fish技术在临床中的应用ppt课件
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FISH实验ppt课件
学和环境微生物学研究的有力工具。FISH 技术可以再现微环 境中完整细胞的景象信息, 具有更好的精确性,因此在环境微
生物多样性等研究领域被广泛采用。近几年, 应用FISH 技术
研究自然环境微生物群落的报道较多, 如海水沉积物的群落, 海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄 居群落等。
食品检测方面：传统的食品微生物检测大多采用培养 分离的方法，食品中菌落总数测定采用平板计数法获得结 果需要1-2 d，致病位杂交应用最成功的是基因定位。基因定位研 究是构建基因图谱的基本要素, 基因位置的确定有助于了 解基因的功能, 利用FISH 技术, 可以直接确定某一DNA 序
列在染色体上的位置。
二、FISH实验及图例展示
• 1、样本的准备与处理
• 2、实验操作及注意事项
• 3、实验结果的检测 • 4、实验图例的展示
间有互补的碱基序列，在已有的放射性原位杂交技
术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位
杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针与组
织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合 成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测 核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
2、FISH的发展
• 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获 得成功。
现今越来越多的学者趋向于FISH与IF的结合实验，通 俗一点讲，就是在同一个样本上既进行FISH实验，又同时
进行IF实验检测。这方面实验一般适用于检测一个目的基
因以及该目的基因所相对应的蛋白，我们公司在这方面实 验上条件已非常成熟。另外公司也提供其他方面的实验服 务，有Southern blot 、Northern blot、CHIP、COIP， QPCR等等；蛋白类实验有IHC、IF、WB等。
生物多样性等研究领域被广泛采用。近几年, 应用FISH 技术
研究自然环境微生物群落的报道较多, 如海水沉积物的群落, 海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄 居群落等。
食品检测方面：传统的食品微生物检测大多采用培养 分离的方法，食品中菌落总数测定采用平板计数法获得结 果需要1-2 d，致病位杂交应用最成功的是基因定位。基因定位研 究是构建基因图谱的基本要素, 基因位置的确定有助于了 解基因的功能, 利用FISH 技术, 可以直接确定某一DNA 序
列在染色体上的位置。
二、FISH实验及图例展示
• 1、样本的准备与处理
• 2、实验操作及注意事项
• 3、实验结果的检测 • 4、实验图例的展示
间有互补的碱基序列，在已有的放射性原位杂交技
术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位
杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针与组
织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合 成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测 核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
2、FISH的发展
• 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获 得成功。
现今越来越多的学者趋向于FISH与IF的结合实验，通 俗一点讲，就是在同一个样本上既进行FISH实验，又同时
进行IF实验检测。这方面实验一般适用于检测一个目的基
因以及该目的基因所相对应的蛋白，我们公司在这方面实 验上条件已非常成熟。另外公司也提供其他方面的实验服 务，有Southern blot 、Northern blot、CHIP、COIP， QPCR等等；蛋白类实验有IHC、IF、WB等。
FISH技术在乳腺癌检测中的应用PPT课件
性指标。
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8
Her-2基因的检测方法
检测方法 检测指标
优点
缺点
IHC CISH FISH
Her-2蛋白
费用低 光镜即可观察结果
准确性差，主观性 强，假阳性率高
Her-2 DNA 光镜即可观察结果
对低度扩增及染色 体非整倍扩增检测
灵敏度下降
对于低倍、高倍染色体 Her-2 DNA 非整倍性扩增检测准确
质量检查
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37
