第二章微生物的纯培养和显微技术
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第二章 微生物的纯培养
微生物学
第二章 微生物的纯培养和显微技术
基本概念
1、微生物的纯种分离：
将多种混杂的微生物，经某种技术或方法分离 或纯化的过程。
2、微生物的培养物（culture)：
在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物 群体。 纯培养物（pure culture)：在人为规定的条件下 培养、繁殖得到的只有一种微生物的培养物。
2、冷冻保藏—— 低于－70℃
液氮超低温保藏法
将菌种置于保护剂（ 甘油、二甲亚枫、血 清蛋白、脱脂牛奶等）中，预冻后保存在液 氮中（ -196℃）或低温冰箱（ -70℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
优点：保藏效果好。 缺点：价格昂贵低，温度对细胞有损伤。
3、干燥保藏法
冷冻真空保藏法
电热干燥箱
3、接种操作
要点
接种环境消毒灭菌 酒精棉球消毒双手 开启的管口、瓶口靠近灯焰 拔出的棉塞勿触及任何地方 动作快，接种时间勿太长 必 备
双管移植法
无菌操作箱
二、用固体培养基获得纯培养
适用于大多数细菌、酵母菌以及许多真菌和 单细胞藻类。
1、涂布平板法（Spread Plate method）
防止菌种衰退的方法：
①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配
率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法， 可以减少移种和传代的数）；
第二章 微生物的纯培养和显微技术
基本概念
1、微生物的纯种分离：
将多种混杂的微生物，经某种技术或方法分离 或纯化的过程。
2、微生物的培养物（culture)：
在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物 群体。 纯培养物（pure culture)：在人为规定的条件下 培养、繁殖得到的只有一种微生物的培养物。
2、冷冻保藏—— 低于－70℃
液氮超低温保藏法
将菌种置于保护剂（ 甘油、二甲亚枫、血 清蛋白、脱脂牛奶等）中，预冻后保存在液 氮中（ -196℃）或低温冰箱（ -70℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
优点：保藏效果好。 缺点：价格昂贵低，温度对细胞有损伤。
3、干燥保藏法
冷冻真空保藏法
电热干燥箱
3、接种操作
要点
接种环境消毒灭菌 酒精棉球消毒双手 开启的管口、瓶口靠近灯焰 拔出的棉塞勿触及任何地方 动作快，接种时间勿太长 必 备
双管移植法
无菌操作箱
二、用固体培养基获得纯培养
适用于大多数细菌、酵母菌以及许多真菌和 单细胞藻类。
1、涂布平板法（Spread Plate method）
防止菌种衰退的方法：
①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配
率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法， 可以减少移种和传代的数）；
第二章 微生物的纯培养和显微技术
六、微生物的保藏技术
菌种保藏： 菌种保藏：是指将微生物菌种用各种适 宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染， 宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持 其原有性状基本稳定。 其原有性状基本稳定。 保藏微生物菌种的目的 目的： 保藏微生物菌种的目的：不仅要保存菌 株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌 株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌 株的遗传性状保持不变， 株的遗传性状保持不变，同时保证其在整个 保存过程中不被他种微生物污染 因此， 不被他种微生物污染。 保存过程中不被他种微生物污染。因此，选 择一种能够长期有效且稳定的保藏微生物菌 种的方法事关重要。 种的方法事关重要。
单细胞（单孢子） 四、单细胞（单孢子）分离法
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细 胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。 胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方 法需要高度娴熟的专门技术， 法需要高度娴熟的专门技术，使用于高水平专业化 科学研究，要在显微镜下进行。 科学研究，要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大 毛细管法：用毛细管提取微生物个体， 微生物。 微生物。 显微操作仪：用显微针、 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或 孢子以获得纯培养。 孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴， 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴， 在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养 物的分离。 物的分离。
第二章 微生物的纯培养与显微技术
2）有隔膜菌丝 (septate hypha)
菌丝由横隔 膜分隔成成串 多细胞，每个 细胞内含有一 个或多个细胞 核。
3）相关概念
营养菌丝 ：在固体培养基上，部分菌丝伸 入培养基内吸收养料 的菌丝。
气生菌丝 ：向空中生长 的菌丝。 繁殖菌丝 ：由气生菌丝发育到一定阶段，
分化而成 的。
4）繁殖方式
Photomicrographs of cells of Hyphomicrobium. By phase contrast,showing typical fields.Notice the long hyphae and the occasional budding cell
球衣菌（Sphaerotilus），能形成衣鞘（sheath）， 杆状的细胞呈链状排列在衣鞘内而成为丝状.
