-内酰胺酶的分类及检测

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产超广谱β内酰胺酶细菌感染防治专家共识

产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家共识产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家委员会超广谱β-内酰胺酶（β）是肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药的主要机制之一，其预防与治疗已成为临床医生需要面对的重要问题［1］，但国内外缺少相关问题处理的指导性意见。

《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》编辑部和《医学参考报·感染病学频道》编辑部组织国内部分专家制定本《共识》，以对相关问题的处理提供指导。

一、超广谱β-内酰胺酶及相关概念1．β-内酰胺酶及分类：β-内酰胺酶是指细菌产生的能水解β-内酰胺类抗菌药物的灭活酶，是细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制。

其分类见表1。

2．超广谱β-内酰胺酶：细菌在持续的各种β-内酰胺类抗菌药物的选择压力下，被诱导产生活跃的及不断变异的β-内酰胺酶，扩展了其耐受头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟等第3代及第4代头孢菌素，以及氨曲南等单环β-内酰胺类抗菌药物的能力，这些新的β-内酰胺酶被称为。

属于分类的Ａ类和Ｄ类酶，按分类属2。

根据质粒所携带编码基因同源性的不同，主要有、、、型。

还有一些少见的型别，如、、、、、等。

引起临床感染的产β-内酰胺酶细菌依次为肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等。

二、产细菌感染的流行因素及发展趋势自1982年在英格兰首先发现产克雷伯菌后，产细菌的流行在世界各地广泛报道。

主要存在于临床分离的革兰阴性杆菌，其中又多见于肠杆菌科细菌［2-4］。

在肠杆菌科细菌中以大肠埃希菌和克雷伯菌最为常见，克雷伯菌包括肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌。

其他常见产细菌有产气肠杆菌、变形杆菌、沙门属菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属等。

各个国家和地区产细菌的发生率明显不同。

日本、荷兰等国家产细菌的发生率很低，而法国、印度等国家产细菌的发生率很高，可有高达50％以上的克雷伯菌属的细菌产生，而且具有较严重的耐药性。

我国大陆不同研究者报告的产细菌发生率各有不同，大肠埃希菌发生率大约在40％，肺炎克雷伯菌发生率更低一些。

B-内酰胺酶的检测方法

奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加物进行了调查。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β- 内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。
（是否产生抑菌圈）
1 ＋－－有
2 ＋－＋有
3 ＋＋－无
4 ＋＋＋有
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。
在青霉素G浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在
自陆桥。
1.3 试剂试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水
1. 4 主要仪器牛津杯（外径8mm）
2 方法
2.1 预试验
2.1.1 抗生素检测用培养基制备
90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黄微球菌）。
2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。

金属β-内酰胺酶综述

金属类β-内酰胺酶β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。

金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。

酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。

底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。

金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。

一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。

20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。

这些酶都由染色体基因编码。

该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。

1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。

现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。

AmpC酶的检测方法及在临床耐药菌检测中的意义

AmpC酶的检测方法及在临床耐药菌检测中的意义抗生素耐药性问题已成为全球关注的焦点，而我国又是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，因此，有必要加强对细菌耐药性的检测、监测，才能及时发现并控制耐药菌的传播。

目前，对于耐药菌产生的重要β-内酰胺酶—超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），大家有比较深入的认识，其检测技术也日趋成熟，但是对于在革兰氏阴性杆菌耐药中扮演着同样重要角色的酶—AmpC酶却了解甚少。

1 什么是AmpC酶AmpC酶属Ambler分类中的C组酶，其基因为ampC而得名。

AmpC酶是由细菌染色体或质粒介导产生的一类β-内酰胺酶，其作用于头孢菌素，且不被克拉维酸所抑制，故AmpC酶又称为头孢菌素酶。

染色体介导的AmpC酶可被β-内酰胺类抗生素诱导，属于诱导酶。

质粒介导的AmpC酶（pAmpC酶）与前者不同，pAmpC酶高水平持续表达，且可通过转化、接合等方式转移给其它菌种，造成耐药性的广泛传播。

1989年韩国首次报道发现一种质粒介导的AmpC酶（CMY-1），1990年在美国发现另一种pAmpC酶（MIR-1），目前已有20多种pAmpC酶被陆续报道。

根据AmpC酶的遗传学关系，可将pAmpC酶分为5个家族：（1）枸橼酸杆菌起源的LAT族；（2）未知起源的FOX族；（3）阴沟肠杆菌起源的Entb族；（4）摩根摩根菌起源的Morg族；（5）蜂房哈夫尼起源的Haf族 [1]。