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5
操作流程简图
制片
预处理
• 破坏细胞膜利于探针 杂交。
• 蛋白酶消化、HCl处理
• 变性
结果分析
FISH
• 杂交 • 洗涤
• 复染
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6
乳腺癌 Her-2基因
Her-2基因表达的蛋白产物为人表皮生长因子受体-
2(human epidermal growth factor receptor-2)，也称为neu、
FISH技术在乳腺癌检测中的应用
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1
荧光原位杂交（FISH）
Fluorescence in situ hybridization
➢ 细胞遗传学技术 ➢ 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA
靶序列杂交 ➢ 观察：荧光显微镜
原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 ➢ 目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种 基因状态的信息。
统计Ratio值（计数浸润性部分的20个细胞）
F I S H技术在血液肿瘤中的应用ppt课件
• 微小残留病灶（MRD）的检测：通过对肿瘤细胞特异的染色体异常
进行跟踪监测，预测疾病进展和有无复发迹象。
浆细胞疾病
白 血 病
MDS
淋 巴 瘤
血液肿瘤荧光原位杂交探针
疾病名称
多发性骨髓瘤（MM）
慢性淋巴细胞白血病（CLL） 慢性粒细胞白血病（CML） 急性早幼粒细胞白血病（AML-M3） 急性原始粒细胞白血病部分分化型（AML-M2） 粒－单核细胞白血病 (AML-M4) 小儿急性淋巴细胞白血病（ALL）
临床意义：
• 从遗传学角度检测染色体和基因的异常 • 辅助诊断，判断预后，疗效检测及微小残留检测
FISH技术在血液肿瘤中的应用
血液系统肿瘤是我国十大高发肿瘤之一。大量研究表明，不同类型 的血液肿瘤往往有其特异的染色体异常，对肿瘤分型、诊断、治疗和预测用预 后都具有重要意义。常规细胞遗传学分析（CC）方法只能分析中期染色体，而 对间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。FISH技术弥补了CC 在这方面的不足，因此被广泛应用于血液肿瘤的研究、诊断等方面。
骨髓增生异常综合症
性染色体错配骨髓移植
B细胞淋巴瘤 滤泡性淋巴瘤（FL） 套细胞淋巴瘤（MCL） 弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL） 伯基特淋巴瘤（BL） 粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）
探针名称
GLP P53，GLP RB1 ，GLP D13S319 GLP IGH ，GLP 1q21
GLP P53 GLP RB1 GLP D13S25 GLP ATM CSP 12
GLP BCR/GLP ABL；GLP ASS
GLP PML/GLP RARA
GLP AML1/GLP ETO
GLP CBFB GLP 4/10,GLP 17, GLP BCR/GLP ABL,GLP MLL GLP TEL/AML1 GLP CSF1R/ GLP D5S23，D5S721 GLP EGR1/ GLP D5S23，D5S721 GLP D7S486/CSP7;GLP D7S522/CSP7; GLP D20S108/CSP8 ;CSP X/CSP Y；
进行跟踪监测，预测疾病进展和有无复发迹象。
浆细胞疾病
白 血 病
MDS
淋 巴 瘤
血液肿瘤荧光原位杂交探针
疾病名称
多发性骨髓瘤（MM）
慢性淋巴细胞白血病（CLL） 慢性粒细胞白血病（CML） 急性早幼粒细胞白血病（AML-M3） 急性原始粒细胞白血病部分分化型（AML-M2） 粒－单核细胞白血病 (AML-M4) 小儿急性淋巴细胞白血病（ALL）
临床意义：
• 从遗传学角度检测染色体和基因的异常 • 辅助诊断，判断预后，疗效检测及微小残留检测
FISH技术在血液肿瘤中的应用
血液系统肿瘤是我国十大高发肿瘤之一。大量研究表明，不同类型 的血液肿瘤往往有其特异的染色体异常，对肿瘤分型、诊断、治疗和预测用预 后都具有重要意义。常规细胞遗传学分析（CC）方法只能分析中期染色体，而 对间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。FISH技术弥补了CC 在这方面的不足，因此被广泛应用于血液肿瘤的研究、诊断等方面。
骨髓增生异常综合症
性染色体错配骨髓移植
B细胞淋巴瘤 滤泡性淋巴瘤（FL） 套细胞淋巴瘤（MCL） 弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL） 伯基特淋巴瘤（BL） 粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）