第二章 微生物的纯培养
2学时
本章重点：
1、微生物的分离 2、纯培养技术 3、常用的菌种保藏方法 4、细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态
特征
Βιβλιοθήκη Baidu一节 微生物的分离和纯培养
一、相关概念 培养物（culture） ：在微生物学中，指在人为
规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体 。
纯培养物（pure culture） ：只有一种微生物
第二节 显微镜下的微生物
一、细菌、放线菌和古生菌
第二章 微生物的纯培养
在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%
《微生物学》 第二章 纯培养和显微技术
四、单细胞（单孢子）分离
一般采用显微操作仪，在显微镜下进行； 操作难度与细胞或个体的大小成反比；
《微生物学》 第二章
纯培养和显微技术
五、选择培养分离
微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化 抑制大多数其它微生物的生长； 使待分离的微生物生长更快；
微生物的基本特点： 小
微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研 究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内 部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究
《微生物学》 第二章
纯培养和显微技术
第一节
微生物的分离和纯培养
从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微
生物的第一步。
厌氧手套箱
厌 氧 微 生 物 的 分 离
厌氧罐
《微生物学》 第二章
纯培养和显微技术
分离微生物四种不同方法比较:
1.稀释倒平板法：样品必须作倍比稀释，且倒平板的培养基温度必 须严格控制。操作较麻烦,对好氧菌、热敏感菌效果不好. 2.涂布平板法：样品必须作倍比稀释,使用较多的常规方法，但有 时涂布不均匀.
高温下培养:分离嗜热细菌
培养基中不含N:分离固氮菌 培养基加抗生素:分离抗性菌 分离纤维素分解酶产生菌： 可以纤维素作唯一碳源。
第二章纯培养和显微技术-2010
环状光阑、相差板
微生物细胞不同部位光折射率、厚度、密度不同，光透射后出 现光程变化，产生相位差。 相位差经环状光阑，相差板处理，转变成细胞像的明暗差。细胞 像明暗差增大了与亮视野的反差（色差）。
二、电子显微镜的种类及原理
1、透射电镜（transmission electron microscope, TEM）
单细胞 土壤
选择培养基直接分离 37度培养
目的菌 非目的菌
选择培养基平板
（含牛奶或酪蛋白唯一C、N源）
目的菌落
(菌落周围有透明蛋白水解圈)
例1：分离筛选蛋白酶产生细菌
培养基中的选择因子：牛奶或酪蛋白 只允许分解利用蛋白质营养物的目的菌生长，淘汰非目的菌 长出的目的菌并不一定是同种细菌，但皆产蛋白酶。
过滤除菌：常用细菌滤器
滤膜：孔径小于细菌细胞的大小
滤膜
注射式微孔滤器
小型过滤装置
2、无菌操作
A、火焰旁无菌操作----接种
B、超净工作台（生物安全柜）无菌操作
层流生物安全柜
移液操作
C、无菌室
UV杀菌、超净工作台火焰区操作。
“树立无菌意识，规范无菌操作、保证纯种培养”
（二）固体培养基分离纯种菌落（colony) ---琼脂营养平板
“纯洁”性而防止其它微生物污染的技术。
1、 所用物品的灭菌技术
A、玻璃或金属器皿灭菌 干热灭菌：干燥箱（160－170 °C 干热空气2小时灭菌） B、培养基或溶液灭菌 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌器（ 121 °C 热蒸汽30分钟灭菌）
第二章微生物的纯培养和显微技术
第四节 真核微生物 （Eucaryote microorganism）
指一大类细胞核有核膜包裹的、具有真正细胞核 的生物。
一 真核微生物的分类、分布 二 真核微生物的个体形态 三 真核微生物的细胞大小
一 真核微生物的分类、分布
1 分类 12万余种
霉菌
酵母菌 真菌（习惯分类）
大型真菌
真 核
粘菌
微 生
单细胞藻类（除蓝藻外）
物
原生动物
真菌分类学分类
❖ G.C.Ainsworth(1971)分类系统为当前最重要 的分类系统（主要依据形成有性孢子的情况）
真核界
真菌门
粘菌门
鞭接 毛合 菌菌 亚亚 门门
子 担半 囊 子知 菌 菌菌 亚 亚亚 门 门门
霉菌、酵母菌 等分属于这些 亚门
2 分布
土壤、水、空气、几万米的高空 生长的良好环境——黑暗、潮湿、有机物存在
葡萄球菌
（2） 杆状菌
在细菌中种类最多，形态 差别最明显
短粗 近似球形 长圆柱形 一端膨大
平截：炭疽芽孢杆菌 稍圆：大肠杆菌
多数单个存在， 也有成链状。
短杆菌
长杆菌 梭状芽孢杆菌
杆菌细胞两端的形态特征
一般情况下,同一种杆菌的宽度比较稳定,但它 的长度经常随培养时间、培养条件的不同而
有较大的变化。
单细胞
沈萍微生物学第二章
思考题： 1、几个概念： 纯培养、无菌技术、菌落、菌苔、选择 培养基、富集培养 2、试述微生物保藏的目的、原理和方 法。 3、列表叙述四大类微生物的个体形态、 繁殖方式、菌落特征。
小结
细菌
个体形态 单细胞， 球、杆、 螺旋状等
放线菌
无隔菌丝 体
酵母菌
单细胞， 圆球、柱 状等
霉菌
无隔菌丝 体、有隔 菌丝体
主要繁殖 方式
菌落特征
二分裂
Байду номын сангаас
菌丝片段、 芽殖、裂 孢子 殖
干燥，小 而致密， 粉、绒状 湿润，大 而突起
菌丝片段、 孢子
大而疏松 絮状，蜘 蛛网状
湿润，小 而突起， 大而平坦
第二章 微生物的纯培 养和显微技术
本章重点：
微生物纯培养的分离方法。 微生物的保藏方法 显微镜下的微生物的形态