根据AmpC酶的产生方式又可将其分为3类：诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。

（1）诱导高产酶：AmpC酶的合成往往与β-内酰胺类抗生素的存在有关。

大部分肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌在无β-内酰胺类抗生素存在的条件下只产生少量的AmpC酶。

当有诱导作用的β-内酰胺类抗生素存在时，AmpC酶的产量明显增加。

（2）持续高产酶：即产AmpC酶的菌株无论在有无β-内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC酶，其原因为去阻遏突变。

超广谱β-内酰胺酶的检测及耐药性分析

超广谱β-内酰胺酶的检测及耐药性分析莫志航;宁炎【摘要】目的了解临床产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的发生率、耐药性,以便于对ESBLs进行监测和治疗.方法对102株E.coli和78株K.pneumoniae采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)规定的ESBLs表型筛选和确证试验确定ESBLs的发生率,并检测产ESBLs的E.coli 和K.pneumoniae的耐药性.结果 13.7％ (14/102)的大肠埃希菌和26.9％ (21/78)的肺炎克雷伯菌产ESBLs;产ESBLs菌株对亚胺培南耐药率为0％,除对阿米卡星、头孢西丁、替卡西林/克拉维酸联合酶抑制剂耐药率较低外,对三代头孢菌素、磺胺类和喹诺酮类药物均出现较高耐药.结论对产ESBLs菌株引起的感染,亚胺培南为首选.%Objective To investigate the prevalence of strains producing extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) among Escherichia coil and Klebsiella pneumoniae, and to determine the drug resistance of the strans for better control and treatment of ESBLs. Methods One hundred and two strains of E. coli and 78 strains of K. pneumoniae were investigated for production of ESBLs by phenotypic screening and confirmatory test provided by the NCCLS. The drug resistance of ESBLs-producing strains was also investigated. Results 13.7% (14/102) of E. coli and 26.9% (21/78) of K. pneumoniae investigated were found to produce ESBLs. All ESBLs-producing strains were found to be susceptible to imipenem, relatively lowly resistant to of amikacin, cefoxitin, cefoperazone/β-lactamase inhibitor com-binations, and highly resistant to third generation cephalosporins, sulfonamides and quinolones. Conclusion Imipen-em isthe premium antibiotics for the treatment.of infection caused by ESBLs-producing strains.【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2012(023)018【总页数】2页(P78-79)【关键词】超广谱β-内酰胺酶;大肠埃希菌;肺炎克雷伯菌;耐药性【作者】莫志航;宁炎【作者单位】增城市新塘医院检验科,广东增城511340;增城市新塘医院检验科,广东增城511340【正文语种】中文【中图分类】R446超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)主要由大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产生，能水解青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类抗生素，从而使之失效[1]。

β-内酰胺酶的分类

β-内酰胺酶的分类
β-内酰胺酶可以分为四类：
1. 类A β-内酰胺酶：这是最常见的β-内酰胺酶，它能够降解广谱青霉素和第一代头孢菌素。

这些酶通常由革兰阴性菌产生。

2. 类B β-内酰胺酶：这些酶也称为金属β-内酰胺酶，因为它们需要金属离子（通常是锌）来发挥催化作用。

这些酶能够降解第二代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素。

类B β-内酰胺酶主要由革兰阴性菌产生。

3. 类C β-内酰胺酶：这些酶主要由革兰阳性菌产生，能够降解广谱青霉素和第一代头孢菌素。

类C β-内酰胺酶通常不会降解第二代头孢菌素和第三代头孢菌素。

4. 类D β-内酰胺酶：这些酶由革兰阳性菌产生，能够降解广谱青霉素和第一代头孢菌素。

类D β-内酰胺酶通常不会降解第二代头孢菌素和第三代头孢菌素。

β—内酰胺酶的分类

β—内酰胺酶的分类
一、β-内酰胺酶的分类
1、 Glycoside hydrolase（糖苷酶）
糖苷酶可将葡萄糖（即糖苷）的苷酸与醣之间的键断裂，产生一个葡萄糖分子，以及一种带有醣残基的糖苷。