探针名称
GLP P53，GLP RB1 ，GLP D13S319 GLP IGH ，GLP 1q21
GLP P53 GLP RB1 GLP D13S25 GLP ATM CSP 12
GLP BCR/GLP ABL；GLP ASS
GLP PML/GLP RARA
GLP AML1/GLP ETO
GLP CBFB GLP 4/10,GLP 17, GLP BCR/GLP ABL,GLP MLL GLP TEL/AML1 GLP CSF1R/ GLP D5S23，D5S721 GLP EGR1/ GLP D5S23，D5S721 GLP D7S486/CSP7;GLP D7S522/CSP7; GLP D20S108/CSP8 ;CSP X/CSP Y；
最新FISH技术检测子宫颈上皮细胞hTERC基因扩增的临床应用研究-课件,幻灯,PPT-PPT文档
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宫颈病变筛查技术的不足
TCT
•敏感性低
（ 55%-75%）
•重复性差
HPV
•敏感度高 •阳性预测 值低，大 多HPV阳性 患者自然 转阴
需要寻找新的有效检测指标或手段
10
人类染色体末端酶（hTERC）基因
❖ 1995年由
FISH检测宫颈脱落细 胞hTERC基因扩增对 诊断宫颈高度病变具 有较高的敏感度和特 异度，可弥补目前宫 颈癌筛查中的不足
29
国内外学者也取得了相似的结论
30
国外
Heselmeyer Haddad等首次应用FISH技术检测宫 颈脱落细胞hTERC基因扩增，发现 低度病变（LSIL）中hTERC阳性率为7%，高度 病变（HSIL）为76%，四倍体细胞数和hTERC表 达水平随病变的严重程度而增加，认为hTERC 检测可作为筛查HSIL的独立指标。 对这些病例随访发现，所有进展为CIN3或宫颈 癌的CIN1/2患者都伴有hTERC扩增，而自愈的 CIN1/2患者没有发现hTERC扩增，表明检测 hTERC基因扩增可作为预测病情进展的指标。
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结果分析
hTERC探针：GLP探针，标记红色荧光
对照探针：CSP3探针，标记绿色荧光
正常细胞判断： 单个间期细胞红色及绿色信号各2个
异常细胞判断： 红色信号大于2个，且绿色信号不少于2 个为hTERC基因扩增异常细胞
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结果判定
阈值建立：采集20例正常宫颈细胞，使用上述方法进
行FISH实验，每例至少分析100个细胞，统计出现hTERC基 因异常扩增细胞数目的百分比。 阈值= 平均数（M）+ 3×标准差（SD）本研究阈值为7.1%
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hTERC基因
荧光原位杂交技术在临床病埋中的应用 ppt课件
Blue单通道
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
二、常用探针种类
• 单色探针(single color probe, SC) • 双色探针(dual color probe, DC) • 三色探针(triple color probe, TC) • 双色分离探针(dual color, break apart probe. DC,BCR) • 双色单融合探针(dual color, single fusion. DC, SF
CCND1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、 复发等相关。在高凤险们GIST中扩增，在低风险和中等 风险GIST中无扩增，其表达与GIST有预后相关性。
MDM2基因扩增宣GIST患者有预后相关性。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
前列腺癌
• 探针：PTEN/CEN10 FGFR1/CEN8 ERG
套细胞淋巴瘤
• 探针：CCND1/IGH（双色双分离探针）
CCND1基因位于11q13，IGH基因位于14q32。 CCND1/IGH融合基因导致CCND1蛋白过度表达，可促进细胞 增生。
• CCND1/IGH融合基因检测意义
CCND1基因重排和(或)高表达是MCL的特征，FISH探 针检测CCND1/IGH的阳性率可以达到96%。
• 检测意义：
PTEN基因缺失，前列腺癌患者预后差。 FGFR1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重 要过程。 没有ERG基因改变的前列腺癌患者8年生存期达90%。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
神经母细胞瘤、神经胶质瘤
• 探针：1p36/1q25 19q13/19p13 NMYC/2q11
• MALT1及API2/MALTI融合基因检测意义
FISH技术临床应用
特点与优势分析
高特异性
FISH技术使用特异性探针与目标DNA 序列进行杂交，因此具有很高的特异 性，能够准确识别目标序列。