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术 1、概念：在分离、转接及培养纯培养物 时防止其被其他微生物污染，其自身也 不污染环境的技术。 2、方法：培养基、器具等需灭菌 接种操作---无菌操作
纯培养物、菌落、菌苔、平板
二. 用固体培养基分离纯培养 1、涂布平板法 2、稀释倒平板法
3、平板划线法 4、稀释摇管法（厌氧菌）
三. 用液体培养基分离纯培养
微生物学重点总结(3篇)
微生物学重点总结
微生物学
第一章绪论
1、微生物学。一般定义为研究肉眼难以看见的称之为微生物的生命活动的科学。
2、微生物的发现。
第一个看见并描述微生物的人是荷兰商人安东列文虎克。
3、微生物学发展的奠基者及其贡献
法国的巴斯德。1>彻底否定了“自生说”；2>免疫学—预防接种；3>证实发酵是由微生物引起；4>创立巴斯德消毒法。
德国的科赫。1>证实了____病菌是____病的病原菌；2>发现肺炎结核病的病原菌；3>提出证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则—科赫原则。
4、微生物的特点：个体小、结构简、胃口大、食谱广、繁殖快、易培养、数量大、分布广、
种类多、变异易、抗性强。
第二章微生物的纯培养和显微技术
1、无菌技术。在分离、转接、及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术。
2、菌落。分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
3、选择培养。选择平板培养、富集培养。
4、古生菌。是一个在进化途径上很早就与真细胞和真核生物相互独立的生物类群。主要包括一些独特的生态类型的原核生物。
5、真菌。霉菌（菌体由分枝或不分枝的菌丝构成）、酵母菌（一群单细胞真核微生物）。
6、用固体培养基获得微生物纯培养方法：1>涂布平板法：（菌落通常只在平板表面生长）
将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在已倒好的平板表面，再用无菌涂布棒涂布均匀，经培养后挑取单个菌落。特点：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀。2>稀释倒平板法：（细菌菌落出现在平板表面及内部）
微生物的纯培养与显微技术
第二章 微生物的纯培养与显微技术
生长速度快与其大小相关
比表面积大，有利于营养吸收、 物质交换
大肠杆菌代时是20分钟，48小时可产生 2.2*1043个细胞，重量相当于地球的4000倍。
第二章 微生物的纯培养与显微技术
微生物的大小
（一）
•我家里的几位女眷想要看醋里 的线虫，可是看了以后，厌恶 地发誓说再也不用醋了。要是 我告诉她们在口腔里牙垢上生 活的动物比全国的人口还多， 她们将会怎样反应呢？
其数值越大，显微镜分辨率越好。
第二章 微生物的纯培养与显微技术
光学显微镜原理
光线在穿过折射率不同的 （一） 介质时发生折射
第二章 微生物的纯培养与显微技术
观察细菌应使用油镜
浸没油与玻璃的折射率相近 很多原来由于在透镜及载片表面的反射和 折射而损失的光线可以进入物镜，使照明
（一） 亮度提高，改善观察效果。
（4）“Microbiology”， Lansing M. Prescott, Donald Klein, John Harley，McGraw-Hill Higher Education，2005
讲授内容
《微生物学》 沈萍主编 2006年 高教出版社
第二章：微生物的纯培养和显微技术 第三章：微生物细胞的结构与功能 第四章：微生物的营养 第七章：病毒(噬菌体) 第十三章：微生物物种的多样性(节选)
第二章--微生物的纯培养和显微技术
99
相差显微镜配备了特 殊的光学装置，主要 是环状光圈和相板。 （位置以及作用）
➢ 环状光圈 ➢ 相板（相差物镜头，
Ph) ➢ 调焦望远镜
100
利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人 眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差（实 际上，相位推迟1/20波长时，合成波的变化 就已经较明显，可以被识别）。由于反差的 基础是细胞不同部位的密度差异，因此相差 显微镜很适合观察活的细胞以及细胞内的一 些细微结构。此技术突破使其发明人F. Zernike 获得了1953年的诺贝尔物理学奖。
三、用液体培养基分离纯培养(常用稀释法 )
四、单细胞（孢子）分离
采用显微分离法从混杂群体中直接分 离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯 培养，称为单细胞分离法。
这种方法对操作技术要求较高，多限 于高度专业化的科学研究中使用。
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单 个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜 下进行。
——解决的措施？
➢改造显微镜（不同种类的显微镜） ➢改造观察的样品（染色技术）；
93
2. 暗视野显微镜
暗视野显微镜利用特殊的聚光器对样品实 行斜射照明，其目的是使射向样品上的直射光 无法进入物镜，能够进入物镜的是样品上的反 射光和折射光，因此，整个视野是暗的，而样 品是明亮的，同样可以增加反差。即使所观察 微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，仍然可以发 现其存在。
相差显微镜配备了特 殊的光学装置，主要 是环状光圈和相板。 （位置以及作用）
➢ 环状光圈 ➢ 相板（相差物镜头，
Ph) ➢ 调焦望远镜
100
