% ( (%二甲基氨基%丙基) %碳 为偶联剂制备 0 群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖 ( 4056) 与破伤风类毒素 ( 77 ) 的结合物, 经皮下 化二亚胺 ( 310,) 免疫 -82 小鼠, 用 398:0 检测小鼠血清中抗 4056 及抗载体蛋白的 8;4 抗体水平。用补体介导的体外杀菌试验检 测血清中 4056 抗体的杀菌活性。结果显示, 实验中制备的多糖衍生物和多糖%蛋白质结合物都具有 4056 抗原 特异活性。结合物免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的 4056 血清 8;4 抗体, 并能形成免疫记忆, 产生 再次应答。结合物免疫小鼠所诱生的血清 4056 抗体较之多糖组具有更强的体外杀菌活性。表明此方法制备的 结合物可获得优于多糖的、 稳定的特异免疫原性。 关键词: 0 群脑膜炎球菌;结合疫苗;荚膜多糖;免疫原性 中图分类号: (*<= & > $! ! ! 文献标识码: 0! ! ! 文章编号: &##$%$’*( ( "##$ ) #"%##&+%#* #$%&’$’()*+,,-’$’,(%$).’()*+ ’+/ )001+*2%+),)(3 )+ 0),% 4*$ ,*+512’(% 6’,,)+% *4 !"#$$"%#& ’"(#()*+*++&, 7%$*" 2$*1& ! &*837’,,-’$)/%"(%(’+17 (*9*)/: 47/5,!%&1234 *(##+’ ,;2+&%) !;7($’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’3737745 ;,BAUI;@JC L@KKEAC;,@QHIO@/ QBO?H@KKM@/EFC;8DDIAB;CAEKEJ? !"# $%&’()*+, ,# -+&’, .# !+&, */ %)0 ( !%&1234 "&5/+/4/* 36 -+3)3’+7%) 893:(
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应较弱, 仅产生低水平的特异性抗体。尽管 ! 群奈 瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖能对成人提供保护, 甚至 对婴幼儿具免疫原性, 但其抗体持续时间较短, 不能 诱导免疫记忆
〔 "# 〕
# " 方法 ,* "+ 破伤风类毒素的纯化 破伤风类毒素原液, 纯度为 ,#""* -:L M >3 ’.。 超滤浓缩后经 FING?D<OP F()## 柱层析 ( ,* 9 Q -9D> ) 纯化, 收集分子量为 "2# 1 "4#5R 的洗脱主峰, 用截 留分子量 S "#5R 的滤膜超滤浓缩至蛋白质浓度为 9,* 2>3 M >P, 除菌过滤后置 2T 密闭保存后待用。 ,* ,+ %!&’(!0 衍生物的制备
〔 "2 , "4 〕 多糖衍生方法参照国外文献报道的方法 ,
。而婴幼儿又是脑膜炎球菌感染
的高危人群。因此有必要改进现有疫苗, 提高其对 各年龄组 ( 包括婴儿) 的免疫效果。实验将具免疫 原性的载体蛋白与多糖结合, 使其转化为 $ 细胞依 赖性抗原, 以增强免疫原性和诱导免疫记忆, 提高婴 幼儿和免疫缺陷患者对多糖抗原的免疫反应性。有 关 %!&’(蛋 白 结 合 疫 苗 的 研 究, 有多方面的报 道
! ! 脑膜炎奈瑟菌 ( <*+55*9+% =*&+&’3737745 ) 是细 菌性脑膜炎和脓毒血症的主要致病菌, 全球由脑膜 炎球菌引起的脑膜炎发病率每年达 (# W $# 万, 病死 率约 &#X , 由它导致的败血症死亡率可高达 "#X W $#X
〔 &%( 〕
其中, 0 群、 . 群和 , 群感染占所有感染者的 )#X 。 在发展中国家, 如中国和中非地区, 0 群奈瑟氏脑膜 炎球菌 ( 4/BIQ 0 <*+55*9+% =*&+&’3737745 ,405 ) 是 引发流行性脑膜炎的主要菌群。在 “ 脑膜炎地带” ( 从西到东横贯非洲 &$ 个国家) 近撒哈拉非洲地区
〔 ""(") 〕
在自动 N0 调节仪 ( J?EC=>IHI< ?U?POHCD? !8A-#"P ) 上进行 多 糖 的 衍 生。将 冻 干 多 糖 配 制 成 溶 液, 用 .?V0 调节 N0 值, 然后加入与多糖等质量的 7.8<, 反应在冰浴中进行, 其间不断搅拌并用 .?V0 维持 N0 值。9>CU 后, 立即加入己二 酸 二 肼 ( !R0 ) , 用 .?V0 调 N0 值到 @* 4 , 并维持此 N0 值至稳定, 于 2T 缓慢搅拌过夜, 将此反应混合物装入透析袋透 析。收取透析物冻干。多糖的衍生共重复三次, 分 别标记为 %!&’(!0 :=H" ;%!&’(!0 :=H, ; %!&’( !0 :=H) 。于 (,#T 保存备用。 ,* )+ %!&’(!0 与蛋白载体 ( $$) 的结合 将冻干 %!&’(!0 溶解于 .?7P 溶液中, 加入载 体蛋白 ( $$ ) , 使多糖衍生物与载体蛋白质质量相 等。置反应瓶于冰浴中, 用盐酸调节上述反应混合 物 N0 值, 然后加入 KR!7 , 用盐酸维持 N0 值并于 2T 缓慢搅拌 2G。将此反应混合物装入透析袋中, 于 , 1 @T 条件下搅拌透析 ,E。再经过柱层析纯化, 用 .?7P 溶液洗脱, 洗脱液以 ,#9U> 和 ,@#U> 同时 监测。分部收集后隔管同时检测多糖和蛋白质含 量。以各管收集液吸光值为纵坐标, 以管号为横坐 标作图 ( 见图 ) , 图 2) , 合并第 ! 峰各管收集液。其 %!&’(!0 :=H" 、 %!&’(!0 :=H, 、 %!&’(!0 :=H) 中, 与 $$ 结 合, 记 为 %!&’($$ :=H" 、 %!&’($$ :=H, 、 %!&’($$ :=H) 。 ,* 2+ 多糖含量测定 采用改 良 钼 酸 铵 法 ( 《 W0V 生 物 制 品 规 程 续 "--4 年版) 测定磷含量, 而每微克磷相当 编》 方法, 于 ")* ) "3 多糖。 ,* 4+ V(乙酰基含量测定 按 《 中国生物制品规程》 &CDG=U 等人的方法进 行
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