广泛应用
FISH技术已广泛应用于遗传学、医学 、生物学等领域的研究和诊断中。
01 05
02
高灵敏度
FISH技术能够在单细胞水平检测目标 DNA序列，具有极高的灵敏度。
03
原位显示
优化试剂和仪器
不断优化FISH技术所需的试剂和仪 器，提高实验的灵敏度和特异性，降 低成本。
加强与其他技术的融合
探索FISH技术与其他分子诊断技术 的融合应用，提高诊断效率和准确性 。
06
FISH技术发展趋势及挑战
新一代测序技术对FISH影响和挑战
高通量测序技术
新一代测序技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优势，对FISH 技术提出了更高的挑战。
表观遗传学异常检测
FISH技术可用于检测表观遗传学异常，如DNA 甲基化、组蛋白修饰等，为复杂性遗传病的发病 机制研究提供线索。
疾病相关基因表达分析
利用FISH技术，可以对疾病相关基因的表达水平 进行分析，进一步揭示疾病的发病机制和病程进 展。
03
FISH技术在肿瘤精准治疗领域应 用
肿瘤相关基因突变检测
染色体结构异常检测
FISH技术可用于检测染色体结构异常，如易位、倒位等， 帮助医生了解患者的遗传背景，为制定个性化治疗方案提 供参考。
性别染色体异常筛查
针对性别染色体异常导致的不孕不育，FISH技术可快速准 确地鉴定性别染色体，为患者提供及时的诊断和治疗建议 。
辅助生殖技术中胚胎染色体筛查
胚胎植入前遗传学筛查（PGS）
进。
结果报告规范
FISHppt课件
荧光原位杂交
FISH的原理 FISH的操作及应用 FISH的展望
FISH的原理
• FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸 为探针，按照碱基互补的原则，与待检材 料中未知的单链核酸进行特异性结合，形 成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子 在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列， 因而可以将探针直接与染色体进行杂交从 而将特定的基因在染色体上定位。
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因 组结构研究、染色体精细结构变异分析、 病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传 学和基因组进化研究等许多领域。
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次 检验均需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定 性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结 果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性 银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误差等。
(multiplex FISH, M-FISH probes)
两种以上不同的非同位素标记，不同的 荧光检测系统，通过不同的滤光片组合或 极少数几种非同位素标记探针后，按照不 同的比例混合，可以显示多种颜色。
多色复合染色体FISH探针
探针及标本的变性
1）探针变性 • 将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，
特点：信号强
应用：(a)标记染色体识别。 (b)染色体数目异常检测。 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊
断。
简单重复序列探针
染色体的着丝粒
异染色质区域
SUCCESS
THANK YOU
2019/6/13
• 间期细胞遗传学的意义： 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一， 经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细 胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相， 间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而且 快速。
FISH技术在血液疾病诊断中的应用ppt课件
nuc ish(MLL×2)[400]
nuc ish(MLL×2)(5’MLL sep 3’MLL×1)[100/200]
nuc ish(CEPX×2)[2]//(CEPX,CEPY)×1[398]
ABL BCR
ABL BCR
A
B
A: nuc ish(ABL,BCR)×2 B: nuc ish(ABL ×2,BCR ×3)
FISH技术要点
样本浓度、切片厚度、细胞状态 充分低渗与固定 制片环境温度与湿度 探针充分混匀 变性液pH与温度 橡皮泥严密封片 洗脱液温度 抗衰变剂
规范判读