糖苷酶中包括了α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和神经氨酸苷酶。

2、 Glycosyltransferases（糖基转移酶）
这种酶可在糖与糖之间及芳香醛与糖之间转移糖基，可用来合成多糖，碳酸酐和糖苷。

3、 Glycogen hydrolases（糖原酶）
糖原酶可将糖原的α-1,4-糖链和α-1,6-糖链断裂，而产生的产物是葡萄糖和糖原残基。

4、 Glycosynthases（糖酰肽酶）
糖酰肽酶可将糖基与肽中的氨基酸链接，是O-糖肽和C-糖肽合成所必需的酶。

5、 Peptidoglycan hydrolase（多肽多糖酶）
多肽多糖酶可以降解多糖多肽中的糖链，是拟菌素类抗生素的有效靶标。

6、 Hydrolases of synthetic polysaccharides（合成多糖酶）
合成多糖酶可以解除各种合成多糖分子之间的糖链，是多糖品种分解和利用的关键酶。

- 1 -。

检验科细菌耐药性监测标准操作程序SOP文件

检验科细菌耐药性监测SOP文件一、耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococci,MRS）MRS是引起临床感染的常见病原菌，同时也是引起医院感染的重要病原菌之一，其耐药特点是耐受甲氧西林的同时，还对临床广泛应用的多种抗生素呈现多重耐药，因而该菌所致感染已成为临床治疗的一大难题。

（一）MRS测定方法1、纸片扩散法接种物：直接悬液法从非选择琼脂平皿上挑取少许单个菌落至无菌生理盐水调至浓度0.5 McFarland,具体操作同常规纸片法药敏试验。

苯唑西林纸片，1R g/片，检测MRS平板应置于35℃ （而不是37℃）孵育24h （而不是16〜18h）。

结果判断：金黄色葡萄球菌：S：三13mm；I：11〜12mm；R:W10mm。

凝固酶阴性葡萄球菌：S：三18mm；R W17mm。

对于苯唑西林纸片周围的抑菌圈内有任何小菌落或稀薄“菌膜”生长都应列为MRS。

2、琼脂筛选法：如果纸片试验结果中介时，可做琼脂筛选法，培养基为MH琼脂+6R g/ml苯唑西林+4%NaCl,调整菌液浓度0.5McFarland,于35℃孵育24h,凡有任何生长即使一个菌落均报MRS。

（二）MRS监测意义对于MRS,应报告对所有头抱菌素类和其他B -内酰胺酶类耐药，喹喏酮类药物，除氟哌酸外，环丙氟哌酸，氟嗪酸有较好抗菌活性（耐药率10〜23%之间），利福平敏感率在90%以上，未见耐万古霉素菌株，但已有万古霉素中介金黄色葡萄球菌。

二、高水平耐药的肠球菌（HLAR）及耐万古霉素的肠球菌（VRE）（一）药敏测定方法1、常规测定方法：采用K-B纸片扩散法，头抱菌素不用做（均为耐药），氨苄，庆大霉素，替考拉宁，万古霉素一定要做。

2、高水平氨基糖甙类耐药性测定：⑴高含量纸片扩散法：通常测定庆大霉素和链霉素的高度耐药性，具体操作如常规纸片法药敏试验。

药敏纸片：庆大霉素：120R g/片；链霉素300p g/片结果判断：R：W6mm；I：7~9mm；S：三10mm⑵含单一高浓度抗生素琼脂平皿法：稀释法：庆大霉素：R：三500R g/ml；链霉素：R：2000p g/ml3、万古霉素耐药性测定：纸片扩散法，具体操作如常规纸片法药敏试验，万古霉素纸片为：30p g/片，检测平皿置35℃24h （而不是16〜18h）,并注意抑菌圈内有无小菌落或薄膜生长。

两种筛选超广谱β-内酰胺酶方法的比较

两种筛选超广谱β-内酰胺酶方法的比较超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是指由质粒介导产生的能赋予细菌对多类β-内酰胺类抗生素水解的一类酶，该酶能被棒酸等抑制剂抑制。

