生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法

合集下载

生物化学实验报告

一、实验目的：

1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项；

2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法；

3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；

4、掌握酶蛋白分离提纯的原理；

5、掌握酶的比活力测定及其计算方法；

6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法；

7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。

称量技术：

1、了解电子天平的用途

2、了解电子天平的工作原理

3、掌握电子天平的使用方法

4、掌握电子天平使用前后的注意事项

离心技术：

1、了解离心机的基本原理和用途

2、了解离心机的类型和用途

3、了解离心机的型号和控制版面

4、掌握离心机的使用方法

5、掌握离心机使用的注意事项

层析技术：

1、了解层析技术的基本原理

2、了解层析技术的分类情况

3、了解各种层析技术的原理

4、掌握凝胶层析技术

光谱分析技术：

1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理

2、了解仪器结构和分类

3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项

电泳技术：

1、了解电泳的基本原理

2、了解电泳的类型

3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理

4、掌握垂直板电泳的操作技术

5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术

6、了解转移电泳的基本原理和操作方法

7、了解双向电泳的基本原理和操作方法

二、实验原理：

1、蔗糖酶的提取：

①酵母菌的基本特征：

单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。

②生物材料破碎方法：

（1）机械（匀浆）法

①研钵

②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯

先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。

实验2 凝胶过滤法分离蛋白质(1)

实验3 凝胶过滤法分离蛋白质（2学时）

一、目的与要求

学习并掌握凝胶过滤的基本操作技术、分离原理及其应用。

二、原理

凝胶过滤(Gelfiltration)色谱，又称分子筛色谱(Molecular Sieve Chromatography)或排阻色谱(Exclusion Chromatography)。凝胶过滤色谱所用的介质载体由具有一定孔径的多孔亲水性凝胶颗粒组成。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，如图7所示，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。较小的分子则容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积V o，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V0时，出现洗脱峰。

图2-1 凝胶色谱原理图2-2 凝胶色谱中洗脱的三种峰凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积V i，能全部透入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V o+Vi时出现洗脱峰，介于其间的分子将在洗脱体积为V o+V e时，出现洗脱峰(图30-2)。

分子筛分配系数K=V e/Vi，对于球形大分子，洗脱体积(V o+V e)与分子量(Mr)相关，K=-blgMr+c，对一固定的柱来讲，当洗脱条件相同时，b、c及V i都为常数，即V e与K相当，所以洗脱体积与被分离物质的分子量(Mr)的对数之间成线性关系，该柱的分子量标准曲线可用已知分子量的一些蛋白质测出。这就是凝胶过滤分离大分子及用于测定蛋白质分子量的原理。凝胶过滤既可用于分离大分子，又可用于样品的脱盐操作。

蛋白质分子量测定实验报告

蛋白质分子量测定实验报告实验报告：蛋白质分子量测定

一、实验目的

1.掌握蛋白质分子量测定的基本原理和方法。

2.学习使用SDS-PAGE电泳技术测定蛋白质分子量。

3.了解蛋白质的基本性质和分子结构。

二、实验原理

蛋白质分子量测定是蛋白质研究中的基本操作之一。通过测定蛋白质的分子量，可以了解蛋白质的结构、功能和分类等信息。常用的蛋白质分子量测定方法有SDS-PAGE电泳、渗透压法、凝胶色谱法等。本实验采用SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量。

SDS-PAGE电泳法是一种基于电泳分离和分子筛作用的蛋白质分离技术。在SDS-PAGE电泳中，样品蛋白质与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，然后在电场作用下迁移。由于SDS的分子量已知，因此根据迁移率和分子量的关系，可以通过计算得出蛋白质的分子量。

三、实验步骤

1.准备试剂和仪器

（1）试剂：蛋白质样品、SDS、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）、甘氨酸碱溶液、冰醋酸、超纯水。

（2）仪器：电泳仪、垂直板电泳槽、摇床、离心管、移液器、计时器、分光光度计。

2.样品制备

（1）将蛋白质样品用Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）稀释至一定浓度。

（2）加入等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液，搅拌均匀。

（3）煮沸5-10分钟，使蛋白质变性并充分与SDS结合。

（4）离心10分钟，取上清液备用。

3.电泳分离

（1）按照电泳仪使用说明书，装配垂直板电泳槽，加入预冷的Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）。