• 规范正常和异常信号 • 杂交成功率>75% • 计数数量、方法： •单人，分别于不同区域各连续计数200个细胞 •双人，每人于不同区域各计数200个细胞
A
TEL
B
TEL/AML1
TEL
C
A: nuc ish(TEL×2,AML1×3)(TEL con AML1×1) B: nuc ish(TEL×1,AML1×4)(TEL con AML1×1) C: nuc ish(TEL×2,AML1×5)
D5S721 D5S721 EGR1 D5S721
EGR1
荧光原位杂交（FISH）技术
——血液肿瘤诊疗中的应用
一、技术 二、质控 三、 临床应用 四、多技术结合应用案例
技术理论
细胞遗传学发展简史
1888 提出 染色 体 1914 染 色 体 畸 变 导 致 肿 瘤
1950-1960
1960 发现Ph 染色体 CML
显带技 术高速 发展 G/R
FISH 中期/间期
ABL
BCR
ABL
FISH技术临床应用
个性化治疗
基于FISH技术的精准诊断，医生可以为患者制定个性化的 治疗方案，提高治疗效果，减少副作用。
遗传咨询
FISH技术可用于检测染色体异常和基因突变，为遗传咨询 提供科学依据，帮助家庭了解生育风险和遗传病预防。
未来发展趋势预测
技术创新
多学科融合
随着科技的不断发展，FISH技术将继续创 新和完善，提高检测精度和效率，降低成 本，使其更加普及和可及。
FISH技术操作流程及注意事项
样本制备与处理
样本类型
FISH技术可用于分析各种样本，包括组织切片、细胞涂片、染色体 悬液等。
样本固定
为确保FISH实验的成功，需要对样本进行适当固定，通常使用甲醇 /乙酸或甲醛等固定剂。
样本处理
根据实验需求，对样本进行脱水、酶消化、变性等处理，以便于探针 的渗透和杂交。
多重FISH技术研究进展
多色FISH技术
利用不同荧光颜色的探针同时检测多个目标序列，实现高通量的基因或染色体变异分析 。
多靶点FISH技术
针对同一基因或染色体的不同区域设计多个探针，提高检测的覆盖度和准确性。
多重连接依赖的探针扩增（MLPA）结合FISH技术
MLPA技术能够扩增特定序列并产生可检测的信号，与FISH技术结合可实现低丰度变异 的灵敏检测。
FISH技术与其他分子诊断方法联合应用前景
FISH技术与下一代测序（NGS）联合应用
NGS技术能够高通量、高灵敏度地检测基因组变异，与FISH技术结合可实现变异位点 的精确定位和验证。
FISH技术与数字PCR（dPCR）联合应用
dPCR技术能够实现DNA分子的绝对定量，与FISH技术结合可实现特定基因或染色体变 异的精确定量和分析。
定的DNA序列。
基于FISH技术的精准诊断，医生可以为患者制定个性化的 治疗方案，提高治疗效果，减少副作用。
遗传咨询
FISH技术可用于检测染色体异常和基因突变，为遗传咨询 提供科学依据，帮助家庭了解生育风险和遗传病预防。
未来发展趋势预测
技术创新
多学科融合
随着科技的不断发展，FISH技术将继续创 新和完善，提高检测精度和效率，降低成 本，使其更加普及和可及。
FISH技术操作流程及注意事项
样本制备与处理
样本类型
FISH技术可用于分析各种样本，包括组织切片、细胞涂片、染色体 悬液等。
样本固定
为确保FISH实验的成功，需要对样本进行适当固定，通常使用甲醇 /乙酸或甲醛等固定剂。
样本处理
根据实验需求，对样本进行脱水、酶消化、变性等处理，以便于探针 的渗透和杂交。
多重FISH技术研究进展
多色FISH技术
利用不同荧光颜色的探针同时检测多个目标序列，实现高通量的基因或染色体变异分析 。
多靶点FISH技术
针对同一基因或染色体的不同区域设计多个探针，提高检测的覆盖度和准确性。
多重连接依赖的探针扩增（MLPA）结合FISH技术
MLPA技术能够扩增特定序列并产生可检测的信号，与FISH技术结合可实现低丰度变异 的灵敏检测。
FISH技术与其他分子诊断方法联合应用前景
FISH技术与下一代测序（NGS）联合应用
NGS技术能够高通量、高灵敏度地检测基因组变异，与FISH技术结合可实现变异位点 的精确定位和验证。
FISH技术与数字PCR（dPCR）联合应用
dPCR技术能够实现DNA分子的绝对定量，与FISH技术结合可实现特定基因或染色体变 异的精确定量和分析。
定的DNA序列。
荧光原位杂交(FISH)检测
荧光原位杂交(fish)检测
目
CONTENCT
录
• 荧光原位杂交(fish)检测概述 • FISH检测的基本原理与技术流程 • FISH检测在临床诊断中的应用 • FISH检测的优势与局限性 • FISH检测的实际案例分析
01
荧光原位杂交(fish)检测概述
定义与特点
定义
荧光原位杂交（FISH）是一种基于荧光标记的DNA探针与目标DNA 结合，通过荧光显微镜观察并检测细胞内特定基因或染色体异常的 技术。
FISH技术可以应用于各种样本类型，如细胞、 组织切片、石蜡包埋组织等。
直接观察
FISH技术可以直接在细胞或组织的显微镜下观 察杂交信号，无需进行额外的染色或标记。
灵敏度高
FISH技术能够检测单个基因拷贝数的变化，灵 敏度较高。
局限性
成本高
FISH技术需要使用特殊的探针和 荧光染料，因此成本较高。
80%
基因突变
FISH技术可以检测基因突变，如 抑癌基因突变、致癌基因突变等 。
基因表达分析
基因表达水平
