A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性研究

材料与方法
!" 材料 "* "+ 菌株 ! 群奈瑟氏脑膜炎球菌 ,-,#" ， 来源于中国药 品生物制品检定所。 "* ,+ 实验动物 健康清洁级 ./0 品系雌性小鼠， 体重 ", 1 "23； 体重 " 1 "* 453 的 “ 青紫蓝” 健康家兔， 由兰州生物 制品研究所实验动物室提供。 "* )+ 培养基 流脑半综合培养基及含 #* #"6 $$7 的 $$7 琼 脂培养基， 均由兰州生物制品研究所培养基室提供。 "* 2+ 参考血清 ! 群脑膜炎球菌诊断血清， 来源于中国药品生 物制品检定所。 "* 4+ 主要原材料 ! 群脑 膜 炎 球 菌 荚 膜 多 糖 原 液 （ 8(,##"#)#-( ,） ， 各项指标均达到 《 中国生物制品规程》 要求。精 制破伤风抗毒素 （ 8(,##"#9#" ） 。上述两种实验材 料均由兰州生物制品研究所菌苗一室提供。 "* 9+ 层析系统 紫外 检 测 仪 （ :;8 8<=>>? ,")@ ABCD=<E F ； ’G?<>?DC? 8C=(HIDG ABCD=<E F ） ； 记录仪 （ ’G?<>?DC? 万方数据 8C=(HIDG JK7"#, ） ； 分部收集仪 （ ’G?<>?DC? 8C=HIDG）
! ! 脑膜炎奈瑟菌 （ <*+55*9+% =*&+&’3737745 ） 是细 菌性脑膜炎和脓毒血症的主要致病菌， 全球由脑膜 炎球菌引起的脑膜炎发病率每年达 (# W $# 万， 病死 率约 &#X ， 由它导致的败血症死亡率可高达 "#X W $#X
〔 &%( 〕
其中， 0 群、 . 群和 , 群感染占所有感染者的 )#X 。 在发展中国家， 如中国和中非地区， 0 群奈瑟氏脑膜 炎球菌 （ 4/BIQ 0 <*+55*9+% =*&+&’3737745 ，405 ） 是 引发流行性脑膜炎的主要菌群。在 “ 脑膜炎地带” （ 从西到东横贯非洲 &$ 个国家） 近撒哈拉非洲地区
〔 "2 ， "4 〕 多糖衍生方法参照国外文献报道的方法 ，
。而婴幼儿又是脑膜炎球菌感染
的高危人群。因此有必要改进现有疫苗， 提高其对 各年龄组 （ 包括婴儿） 的免疫效果。实验将具免疫 原性的载体蛋白与多糖结合， 使其转化为 $ 细胞依 赖性抗原， 以增强免疫原性和诱导免疫记忆， 提高婴 幼儿和免疫缺陷患者对多糖抗原的免疫反应性。有 关 %!&’(蛋 白 结 合 疫 苗 的 研 究， 有多方面的报 道
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应较弱， 仅产生低水平的特异性抗体。尽管 ! 群奈 瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖能对成人提供保护， 甚至 对婴幼儿具免疫原性， 但其抗体持续时间较短， 不能 诱导免疫记忆
〔 "# 〕
# " 方法 ,* "+ 破伤风类毒素的纯化 破伤风类毒素原液， 纯度为 ,#""* -:L M >3 ’.。 超滤浓缩后经 FING?D<OP F()## 柱层析 （ ,* 9 Q -9D> ） 纯化， 收集分子量为 "2# 1 "4#5R 的洗脱主峰， 用截 留分子量 S "#5R 的滤膜超滤浓缩至蛋白质浓度为 9,* 2>3 M >P， 除菌过滤后置 2T 密闭保存后待用。 ,* ,+ %!&’(!0 衍生物的制备
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微生物学免疫学进展 "##$ 年第 (( 卷第 " 期! ! 6/B; EA 5EK/BTEBO 8DDIABO， 5@? "##$ ， YBO= (( ， -B= "
! 群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖 "破伤风类毒素 结合疫苗的制备及其免疫原性研究
刘方蕾， 吴 兵， 杜 琳， 杨 淼， 王志军， 杨福军， 罗广 （ 兰州生物制品研究所， 兰州! *(##+’ ）
〔 +%) 〕 由 405 引 发 的 流 行 性 脑 膜 炎 病 例 仍 在 增 长 。
， 有相当一部分儿童因脑膜炎球菌的严重感
染而发生致聋等永久后遗症。脑膜炎奈瑟菌按荚膜 多糖的抗原性和化学性质不同可分成 &( 个血清群，