（2）将制备好的样品加入电泳槽中，注意不要产生气泡。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

定的可信度。
精选2021版课件
25
七、思考题
在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?
在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?
样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
精选2021版课件
26
十二、达到预期目标
1. SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动
精选2021版课件
6
（一）分类
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类：
1. 连续系统：电泳体系中缓冲液 pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
精选2021版课件
7
2.不连续系统：由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
精选2021版课件
19
C.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,
D.加样（摸索加样量）取10µl标准蛋白溶解液于 EP管内，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。
取10µl样品溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量分别为5µl 和10µl。
E.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前, 样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。

生物化学实验--蛋白质性质试验

取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉
酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。淀产生。
然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有 2、取一支试管加蛋白液2ml，再加
什么变化？
入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，观
（四）茚三酮反应取蛋白液1ml于试管中，加10滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。
实验九胰蛋白酶的活力测定
实验十水果中维生素C的定量测定
实验十一聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳牛血清
生物化学实验技能培训
通过wk.baidu.com物化学实验应该做到：
⑴ 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。
⑵ 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。
四、实验步骤
（一）蛋白质的盐析作用
原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。
操作：1、取试管1支，加蛋白液2ml，然后加固体硫酸铵 (加的过程要缓慢，加的量要少随时摇匀），直至其饱和（大约为50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。
蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。

10、凝胶层析(分子筛层析)分离蛋白质

实验十一凝胶层析法测定蛋白质分子量

实验目的：了解凝胶层析的原理及其操作，分离血红蛋白和胰蛋白酶（或蓝葡聚糖2000）。

实验原理：

凝胶层析也成凝胶过滤法，排阻层析、分子筛层析或渗透层析等是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。

用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。以交联葡聚糖分离物质和测定相对分子量为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。

交联葡聚糖（Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基的多糖）用交联剂环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物。控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。“G”表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小，见表3-3（P.41.）。G值越小，颗粒比较硬，G值越大，颗粒相比较软些（可以以手感触）。G值也对应凝胶的工作范围。

凝胶层析广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，洗脱时，此类物质沿着颗粒间隙下移，最先流出层析柱（板书：图3-14，3-15A）。而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，在凝胶颗粒的网孔内滞留的时间越长，结果是小分子的蛋白质洗脱速度较慢，即洗脱体积较大，最后流出柱外。不同一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。不同分子质量蛋白质的洗脱体积也不相同，通过部分收集器可以将它们收集在不同的洗脱组分中。Spladex G-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。G-75到G-200可用于分离相对分子质量大于10000的蛋白质。

凝胶层析法(gel chromatography)测定蛋白质分子量

一、实验目的

1. 了解凝胶层析的原理及其应用。

2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。

二、实验原理

凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广

泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定

蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结

构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多

孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实

现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某

种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，

而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子

从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

凝胶层析分离原理示意图参见64页的“图 3－5”。

对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～10 0%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数 Kav（分离化合物在内

水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：

生物化学实验-SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量

2）1mol/L，pH8.8Tris-HCl缓冲液 Tris 21g 溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.8蒸馏水定容1000ml。
3）1mol/L，pH6.8 Tris-HCl 缓冲液 Tris21g 溶于蒸馏水，用浓 HCl调至 pH6.8 定容1000ml。
4）10%（W/V）SDS 5）10%（W/V）过硫酸铵（现用现配） 6）TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
实验七
SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量
实验目的
学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶Leabharlann Baidu泳的方法和测定蛋白质分子量的技术
实验原理
1、蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质-SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
（5）染色液 • 0.1%（质量分数）考马斯亮蓝R250 • 40%（体积分数）甲醇 • 10%（体积分数）冰醋酸 • 染色1~2h或过夜。
（6）脱色液 • 10%（体积分数）甲醇 • 10%（体积分数）冰醋酸 • 脱色需3~10h，其间更换多次脱色液至背景清楚。

凝胶层析法分离蛋白质实验报告

凝胶层析法分离蛋白质实验报告凝胶层析法分离蛋白质实验报告

一、实验目的

本实验旨在通过凝胶层析法分离蛋白质，掌握凝胶层析法的基本原理和方法，了解凝胶层析在蛋白质分离中的应用。

二、实验原理

凝胶层析法是一种基于分子大小不同的分离技术。它利用凝胶颗粒的孔径大小，将不同大小的分子进行分离。当蛋白质溶液通过装有凝胶颗粒的层析柱时，不同大小的蛋白质分子会根据其大小分别进入凝胶颗粒的不同孔径，从而实现在一个连续的流洗过程中将不同大小的蛋白质分离开来。