FISH技术可以检测基因表达水 平，了解基因在细胞中的表达 情况。
基因定位
FISH技术可以确定基因在染色 体上的位置，了解基因的染色 体定位。
基因互作
FISH技术可以检测基因间的相 互作用，了解基因间的关系。
细胞或组织的通透性处理
使用适当的试剂使细胞或组织的膜通透性增加，以便探针能 够进入。
杂交反应
探针与靶DNA的杂交
将制备好的探针与固定在样本上的靶 DNA进行杂交，形成探针-靶DNA复 合物。
去除未结合的探针
通过洗涤去除未结合的游离探针，提 高杂交信号的特异性。
信号检测与图像分析
目
CONTENCT
录
• 荧光原位杂交(fish)检测概述 • FISH检测的基本原理与技术流程 • FISH检测在临床诊断中的应用 • FISH检测的优势与局限性 • FISH检测的实际案例分析
01
荧光原位杂交(fish)检测概述
定义与特点
定义
荧光原位杂交（FISH）是一种基于荧光标记的DNA探针与目标DNA 结合，通过荧光显微镜观察并检测细胞内特定基因或染色体异常的 技术。
FISH技术可以应用于各种样本类型，如细胞、 组织切片、石蜡包埋组织等。
直接观察
FISH技术可以直接在细胞或组织的显微镜下观 察杂交信号，无需进行额外的染色或标记。
灵敏度高
FISH技术能够检测单个基因拷贝数的变化，灵 敏度较高。
局限性
成本高
FISH技术需要使用特殊的探针和 荧光染料，因此成本较高。
80%
基因突变
FISH技术可以检测基因突变，如 抑癌基因突变、致癌基因突变等 。
基因表达分析
基因表达水平
FISH技术可以检测基因表达水 平，了解基因在细胞中的表达 情况。
基因定位
FISH技术可以确定基因在染色 体上的位置，了解基因的染色 体定位。
基因互作
FISH技术可以检测基因间的相 互作用，了解基因间的关系。
细胞或组织的通透性处理
使用适当的试剂使细胞或组织的膜通透性增加，以便探针能 够进入。
杂交反应
探针与靶DNA的杂交
将制备好的探针与固定在样本上的靶 DNA进行杂交，形成探针-靶DNA复 合物。
去除未结合的探针
通过洗涤去除未结合的游离探针，提 高杂交信号的特异性。
信号检测与图像分析
荧光原位杂交(FISH)_ppt课件
肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
探针的制备
探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
探针的分类
根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
FISH的基本原理
FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。
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测遗传物质的得与失
• 在单个细胞核内针对某个特定靶分子检测到多于或少 于2个探针信号被认为异常
异常
正常
异常
<
<
染色体、基因重排检测
—已知断点的平衡易位
探针设计 - 双色单融探针（DC /SF）
9 22
正常
异常
• 使用指导
存在假阳性 如一个细胞中信号叠加。
探针设计 - 双色单融探针（DC /SF）
正常
Hunan MDT Meeting
Company Confidential
39
26 Aug 2019
© 2019 Abbott
扩增
10号染色体短臂缺失 10q Loss
• 10 号染色体短臂缺失在源发和继发性多形性胶质母细胞瘤里其中一个 重要的特征
• 10 号染色体短臂缺失在间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤指示 不良预后，生存期较短
探针设计 - 双色额外信号探针（ES）
很好地克服了双色单融出现的假阳性
探针设计 - 双色双融探针（DC/DF）
• 使用指导
• 最敏感的探针（假阳性<1 %） • 可用来检测微小残留性疾病 • 不足是对融合信号不能区分
二、如何正确使用探针
CE认证 在欧洲，用于临床诊断的医疗器械是需要的CE（CONFORMITE EUROPEENNE）认证 的。 近年来，在欧洲经济区（欧洲联盟、欧洲自由贸易协会成员国，瑞士除外）销售 的商品，CE标志的使用越来越多，CE标志加贴的商品表示其符合安全、卫生、环保 和消费者保护等一系列欧洲指令所要表达的要求。 目前，Abbott（Vysis）大约有336种FISH探针通过CE认证，并且这些探针具有广泛 的文献支持（在产品说明书中列举这些出文献），这些文献都客观证明了Vysis FISH 探针在实际临床上的应用的成功案例。 例如P53探针，Abbott（Vysis）搜集了7篇相关文献证明该探针在不同情况下的临 床应用的成功案例。再如应用于产后诊断的DiGeorge探针，在其说明书里面例举了8 篇相关文献能证明Abbott（Vysis）探针成功诊断新生儿中的DiGeorge综合征的成功 案例。
– 胶质母细胞瘤小细胞型几乎普遍缺失10号染色体短臂 – 60%–70%的小细胞型胶质母细胞瘤带有EGFR 基因扩增 – 相反的，间变性少突胶质细胞瘤几乎无10q 缺失和 EGFR 基因扩增。
大约60%的间变性少突胶质细胞瘤带有1p/19q 杂合性缺失.