由于许多产生ESBLs菌株为革兰阴性杆菌，临床以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中检出ESBLs较高。

我们采用双纸片协同试验和E-test法对产生ESBLs大肠埃希菌进行了比较测定，现报告如下。

1．材料与方法1.1材料1.1.1 菌株实验用大肠埃希菌50株，其中产生ESBLs25株，ESBLs阴性25株。

菌株鉴定和药敏实验确认均采用 Vitek32系统，为生物梅里埃公司产品，大肠埃希菌(Ecoli)质控菌株为ATCC25922、产ESBLs酶Ecoli为ATCC35218。

1.1.2 药敏纸片头孢三嗪、舒普深、头孢他啶、阿莫西林/棒酸(20μg／10g)、氨曲南、头孢噻肟、头孢哌酮。

1.1.3 MH肉汤和MH琼脂1.2方法1.2.1 抗生素敏感性试验纸片扩散法按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐标准实施。

1.2.2 双纸片协同试验按常规氏片扩散法在MH上涂布好受试菌，先在平板中心贴上阿莫西林／棒酸纸片，而后在其上下左右贴30μg片头孢三嗪、头孢哌酮、头孢他啶和氨曲南纸片，各纸片中心距复合剂纸片中心为30mm或20mm，35℃卵育18～20h。

结果解释，如周围4个药敏纸片中有任何一个抑菌环在靠近复合剂纸片一侧的边缘出现扩大或加强，说明该菌产ESBLs。

1.2.3 E-test法E-test法试剂条含有两个梯度浓度，一端是头孢他啶(0．5～32μg/ml)，另一端是头孢他啶(0．125～8μg/ml)+4μg/ml棒酸。

如单独头孢他啶MIC与头孢他啶+棒酸MIC比值>提示菌株产ES- BLs。

4种方法检测结果菌株有差异，重复试验，仍是相同结果，才作为统计数据。

2．结果2.1双纸片协同试验25株中检出23株产ESBLs的菌株，有2株产ESBLs菌株未被检出，25株ESBLs阴性株中，有1株假阳性结果。

产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家共识

产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家共识产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家委员会超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase,ESBLs）是肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药的主要机制之一，其预防与治疗已成为临床医生需要面对的重要问题［1］，但国内外缺少相关问题处理的指导性意见。

《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》编辑部和《医学参考报·感染病学频道》编辑部组织国内部分专家制定本《共识》，以对ESBLs 相关问题的处理提供指导。

其分类见表1。

2．超广谱β-内酰胺酶：细菌在持续的各种β-内酰胺类抗菌药物的选择压力下，被诱导产生活跃的及不断变异的β-内酰胺酶，扩展了其耐受头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟等第3代及第4代头孢菌素，以及氨曲南等单环β-内酰胺类抗菌药物的能力，这些新的β-内酰胺酶被称为ESBLs。

ESBLs属于Ambler分类的Ａ类和Ｄ类酶，按Bush分类属2be。

根据质粒所携带编码基因同源性的不同，ESBLs主要有TEM、SHV、CTXM、OXA型。

还有一些少见的ESBLs型别，如PER、VEB、CMZ、TLA、SFO、GES等。

引起临床感染的产β-内酰胺酶细菌依次为肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等。

二、产ESBLs细菌感染的流行因素及发展趋势自1982年在英格兰首先发现产ESBLs克雷伯菌后，产ESBLs细菌的流行在世界各地广泛报道。

ESBLs主要存在于临床分离的革兰阴性杆菌，其中又多见于肠杆菌科细菌［2-4］。

在肠杆菌科细菌中以大肠埃希菌和克雷伯菌最为常见，克雷伯菌包括肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌。