在中国 )$X 的流脑病例由 405 所引起。 由于 0 群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖 （ 4056 ） 是 -%乙酰%(%V%乙酰甘露糖胺磷酸盐的线性共聚物， 属 7 细胞非依赖性 （ 78 ） 抗原， 两岁以下儿童免疫系 统尚未发育成熟， 对大多数荚膜多糖的抗体应答反
〔 源自文库9 〕
。结果表明， %!&’ 通过与蛋白载体结合， 免
疫原性得到增强， 并产生明显加强效应。 实验研究中用化学方法将 %!&’ 与载体蛋白 质结合形成结合物 （ %!&’($$ ） ， 对不同阶段的中间 产物和结合物进行化学特性和抗原性的检测， 并通 过实验动物试验初步观察结合物的免疫原性和产生 的特异性抗体的体外杀菌活性。同时通过不同批次 的 %!&’($$ 比较试验， 以验证其稳定的特异免疫原 性。
〔 ""(") 〕
在自动 N0 调节仪 （ J?EC=>IHI< ?U?POHCD? !8A-#"P ） 上进行 多 糖 的 衍 生。将 冻 干 多 糖 配 制 成 溶 液， 用 .?V0 调节 N0 值， 然后加入与多糖等质量的 7.8<， 反应在冰浴中进行， 其间不断搅拌并用 .?V0 维持 N0 值。9>CU 后， 立即加入己二 酸 二 肼 （ !R0 ） ， 用 .?V0 调 N0 值到 @* 4 ， 并维持此 N0 值至稳定， 于 2T 缓慢搅拌过夜， 将此反应混合物装入透析袋透 析。收取透析物冻干。多糖的衍生共重复三次， 分 别标记为 %!&’(!0 :=H" ；%!&’(!0 :=H, ； %!&’( !0 :=H) 。于 (,#T 保存备用。 ,* )+ %!&’(!0 与蛋白载体 （ $$） 的结合 将冻干 %!&’(!0 溶解于 .?7P 溶液中， 加入载 体蛋白 （ $$ ） ， 使多糖衍生物与载体蛋白质质量相 等。置反应瓶于冰浴中， 用盐酸调节上述反应混合 物 N0 值， 然后加入 KR!7 ， 用盐酸维持 N0 值并于 2T 缓慢搅拌 2G。将此反应混合物装入透析袋中， 于 , 1 @T 条件下搅拌透析 ,E。再经过柱层析纯化， 用 .?7P 溶液洗脱， 洗脱液以 ,#9U> 和 ,@#U> 同时 监测。分部收集后隔管同时检测多糖和蛋白质含 量。以各管收集液吸光值为纵坐标， 以管号为横坐 标作图 （ 见图 ) ， 图 2） ， 合并第 ! 峰各管收集液。其 %!&’(!0 :=H" 、 %!&’(!0 :=H, 、 %!&’(!0 :=H) 中， 与 $$ 结 合， 记 为 %!&’($$ :=H" 、 %!&’($$ :=H, 、 %!&’($$ :=H) 。 ,* 2+ 多糖含量测定 采用改 良 钼 酸 铵 法 （ 《 W0V 生 物 制 品 规 程 续 "--4 年版） 测定磷含量， 而每微克磷相当 编》 方法， 于 ")* ) "3 多糖。 ,* 4+ V(乙酰基含量测定 按 《 中国生物制品规程》 &CDG=U 等人的方法进 行
摘! 要： 采用溴化氰 （ ,-./） 活化多糖， 以无水己二酸二肼 （ 012） 作为连接剂， &%乙基%&%(% （ (%二甲基氨基%丙基） %碳 为偶联剂制备 0 群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖 （ 4056） 与破伤风类毒素 （ 77 ） 的结合物， 经皮下 化二亚胺 （ 310,） 免疫 -82 小鼠， 用 398:0 检测小鼠血清中抗 4056 及抗载体蛋白的 8;4 抗体水平。用补体介导的体外杀菌试验检 测血清中 4056 抗体的杀菌活性。结果显示， 实验中制备的多糖衍生物和多糖%蛋白质结合物都具有 4056 抗原 特异活性。结合物免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的 4056 血清 8;4 抗体， 并能形成免疫记忆， 产生 再次应答。结合物免疫小鼠所诱生的血清 4056 抗体较之多糖组具有更强的体外杀菌活性。表明此方法制备的 结合物可获得优于多糖的、 稳定的特异免疫原性。 关键词： 0 群脑膜炎球菌；结合疫苗；荚膜多糖；免疫原性 中图分类号： (*<= & > $! ! ! 文献标识码： 0! ! ! 文章编号： &##$%$’*( （ "##$ ） #"%##&+%#* #$%&’$’()*+，,-’$’,(%$).’