利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人 眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差（实 际上，相位推迟1/20波长时，合成波的变化 就已经较明显，可以被识别）。由于反差的 基础是细胞不同部位的密度差异，因此相差 显微镜很适合观察活的细胞以及细胞内的一 些细微结构。此技术突破使其发明人F. Zernike 获得了1953年的诺贝尔物理学奖。
三、用液体培养基分离纯培养(常用稀释法 )
四、单细胞（孢子）分离
采用显微分离法从混杂群体中直接分 离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯 培养，称为单细胞分离法。
这种方法对操作技术要求较高，多限 于高度专业化的科学研究中使用。
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单 个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜 下进行。
——解决的措施？
➢改造显微镜（不同种类的显微镜） ➢改造观察的样品（染色技术）；
93
2. 暗视野显微镜
暗视野显微镜利用特殊的聚光器对样品实 行斜射照明，其目的是使射向样品上的直射光 无法进入物镜，能够进入物镜的是样品上的反 射光和折射光，因此，整个视野是暗的，而样 品是明亮的，同样可以增加反差。即使所观察 微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，仍然可以发 现其存在。
第二章_微生物的纯培养和显微技术
① 70％的酒精：操作前手或器皿的表面杀菌，载玻 片，盖玻片的浸泡等。
② 1:1000 新洁尔灭溶液，浸泡时间为30分钟，常用
于表面的消毒。
③ 福尔马林（40％甲醛液）：用于空间熏蒸灭菌，
加热或加高锰酸钾使其放出甲醛气体。注意将空
间密闭并维持24小时。
一、无菌技术
6. 紫外线灭菌
用于接种室等空气灭菌。
二、用固体培养基分离纯培养
培养平板（culture plate）
克隆（clone)：一个单细胞繁殖形成的菌落，即一
个纯种细胞群或克隆。
固体培养基：琼脂或其它凝胶物质固化的培养基。
平板：即培养平板（culture plate), 融化的固体
培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板，
用于分离、培养微生物。
第一节 微生物的分离和纯培养
四、单细胞分离
单细胞（单孢子）显微分离
稀释法缺点
分离的优势菌
显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养获得纯培养
显微操作仪，专业程度高
第一节 微生物的分离和纯培养
五、选择培养分离
1. 利用选择培养基直接分离
对某微生物生长需要了解后，根据微生物的特 性设计培养基，即使该微生物在混杂群体中很 少也可分离。
倒平板：然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷
却至50℃左右的琼脂培养基混匀后，倾入灭过菌的培
② 1:1000 新洁尔灭溶液，浸泡时间为30分钟，常用
于表面的消毒。
③ 福尔马林（40％甲醛液）：用于空间熏蒸灭菌，
加热或加高锰酸钾使其放出甲醛气体。注意将空
间密闭并维持24小时。
一、无菌技术
6. 紫外线灭菌
用于接种室等空气灭菌。
二、用固体培养基分离纯培养
培养平板（culture plate）
克隆（clone)：一个单细胞繁殖形成的菌落，即一
个纯种细胞群或克隆。
固体培养基：琼脂或其它凝胶物质固化的培养基。
平板：即培养平板（culture plate), 融化的固体
培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板，
用于分离、培养微生物。
第一节 微生物的分离和纯培养
四、单细胞分离
单细胞（单孢子）显微分离
稀释法缺点
分离的优势菌
显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养获得纯培养
显微操作仪，专业程度高
第一节 微生物的分离和纯培养
五、选择培养分离
1. 利用选择培养基直接分离
对某微生物生长需要了解后，根据微生物的特 性设计培养基，即使该微生物在混杂群体中很 少也可分离。
倒平板：然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷
却至50℃左右的琼脂培养基混匀后，倾入灭过菌的培
第二章 微生物的纯培养和显微技术
人为规定的条件下培养繁殖得到的 微生物群体为培养物
混合培养物
培养物
纯培养物
纯培养能较好地得到重复结果 ， 是微生物研究的重要技术之一
个体小
显微技术是微生物研究的另一项重要技术
一、微生物的分离和纯培养
无菌技术（aseptic technique)
分离、转接源自文库纯化时防止其他微生物污染的技术
一、微生物的分离和纯培养
二、显微镜和显微技术
光学显微样品制备－－染色观察
活体观察难看到微生物的细致形态和结构，需染色观察。
染色前需要对样品固定，目的：杀死细菌使菌体黏附
在 玻片上；还可增加对染料的亲和力。
常用：酒精火焰加热和化学固定两种方法
二、显微镜和显微技术
枯草杆菌革兰氏染色
大肠杆菌革兰氏染色
二、显微镜和显微技术
暗 视 野 显 微 镜 结 构 与 照 明 示 意 图
二、显微镜和显微技术
暗视野显微镜
特殊聚光器实现斜射照明，给样品照明的光线不直接 穿过物镜，而经样品反射或折射后进入物镜，使样品 与背景差别大，可以清楚看到透明微小颗粒。用于： 生活细菌运动性观察。
二、显微镜和显微技术
相差显微镜
二、显微镜和显微技术
一、微生物的分离和纯培养
常用固体分离纯培养方法：
第2章纯培养和显微技术
用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；
在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身 也不污染环境； （P14第1段）
一、无菌技术