其他常见产ESBLs细菌有产气肠杆菌、变形杆菌、沙门属菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属等。

pbd结构域_β-内酰胺酶_解释说明

pbd结构域β-内酰胺酶解释说明1. 引言1.1 概述引言部分将介绍本篇长文的研究重点，即PBD结构域和β-内酰胺酶的关系。

同时，也会向读者简要阐述PBD结构域和β-内酰胺酶的基本概念，为后续内容的理解打下基础。

1.2 文章结构本篇文章将包括三个主要部分：PBD结构域的定义与特征、β-内酰胺酶的功能与分类，以及PBD结构域与β-内酰胺酶关系的解析。

首先，我们将介绍PBD结构域的定义、起源以及其在生物学中的重要性。

接着，我们将探讨β-内酰胺酶的基本功能和作用机制，以及其多样性和在生物过程中所扮演的角色。

最后一部分将详细分析PBD结构域与β-内酰胺酶之间的关系，包括普遍存在和保守性分析、对功能发挥的影响和调控机制，以及与抗性机制相关研究进展。

1.3 目的本篇长文旨在全面解释说明PBD结构域和β-内酰胺酶之间的关系。

通过对PBD 结构域及其在生物学中的重要性、β-内酰胺酶的功能与分类以及PBD结构域与β-内酰胺酶关系的详细分析，我们希望能够揭示两者之间的相互作用机制，并归纳总结已有研究成果。

同时，我们也将指出存在的问题和未来研究可以展望的方向，为相关领域的科学家提供参考和启发。

以上就是本篇长文“pbd结构域β-内酰胺酶”的引言部分内容概述。

2. PBD结构域的定义与特征2.1 PBD结构域的概念和起源PBD（Periplasmic Binding Proteins）结构域是一种被广泛发现于细菌和古菌中的蛋白质结构域。

它起源于原核生物，并在真核生物中也有进一步演化和出现。

PBD结构域通常存在于细胞质膜与外界环境之间的可渗透性屏障——外膜或细胞壁上，扮演着重要的细胞信号传导和物质运输的角色。

2.2 PBD结构域的基本特征PBD结构域具有以下基本特征：首先，PBD结构域通常由一个或多个高度保守序列组成，这些保守序列位于蛋白链上且通过高度专一性相互作用与特定配体分子进行结合。

这种具有高选择性和亲和力的结合机制使得PBD结构域能够识别并与特定小分子（如离子、氨基酸、糖类等）进行相互作用。

β-内酰胺酶研究进展

β-内酰胺酶研究进展摘要：青霉素于40年代初首次用于临床，几年后就从链球菌中分离到了青霉素酶，以后随着β-内酰胺类抗生素的不断开发和广泛应用，特别是近几十年来超广谱新品种的大量应用，β-内酰胺酶的种类、底物谱和耐药程度均以惊人的速度在发展，不能不引起格外的重视。

关键词：细菌，β-内酰胺酶，耐药任何生物都试图适应周围环境并生存下去，细菌个体小，易变异,拥有耐药能力，这是自然界的法则。

科学界有一种理论叫“中性突变漂变学说”，以“中性突变”为基础的分子进化学已逐渐形成。

这个学说认为，在分子水平上看，大部分基因突变对于生命体的生存既不产生有利效应，也不酿成不利后果，因此，这类突变在自然选择中是“中性”的。

在亿万年中，生物体内的基因不断产生中性突变，他们不受自然选择的支配，而是通过随机的偶然过程（即遗传漂变）在群体中固定下来或是被淘汰，结果就造成了基因和蛋白质分子的多样性，实现了分子的进化。

在药物选择性压力下，产β-内酰胺酶的细菌被筛选出来，得以泛滥。

为了对β-内酰胺酶有一个教深入了解，现将β-内酰胺酶的研究综述如下。

1 β-内酰胺类药物作用机理肽聚糖合成的最后一步是被称为青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，即PBPs）的转肽酶形成的。

β内酰胺类抗生素与D-丙氨酰-D-丙氨酸结构上的相似使得它们与青霉素结合蛋白结合（图一）。

β-内酰胺核不可逆地与青霉素结合蛋白的Ser403单元结合，使其失活，从而抑制细菌细胞壁的形成。

此外这个结合可能还激活细胞壁中的自溶酶。

图1 青霉素与青霉素结合蛋白结合使酶失活2 β-内酰胺酶起源β-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的灭活酶。

β-内酰胺酶来源于细菌细胞壁合成酶(即PBPs)，是由于细菌合成PBPs的过程中的基因的变异而造成的（图2）。

β-内酰胺类药物在这类酶的作用下，使β-内酰胺环水解开环，而β-内酰胺环是与PBPs结合的活性功能部位，因此β-内酰胺环的破坏使其失去了干扰细菌细胞壁合成的功能。