()*+ ’+/ )001+*2%+),)(3 )+ 0),% 4*$ ,*+512’(% 6’,,)+% *4 !"#$$"%#& ’"(#()*+*++&, 7%$*" 2$*1& ! &*837’,,-’$)/%"(%(’+17 (*9*)/: 47/5，!%&1234 *(##+’ ，;2+&%） !;7($’,(：,?@AB;CA ./BDEFC（ ,-./ ）G@H IHCF JB @KJEL@JC JMC M?F/BN?OH BP QBO?H@KKM@/EFC @AF 0FEQEK 0KEFFEM?F/@REFC （ 012）G@H IHCF @H @ OEASC/，GEJM &%CJM?O%(% （ (%FEDCJM?O@DEAB%Q/BQ?O）,@/TBFEEDEFC（ 310,）@H KBIQOEA; /C@;CAJ，KBA% UI;@JC BP 4056 KBDTEACF GEJM JCJ@AIH JBNBEF（ 77）G@H Q/CQ@/CF= 7MC QM?HEKBKMCDEK@O Q/BQC/J?，@AJE;CA HQCKEPEKEJ? @AF EDDIAB;CAEKEJ? BP JMC KBAUI;@JC GC/C EALCHJE;@JCF= :BOIJEBA BP $ !; QBO?H@KKM@/EFC @OBAC B/ KBAUI;@JC KBAJ@EAEA; $ !; QBO?% H@KKM@/EFC，GC/C EAUCKJCF EAJB -82 PCD@OC DEKC HITKIJ@ACBIHO?= :C/ID @AJETBFECH @;@EAHJ 4056 @AF 77 GC/C DC@HI/CF T? CAR?DC%OEASCF EDDIABHB/TCAJ @HH@?（ 398:0） = 7MC T@KJC/EKEF@O @KJELEJ? EA HC/ID G@H DC@HI/CF T? KBDQOCDCAJ%FCQCAFCAJ T@KJC/EKEF@O CNQC/EDCAJ= 7MC /CHIOJH HMBGCF JM@J @OO BP QBO?H@KKM@/EFC，QBO?H@KKM@/EFC FC/EL@JELCH @AF KBAUI;@JC M@F JMC HQCKEPEK @AJE;CAEKEJ? BP 4056= VA JMC BJMC/ M@AF，JMC DEKC EDDIAERCF GEJM QBO?H@KKM@/EFC @OBAC K@A ABJ COEKEJ ME;M OCLCO HC/ID @AJETBFECH JB 4056，TIJ JMC DEKC EDDIAERCF GEJM KBAUI;@JC EAFIKCH @ ME;MC/ OCLCO HC/ID @AJETBF? JB 4056 @AF ;ELCH /EHC JB @ EDDIABOB;EK DCDB/? @H GCOO= 7MC KBDQOCDCAJ%FCQCAFCAJ T@KJC/EKEF@O CNQC/EDCAJ HMBGCF JM@J HC/ID 4056 @AJETBFECH EAFIKCF T? JMC KBAUI;@JC M@F HJ/BA;C/ T@KJC/EKEF@O @KJELEJ?= 7MC Q/CQ@/CF KBAUI;@JCH @OO M@LC HQCKEPEK EDDIAB;C% AEKEJ? GMEKM EH TCJJC/ JM@A JMBHC BP JMC QBO?H@KKM@/EFC @OBAC= <%3 =*$/7：4/BIQ 0 <*+55*9+% =*&+&’3737745 ；,BAUI;@JC L@KKEAC；,@QHIO@/ QBO?H@KKM@/EFC；8DDIAB;CAEKEJ? !"# $%&’()*+， ,# -+&’， .# !+&， */ %)0 （ !%&1234 "&5/+/4/* 36 -+3)3’+7%) 893:(
! ! 收稿日期： "##$%#&%#’ ；修回日期： "##$%#(%"& ! ! 作者简介： 刘方蕾 （ &)*"%） 女， 硕士， 主要从事细菌性疫苗研究 工作。 万方数据
微生物学免疫学进展 ,##4 年第 )) 卷第 , 期+ + ’<=3 CU &CD<=XC=P />>YU=P， &?O ,##4 ， Z=P* )) ， .=* ,