参见P14
一、无菌技术
参见P14
1、微生物培养的常用器具及其灭菌
参见P14
常用的器具： 试管、瓶子、培养皿等
装有培养基后称为“培养平板” Or “平板”(plate)
微生物细胞或孢子以获得纯培养。
微生物在自然条件下存在的特点：
同一生态环境中混杂存在着不同种类的细菌；
不同细菌在数量存在差异；
利用刚才介绍的技术，我们是否有可能获得
某一个生态环境（例如1克土壤）中所有种类细菌
的纯培养？
假设待分离的细菌均能利用某一相同的培养基生长
五、选择培养分离
参见P18
微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：
五、选择培养分离
1. 利用选择培养法进行直接分离
参见P18
高温下培养：分离嗜热细菌； 培养基中不含N：分离固氮菌； 培养基加抗生素：分离抗性菌；
待分离的微生物生长， 其它微生物的生长被抑制
五、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
参见P18
牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；
待分离的微生物 的生长特征明显不同 于其它微生物
表面的三维视图
观察细胞外表面或内表面
在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身 也不污染环境； （P14第1段）
一、无菌技术
参见P14
一、无菌技术
参见P14
1、微生物培养的常用器具及其灭菌
参见P14
常用的器具： 试管、瓶子、培养皿等
装有培养基后称为“培养平板” Or “平板”(plate)
微生物细胞或孢子以获得纯培养。
微生物在自然条件下存在的特点：
同一生态环境中混杂存在着不同种类的细菌；
不同细菌在数量存在差异；
利用刚才介绍的技术，我们是否有可能获得
某一个生态环境（例如1克土壤）中所有种类细菌
的纯培养？
假设待分离的细菌均能利用某一相同的培养基生长
五、选择培养分离
参见P18
微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：
五、选择培养分离
1. 利用选择培养法进行直接分离
参见P18
高温下培养：分离嗜热细菌； 培养基中不含N：分离固氮菌； 培养基加抗生素：分离抗性菌；
待分离的微生物生长， 其它微生物的生长被抑制
五、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
参见P18
牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；
待分离的微生物 的生长特征明显不同 于其它微生物
表面的三维视图
观察细胞外表面或内表面
相关主题
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•
五、选择培养分离
当某一种微生物所存在的数量与其他微 生物相比非常少时，单采用一般的平板 稀释方法几乎是不可能分离到该种微生 物的，故需采用选择培养分离法。
•
1、利用选择培养基进行直接分离
如要分离高温菌，可在高温条件进行 培养；要分离某种抗生素抗性菌株， 可在加有抗生素的平板上进行分离。
•
2、富集培养
高压蒸气灭菌 高温干热灭菌 棉塞 超净工作台等
•
•接种操 作
•
二、用固体培养基分离纯培养
菌落：单个微生物在 适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖 到一定程度可以形成 肉眼可见的、有一定 形态结构的子细胞生 长群体。
菌苔：当固体培养基 表面众多菌落连成一 片时，便成为菌苔。
•
•
菌落
•
Baidu Nhomakorabea
分辨率
重要性能参数。 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，
还与显微镜的分辨率（resolution）有关。 分辨率是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm
处）能分辨物体最小间隔的能力。 分辨率的大小决定于光的波长和镜口角以及
•
冷冻真空干燥保藏
是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在 真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在 真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物 处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以 达到长期保藏的目的。
用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的 程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用 最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。
稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的 试管中大多数（95%以上）表现不生长，很 可能得到的是纯培养。
•
四、单细胞（单孢子）分离
单细胞分离：采取显微分离法从混杂群体中直接 分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。
单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比 。个体较大的可在低倍显微镜下进行，个体较小 的则需采用显微操作仪。
无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌 的培养皿。注意要稀释得当。