产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家共识

其分类见表1。

ESBLs属于Ambler分类的Ａ类和Ｄ类酶，按Bush分类属2be。

根据质粒所携带编码基因同源性的不同，ESBLs主要有TEM、SHV、CTXM、OXA型。

还有一些少见的ESBLs型别，如PER、VEB、CMZ、TLA、SFO、GES等。

引起临床感染的产β-内酰胺酶细菌依次为肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等。

二、产ESBLs细菌感染的流行因素及发展趋势自1982年在英格兰首先发现产ESBLs克雷伯菌后，产ESBLs细菌的流行在世界各地广泛报道。

ESBLs主要存在于临床分离的革兰阴性杆菌，其中又多见于肠杆菌科细菌［2-4］。

在肠杆菌科细菌中以大肠埃希菌和克雷伯菌最为常见，克雷伯菌包括肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌。

其他常见产ESBLs细菌有产气肠杆菌、变形杆菌、沙门属菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属等。

-内酰胺酶的检测方法

-内酰胺酶的检测方法
内酰胺酶是一种酶，在细胞中起着重要的生物催化作用。

内酰胺酶的功能与细胞的代谢、信号调节和细胞凋亡等过程密切相关。

因此，对于内酰胺酶的检测方法具有很大的研究意义。

常用的内酰胺酶检测方法包括：
1. 活性测定法：通过测定内酰胺酶的催化活性来确定其含量，常用的测定方法有亚甲蓝法、苏丹Ⅲ法和三氯乙酸法等。

这些方法通过观察酶催化产生的颜色、光谱或其他物理性质的变化，来间接或直接测定内酰胺酶的活性。

2. 免疫测定法：利用特异性抗体与内酰胺酶结合来检测其含量。

包括免疫沉淀法、免疫层析法、免疫荧光法和酶联免疫吸附测定法等。

3. 基因表达测定法：通过检测内酰胺酶的编码基因的转录水平和翻译水平来推测其含量。

常用的方法包括实时荧光定量PCR、Northern blotting和Western blotting等。

4. 代谢产物分析法：通过分析内酰胺酶代谢产物的含量来间接推测其活性和含量。

例如利用质谱分析法测定内酰胺酶代谢产物的质谱图谱，从而推测其含量和活性。

综上所述，对于内酰胺酶的检测可以采用活性测定法、免疫测定法、基因表达测定法和代谢产物分析法等不同方法，根据研究的目的和要求选择合适的方法进行检测。

β-内酰胺酶的检测方法

外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质。

违法使用的目的，是为了掩盖违规使用大环内脂类等抗生素治疗奶牛疾病的行为。

但是，内源性β-内酰胺酶的产生机理也是科学研究基本确认的事实。

近几十年来，国际国内畜牧业养殖奶牛过程中无限制使用大环内脂类抗生素治疗动物、家禽等食用动物各种炎症、败血症、水肿病等病症，造成革兰氏阳性细菌对抗生素耐药，细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性一般通过4种途径。

（1）产生β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素开环失活，这是产生耐药的主要原因。

目前发现的β-内酰胺酶已超过300种，它通过与β-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键从而使β-内酰胺类抗生素开环而失活。

（2）改变抗生素与青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）的亲和力。

当β-内酰胺类抗生素与PBP结合后，PBP就会失去酶活性，使细菌细胞壁的形成部位破损而引起溶菌，反之，则成为耐药菌。

PBP基因的变异，使β-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，这是形成耐药的根本原因。

（3）细胞膜和细胞壁的结构发生改变，使药物难以进入细菌内。

如生物膜的形成。

（4）细菌体内的能力依赖性主动转运机制，将已进入细菌内的抗生素泵出体外，也可导致耐药性。

由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，同外源性β-内酰胺酶的分别鉴定检测技术尚未见报道。

而目前各检测机构正在研究的乳制品中β-内酰胺酶的检测方法无论是化学仪器分析高效液相色谱法还是微生物法，其检测原理都是：测出的β-内酰胺酶无法判定是人为添加的或是耐药细菌产生的。