三、实验步骤

1.准备实验材料：凝胶颗粒（如Sephadex G-25或G-75）、层析柱、蛋白质

样品（如牛血清白蛋白）、缓冲液等。

2.将凝胶颗粒装入层析柱中，注意不要压实，保持颗粒松散。

3.加入缓冲液，使凝胶颗粒充分膨胀。

4.将蛋白质样品加入到层析柱中，注意不要加太多，以免影响分离效果。

5.打开流出口，使缓冲液缓慢流过层析柱，收集流出的溶液。

6.记录每管收集的溶液体积和蛋白质含量，绘制洗脱曲线。

7.收集分离后的蛋白质。

四、实验结果与分析

1.洗脱曲线的绘制与分析

实验中，随着缓冲液的流过，不同大小的蛋白质分子会依次被洗脱出来。通过观察每管收集的溶液体积和蛋白质含量，我们可以绘制出洗脱曲线。洗脱曲线显示了不同大小的蛋白质分子被洗脱出来的时间和顺序。通过洗脱曲线，我们可以分析不同蛋白质分子的性质和大小。

2.分离效果评估

通过比较实验前后的蛋白质样品，我们可以评估凝胶层析法的分离效果。在凝胶层析法中，不同大小的蛋白质分子被分离出来，从而可以得到多个不同的蛋白质组分。通过观察每个组分的蛋白质含量和性质，我们可以评估凝胶层析法的分离效果。

生物化学实验层析法实验

实验二（1）凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白

【实验目的】

掌握凝胶层析分离蛋白质的基本原理，掌握柱层析的基本操作方法

【实验原理】

交联葡聚糖凝胶具有多糖网状结构，血红蛋白较鱼精蛋白大：血红蛋白分子量为64500，鱼精蛋白分子量为2000-12000，因此在交联葡聚糖凝胶中鱼精蛋白从胶体分子内部网状结构孔隙中通过，血红蛋白从胶体分子间隙中通过。血红蛋白走过的路径短且速度快，鱼精蛋白走过的路径长且速度慢。因此可以在层析柱中观察到红色的血红蛋白先被洗脱出来，而经二硝基氯苯预染呈黄色的鱼精蛋白则在其后被洗脱出来

【实验步骤】

检查层析装置是否完好→装填层析柱（蒸馏水面应高凝胶面1cm左右）→滴加0.2ml的血红蛋白和鱼精蛋白混合样品→放出一些蒸馏水使样品沉降到凝胶表面→滴加蒸馏水至液面高凝胶2cm→开始洗脱，过程中应不断滴加蒸馏水使液面高度尽量保持不变

【实验结果】

如图所示：

【讨论与分析】

1.凝胶层析柱装填时应避免出现气泡，因为气泡会导致血红蛋白的洗脱路径变

窄，以至于血红蛋白洗脱速率减慢，从而导致血红蛋白和鱼精蛋白分离不充分；

2.为避免凝胶柱装填时出现分层现象，可在再次加入凝胶前轻轻吹打沉淀好的凝

胶表面，然后再慢慢补加凝胶。

实验二（2）离子交换层析分离混合氨基酸

【实验目的】

掌握离子交换层析的基本原理，了解分离混合氨基酸的基本方法

【实验原理】

天冬氨酸的等电点是2.97，赖氨酸等电点为9.74。所以先用pH4.2的柠檬酸洗脱时天冬氨

酸带负电被洗脱出来，而赖氨酸带正电吸附在阳离子交换树脂上；然后用pH13的NaOH洗脱

蛋白分子量测定实验报告

引言：

蛋白质是生物体内最基本的功能分子之一，其分子量的准确测定对于生物学研

究以及医学诊断具有重要意义。本实验旨在通过几种常用的方法，如SDS-PAGE、Western blot以及质谱分析，来测定蛋白质的分子量。

实验方法：

1. SDS-PAGE：

SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离方法，通过SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋

白质进行变性，使其呈线性结构，并在电场作用下按照分子量大小进行迁移。

本实验选取了不同分子量的蛋白标准品，与待测蛋白样品一同加载至凝胶中，

经电泳分离后，用Coomassie蓝染色显色。根据标准品的迁移距离和蛋白样品

的迁移距离，可以大致估计待测蛋白的分子量。

2. Western blot：

Western blot是一种高灵敏度的蛋白质检测方法，结合了SDS-PAGE和免疫印

迹技术。首先，将蛋白样品经SDS-PAGE分离，然后将其转移到聚丙烯酰胺膜上。接下来，使用特异性抗体与目标蛋白结合，并用酶标记的二抗进行检测。

最后，通过显色或发光的方式观察目标蛋白的存在与否。通过与标准品的比对，可以推测待测蛋白的分子量。

3. 质谱分析：

质谱分析是一种准确测定蛋白质分子量的方法。通过将蛋白样品经过电喷雾或

激光解离，得到蛋白质的质谱图。质谱图中的峰值对应着不同的蛋白离子，根

据其质荷比可以推测出蛋白质的分子量。

实验结果：

在本实验中，我们选取了几种常见的蛋白质作为标准品，包括乳清蛋白、细胞色素C和胰岛素。通过SDS-PAGE的分离，我们观察到这些标准品在凝胶上呈现出不同的迁移距离。与标准品相比，待测蛋白样品的迁移距离可以推测出其大致的分子量范围。