分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到 纯培养。
•
•稀释倒平板法
Pour plate
•
涂布平板法
无菌水、梯度稀释 涂布平板
•Spread plate
•
稀释倒平板法和涂布平板法
•
平板划线分离法
•
稀释摇管法
•
菌种保藏方法
连续移接 改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）
使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到 半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得 到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。 在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物 恢复活力。
•
1、传代培养保藏
是微生物保存的基本方法。 琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等
菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。
•细菌菌落特征剖面图
•
菌落
•细菌菌落特征正面图
•
培养平板
培养平板（平板）：指熔化的固 体培养基倒入无菌平皿，冷却凝 固后，盛有固体培养基的平皿。
•
平板分离微生物纯培养技术
稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法
•
1、稀释倒平板法：
保藏期间微生物不死亡、不污染、不会因发生 而丢失重要的生物学性状。
许多国家都设有相应的菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会 美国典型菌种保藏中心 世界菌种保藏联合会等
•
菌种保藏
菌种保藏：就是根据菌种特性及保藏目的 的不同，给微生物菌株以特定的条件，使 其存活而得以延续。
对于生产中使用的菌种保藏培养基， 要求比较丰富的氮源，以防止菌种退 化变质。
第二章微生物的纯培养 和显微技术
2020年7月9日星期四
第一节 微生物的分离和纯培养
无菌技术 用固体培养基分离纯培养 用液体培养基分离纯培养 单细胞（单孢子）分离 选择培养分离
•
一、无菌技术
无菌技术：在分离、转接及培 养纯培养(物)时防止其被其他 微生物污染的技术。
•
保持无菌的方法
•
第二节 显微镜和显微技术
显微镜的种类及原理 显微观察样品的制备
•
一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜
•
普通复式光学显微镜
普通生物显微镜由三部分构成： ➢ 照明系统：包括光源和聚光器。 ➢ 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显 微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜 和物镜都由复杂的透镜组构成。 ➢ 机械装置：保证光学系统的准确配制，用 于固定材料和观察方便。
•
3、干燥保藏法
沙土管保存和冷冻真空干燥保 藏是最常用的二项微生物干燥 保藏技术。
•
沙土管保存
一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的 孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无 菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干 ，最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱 保存。此法主要适用于产孢子的微生物，如 芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件 ，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大 增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对 羟基苯甲酸的微生物的实验为例。
•
六、微生物的保藏技术
。 橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温
保存。 4℃保存。
•
2、冷冻保藏
代谢作用停止。 细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比
有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶， 从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。 速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5% 左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱 水作用而保护细胞； 大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各 种保护剂以提高培养物的存活率。
用于分离严格厌氧菌。先将一系列盛有无菌琼脂培养基 的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待 分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均 匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固 体石蜡的混合物，将培养基与空气隔开。
•
三、用液体培养基分离纯培养
用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的 纯化分离。