奶制品中检出的β-内酰胺酶有可能是非法添加的，也有可能是细菌产生的。

耐药性产生的机理很复杂，细菌耐药基因的转移、共生菌协同以及基因交叉耐受，等影响都要考虑。

另外，根据现有的国际食源性抗生素耐药微生物的风险管理原则，建议加强畜牧业奶业生产全过程，而终产品的β-内酰胺酶检测始终是一个辅助手段，凭检测结果很难处理。

细菌超广谱β-内酰胺酶与耐药性讲解

4、分子生物学检测
聚合酶链式反应(PCR) 参照 GenBank 已发表的 TEM、SHV、CTX-M
和 OXA 各亚型的基因序列，分别设计特异性引物
5、总结ESBLs的检测方法
表型初筛试验
初步判断
表型确证试验
三相水解试验 E-test 法
确认菌株是否只产ESBLs
分子生物学检测
最终确认
（四）ESBLs 的防治
（二）、β-内酰胺酶是细菌耐药的机理
丝氨酸的结构式
β-内酰胺环上的羰基碳在结合β内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其成为开环物。
（三）β-内酰胺酶分类方法
一、Bush-M-J分类法（功能分类法）根据β-内酰胺酶的功能相似性（底物和抑制物的轮廓）
分为1 ，2 ，3 ，4 四组，其中2组和3组又分为很多亚组。二、Ambler分类法（分子分类法）根据酶的氨基酸序列的保守性和相似性将β-内酰胺酶分为 A，B，C，D四组。
(三)合理使用抗生素
• 有报道显示抗生素尤其是第三代头孢菌素的应用与 ESBLs 的感染流行有关。
• 敏感菌因抗生素的选择性压力而被大量杀灭后，耐药菌得以大量繁殖而成为优势菌，同时抗生素的选择性压力也加快了细菌突变的速度。
• 因此合理使用抗生素并采取有效的消毒隔离措施，才是预防ESBLs 产生的最好方法。
联合产 ESBLs 和 AmpC 菌株
3、E-test 法
E-test，为AB BIODISK公司开发的测试ESBLs的试剂条。应用表型确证试验的原理，将头孢他啶（或头孢噻肟）和复方制剂头孢他啶/克拉维酸（或头孢噻肟/克拉维酸）分别置于试条两端，将试条贴于接种了待测细菌的平板上，刻度面朝上， 35℃培养18-24小时后，读取试条两端的MIC值。当头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸（或头孢噻肟与头孢噻肟/克拉维酸）的比值≥8时，即可判定为产ESBLs，否则为阴性。

β-内酰胺酶的分类及检测

色谱法
高效液相色谱法
利用高效液相色谱技术分离和检测β内酰胺酶，通过检测色谱图中的峰形和峰高，确定β-内酰胺酶的浓度。
气相色谱法
利用气相色谱技术分离和检测β-内酰胺酶，通过检测色谱图中的峰形和峰高，确定β-内酰胺酶的浓度。
免疫学检测法
酶联免疫吸附试验
利用特异性抗体与β-内酰胺酶结合，通过酶标仪检测发光强度，从而确定β-内酰胺酶的浓度。
按照水解底物分类
TEM型
能水解青霉素类和头孢菌素类抗生素。
SHV型
主要水解头孢菌素类抗生素。
AmpC型
能水解所有β-内酰胺类抗生素。
OXA型
对所有β-内酰胺类抗生素的水解活性较低，但对碳青霉烯类抗生素的水解活性较高。
按照结构分类
Class A
Class B
属于丝氨酸酶，由一条多肽链组成，含有活性位点Ser-Thr-Gly。
放射免疫分析法
利用放射性同位素标记β-内酰胺酶，通过检测放射性强度，从而确定β-内酰胺酶的浓度。
03
β-内酰胺酶的检测标准
检测标准制定机构
美国临床和实验室标准协会（CLSI）
01
CLSI是全球知名的临床实验室标准制定机构，制定了一系列β-
内酰胺酶检测标准，为全球实验室提供指导和参考。
欧洲药典委员会（EDQM）
β-内酰胺酶的分类及检测
• β-内酰胺酶的分类 • β-内酰胺酶的检测方法 • β-内酰胺酶的检测标准 • β-内酰胺酶的检测现状与展望
01
β-内酰胺酶的分类
按照来源分类

微生物来源
由细菌、真菌等微生物产生的β-内酰胺酶。
动物来源
某些动物体内也存在的β-内酰胺酶，如某些鱼类。