Vysis EGFR / CEP 7 FISH Probe Kit
Abbott Molecular临床产品
三、临床应用
肺癌
少突胶质瘤
Vysis 1p36/1q25 and 19q13/19p13 FISH Probe Kit
正常
缺失
Hunan MDT Meeting
Company Confidential
36
26 Aug 2019
37
• 形态学上，小细胞型胶质母细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤都属中等 细胞密度，形态单一的胶质瘤；细胞膜清楚，胞质透亮； 明显活跃的 核分裂、微血管增生或显著坏死表明肿瘤
• 小细胞型胶质母细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤的鉴别事关重要因为 这两种肿瘤的临床表现和治疗意义极其不同
• 一些分子特征可用于鉴别小细胞型胶质母细胞瘤和间变性少突胶质细 胞瘤：
• PTEN 基因位于10号染色体短臂 (10q23), 其多肽具有对脂质和蛋白质的 磷酸酶活性，也是其中一个在10号染色体短臂缺失与多形胶质母细胞 瘤相关的候选基因
– 高度侵袭性, 几乎无法治愈，患者迅速死亡 – 高度未分化 – 因不可预知的化学敏感性，故具有治疗挑战性
– 多形性胶质母细胞瘤患者的预后非常差3
– 2年总生存期: 26% – 4年总生存期: 12%
1. National Comprehensive Cancer Network. Available at: . 2. Central Brain Tumor Registry of the United States. . • Stupp R, et al. N Engl J Med. 2019;352:987-996.
~ 1~~92~012951k0.79bk0kbbkb
Ratio of HER2 gene to Chromosome 17 copy number Ratio <2; HER-2 gene amplification not observed Ratio 2; HER-2 gene amplification observed
FISH技术在临床中的应用
基因科技（上海）有限公司
一、如何正确选择探针
二、如何正确使用探针
三、临床应用 —胃癌
一、如何正确选择探针
FISH探针种类
染色体结构
• 染色体计数探针（CEP) • 位点特异性标识分子（LSI） • 端粒探针
特定区域或基因
端粒(TTAGGG)n 短臂
着丝粒
长臂端粒(TTAGGG)n
PathVysion DNA Probes
LSI HER-2/neu & CEP 17
17q1117.2q1-q11.22 -q12
17q11.2 -q12
HERH-2E/nRe-u2/gneenuegene
HER-2/neu gene
entCroeCmnentertroroemmeerree
TTeelloommTeeerleroemere
© 2019 Abbott
恶性神经胶质瘤
• 恶性神经胶质瘤包括:
• WHO III 级 – 间变性星形细胞瘤，间变性少突胶质细胞瘤，间变混合性胶 质细胞瘤
• WHO IV 级 – 多形性胶质母细胞瘤
• 多形性胶质母细胞瘤是高度恶性的胶质瘤， 占近15％的原 发性脑和中枢神经系统肿瘤和 54%的所有神经胶质瘤 1,2.
Hicks DG, Tubbs RR. Assessment of the HER2 status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization: a technical review with interpretive guidelines. Hum Pathol. 2019 Mar;36(3):250-61.