五、选择培养分离
当某一种微生物所存在的数量与其他微 生物相比非常少时，单采用一般的平板 稀释方法几乎是不可能分离到该种微生 物的，故需采用选择培养分离法。
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1、利用选择培养基进行直接分离
如要分离高温菌，可在高温条件进行 培养；要分离某种抗生素抗性菌株， 可在加有抗生素的平板上进行分离。
•
2、富集培养
高压蒸气灭菌 高温干热灭菌 棉塞 超净工作台等
•
•接种操 作
•
二、用固体培养基分离纯培养
菌落：单个微生物在 适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖 到一定程度可以形成 肉眼可见的、有一定 形态结构的子细胞生 长群体。
菌苔：当固体培养基 表面众多菌落连成一 片时，便成为菌苔。
•
•
菌落
•
Baidu Nhomakorabea
分辨率
重要性能参数。 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，
还与显微镜的分辨率（resolution）有关。 分辨率是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm
处）能分辨物体最小间隔的能力。 分辨率的大小决定于光的波长和镜口角以及
•
冷冻真空干燥保藏
是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在 真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在 真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物 处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以 达到长期保藏的目的。
用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的 程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用 最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。
稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的 试管中大多数（95%以上）表现不生长，很 可能得到的是纯培养。
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四、单细胞（单孢子）分离
单细胞分离：采取显微分离法从混杂群体中直接 分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。
单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比 。个体较大的可在低倍显微镜下进行，个体较小 的则需采用显微操作仪。
无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌 的培养皿。注意要稀释得当。
分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到 纯培养。
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•稀释倒平板法
Pour plate
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涂布平板法
无菌水、梯度稀释 涂布平板
•Spread plate
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稀释倒平板法和涂布平板法
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平板划线分离法
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稀释摇管法
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菌种保藏方法
连续移接 改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）
使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到 半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得 到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。 在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物 恢复活力。
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1、传代培养保藏
是微生物保存的基本方法。 琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等
菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。
•细菌菌落特征剖面图
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菌落
•细菌菌落特征正面图
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培养平板
培养平板（平板）：指熔化的固 体培养基倒入无菌平皿，冷却凝 固后，盛有固体培养基的平皿。
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平板分离微生物纯培养技术
稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法
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1、稀释倒平板法：
保藏期间微生物不死亡、不污染、不会因发生 而丢失重要的生物学性状。
许多国家都设有相应的菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会 美国典型菌种保藏中心 世界菌种保藏联合会等
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菌种保藏
菌种保藏：就是根据菌种特性及保藏目的 的不同，给微生物菌株以特定的条件，使 其存活而得以延续。
对于生产中使用的菌种保藏培养基， 要求比较丰富的氮源，以防止菌种退 化变质。
第二章微生物的纯培养 和显微技术
2020年7月9日星期四
第一节 微生物的分离和纯培养
无菌技术 用固体培养基分离纯培养 用液体培养基分离纯培养 单细胞（单孢子）分离 选择培养分离
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一、无菌技术
无菌技术：在分离、转接及培 养纯培养(物)时防止其被其他 微生物污染的技术。
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保持无菌的方法
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第二节 显微镜和显微技术
显微镜的种类及原理 显微观察样品的制备
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一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜
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普通复式光学显微镜
普通生物显微镜由三部分构成： ➢ 照明系统：包括光源和聚光器。 ➢ 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显 微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜 和物镜都由复杂的透镜组构成。 ➢ 机械装置：保证光学系统的准确配制，用 于固定材料和观察方便。
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3、干燥保藏法
沙土管保存和冷冻真空干燥保 藏是最常用的二项微生物干燥 保藏技术。
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沙土管保存
一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的 孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无 菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干 ，最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱 保存。此法主要适用于产孢子的微生物，如 芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件 ，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大 增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对 羟基苯甲酸的微生物的实验为例。
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六、微生物的保藏技术
。 橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温
保存。 4℃保存。
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2、冷冻保藏
代谢作用停止。 细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比
有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶， 从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。 速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5% 左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱 水作用而保护细胞； 大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各 种保护剂以提高培养物的存活率。
用于分离严格厌氧菌。先将一系列盛有无菌琼脂培养基 的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待 分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均 匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固 体石蜡的混合物，将培养基与空气隔开。
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三、用液体培养基分离纯培养
用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的 纯化分离。