• 在单个细胞核内针对某个特定靶分子检测到多于或少 于2个探针信号被认为异常
异常
正常
异常
<
<
染色体、基因重排检测
—已知断点的平衡易位
探针设计 - 双色单融探针（DC /SF）
9 22
正常
异常
• 使用指导
存在假阳性 如一个细胞中信号叠加。
探针设计 - 双色单融探针（DC /SF）
正常
Hunan MDT Meeting
Company Confidential
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26 Aug 2019
© 2019 Abbott
扩增
10号染色体短臂缺失 10q Loss
• 10 号染色体短臂缺失在源发和继发性多形性胶质母细胞瘤里其中一个 重要的特征
• 10 号染色体短臂缺失在间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤指示 不良预后，生存期较短
探针设计 - 双色额外信号探针（ES）
很好地克服了双色单融出现的假阳性
探针设计 - 双色双融探针（DC/DF）
• 使用指导
• 最敏感的探针（假阳性<1 %） • 可用来检测微小残留性疾病 • 不足是对融合信号不能区分
二、如何正确使用探针
CE认证 在欧洲，用于临床诊断的医疗器械是需要的CE（CONFORMITE EUROPEENNE）认证 的。 近年来，在欧洲经济区（欧洲联盟、欧洲自由贸易协会成员国，瑞士除外）销售 的商品，CE标志的使用越来越多，CE标志加贴的商品表示其符合安全、卫生、环保 和消费者保护等一系列欧洲指令所要表达的要求。 目前，Abbott（Vysis）大约有336种FISH探针通过CE认证，并且这些探针具有广泛 的文献支持（在产品说明书中列举这些出文献），这些文献都客观证明了Vysis FISH 探针在实际临床上的应用的成功案例。 例如P53探针，Abbott（Vysis）搜集了7篇相关文献证明该探针在不同情况下的临 床应用的成功案例。再如应用于产后诊断的DiGeorge探针，在其说明书里面例举了8 篇相关文献能证明Abbott（Vysis）探针成功诊断新生儿中的DiGeorge综合征的成功 案例。
– 胶质母细胞瘤小细胞型几乎普遍缺失10号染色体短臂 – 60%–70%的小细胞型胶质母细胞瘤带有EGFR 基因扩增 – 相反的，间变性少突胶质细胞瘤几乎无10q 缺失和 EGFR 基因扩增。
大约60%的间变性少突胶质细胞瘤带有1p/19q 杂合性缺失.
Vysis EGFR / CEP 7 FISH Probe Kit
Abbott Molecular临床产品
三、临床应用
肺癌
少突胶质瘤
Vysis 1p36/1q25 and 19q13/19p13 FISH Probe Kit
正常
缺失
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26 Aug 2019
37
• 形态学上，小细胞型胶质母细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤都属中等 细胞密度，形态单一的胶质瘤；细胞膜清楚，胞质透亮； 明显活跃的 核分裂、微血管增生或显著坏死表明肿瘤
• 小细胞型胶质母细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤的鉴别事关重要因为 这两种肿瘤的临床表现和治疗意义极其不同
• 一些分子特征可用于鉴别小细胞型胶质母细胞瘤和间变性少突胶质细 胞瘤：
• PTEN 基因位于10号染色体短臂 (10q23), 其多肽具有对脂质和蛋白质的 磷酸酶活性，也是其中一个在10号染色体短臂缺失与多形胶质母细胞 瘤相关的候选基因
– 高度侵袭性, 几乎无法治愈，患者迅速死亡 – 高度未分化 – 因不可预知的化学敏感性，故具有治疗挑战性
– 多形性胶质母细胞瘤患者的预后非常差3
– 2年总生存期: 26% – 4年总生存期: 12%
1. National Comprehensive Cancer Network. Available at: . 2. Central Brain Tumor Registry of the United States. . • Stupp R, et al. N Engl J Med. 2019;352:987-996.
~ 1~~92~012951k0.79bk0kbbkb
Ratio of HER2 gene to Chromosome 17 copy number Ratio <2; HER-2 gene amplification not observed Ratio 2; HER-2 gene amplification observed
FISH技术在临床中的应用
基因科技（上海）有限公司
一、如何正确选择探针
二、如何正确使用探针
三、临床应用 —胃癌
一、如何正确选择探针
FISH探针种类
染色体结构
• 染色体计数探针（CEP) • 位点特异性标识分子（LSI） • 端粒探针
特定区域或基因
端粒(TTAGGG)n 短臂
着丝粒
长臂端粒(TTAGGG)n
PathVysion DNA Probes
LSI HER-2/neu & CEP 17
17q1117.2q1-q11.22 -q12
17q11.2 -q12
HERH-2E/nRe-u2/gneenuegene
HER-2/neu gene
entCroeCmnentertroroemmeerree
TTeelloommTeeerleroemere
© 2019 Abbott
恶性神经胶质瘤
• 恶性神经胶质瘤包括:
• WHO III 级 – 间变性星形细胞瘤，间变性少突胶质细胞瘤，间变混合性胶 质细胞瘤
• WHO IV 级 – 多形性胶质母细胞瘤
• 多形性胶质母细胞瘤是高度恶性的胶质瘤， 占近15％的原 发性脑和中枢神经系统肿瘤和 54%的所有神经胶质瘤 1,2.
Hicks DG, Tubbs RR. Assessment of the HER2 status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization: a technical review with interpretive guidelines. Hum Pathol. 2019 Mar;36(3):250-61.