蛋白质分子量的测定

常用蛋白质分子量测定方法概述

摘要：分子量是生物大分子的的基本属性之一，目前有许多方法可以对蛋白质分子量其进行测定。本文主要对较为常用的凝胶过滤层析法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、粘度法和生物质谱法进行介绍并总结每种测定方法的优劣。

关键词：蛋白质，分子量，测定

Abstract:Molecular weight is one basic parameter of biomacromolecules. Today there is handful of methods to determine the molecular weight of proteins. This review will introduce four most widely-used methods: gel-filtration chromatography, gel electrophoresis, viscometric method and the biological mass spectrometry technology, of which the strengths and weaknesses will be briefly summarized.

Key words: protein, molecular weight, determination

引言

测量目标蛋白质的分子量是许多领域在实验、科研过程中必须面对的问题，因此，掌握常用蛋白质分子量测定方法，熟悉各个方法的优缺点和使用条件是很有必要的，本文主要就四种常用蛋白质分子量测定途径进行总结和评价。

生物化学与分子生物学基本试验试验一蛋白质的盐析与透析试验

生物化学与分子生物学

基本实验

实验一蛋白质的盐析与透析

实验目的

了解蛋白质的盐析与透析的原理和意义

实验原理

血清中的蛋白质，用盐析的方法，可以分离出清蛋白、α、β球蛋白和γ-球蛋白三种。详情见盐析技术。另选择适宜孔径的半透膜，使蛋白质分子被截留，小分子的中性盐透出而达分离的目的。但透析时正负离子透过半透膜的速度不同，如硫酸铵中的NH4+的透出较快，膜内SO42-剩余而生成H2SO4，其酸度足以使蛋白质变性，因此，除盐时开始应对0.14 mol·L-1的NH4OH透析。本实验分别用双缩脲试剂和Nessler试剂检验蛋白质和NH4+的存在。

仪器材料和试剂药品

仪器材料：（1）离心管、试管及试管架。

（2）2m1刻度吸管、玻璃棒、小烧杯。

（3）透析袋。

（4）离心机。

试剂药品：（1）饱和硫酸铵溶液。

（2）硫酸铵粉末。

（3）双缩脲试剂称取CuSO4·5H2O 2.5g，加蒸溜水少许，微热溶解后稀释至100ml。另取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·H2O）10g和KI 5g，溶于500ml蒸馏水中，再加入20％氢氧化钠300ml，混匀后，慢慢加入硫酸铜溶液中，加蒸馏水至1000ml。此液可长期储存。

（4）Nessler试剂称取150g碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水100ml使之溶解，再加入110g碘，待完全溶解后加140g～150g汞，用力振摇10分钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾为止。将上清液倾入2000ml容量瓶中，并用蒸馏水洗涤瓶内的沉淀数次，将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，此为贮存液，储于棕色瓶中备用。

实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

二、装柱
1. 取层析柱，将层析柱固定在支架上，调整层析柱与水平面垂直。 2. 烧结板下端的死区用蒸馏水充满（注意：不得留有气泡，可多加约1cm高水层，使柱 1cm 内凝胶通过沉积作用更加均砂芯匀），然后关闭层析柱的出口。
3. 将凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约15cm高度即可（注意：凝胶悬液尽量一次加完，以免出现分层的凝胶带）。 4. 新柱装好后，加3-5倍体积蒸馏水流过柱床，然后平衡10min。（注意：始终层析柱与水平面垂直）
三、加样与洗脱
1. 加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待凝胶床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口（注意：不可使凝胶柱表面干涸）。 2. 用移液器将200µ l样品小心加到凝胶床表面（注意：加样时滴管垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加入）。 3. 然后打开出口，使样品进入柱床面，滴加1~2倍样品体积的蒸馏水（沿管壁轻柔滴加），待完全流入柱床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直到两条区带分开为止。
2. 特点
化学性质：
在水溶液、有机溶液、盐溶液中都较稳定。
在强碱和高温下易发生分解。
聚丙烯酰胺凝胶不带电荷，吸附效应小。商品出售的聚丙烯酰胺凝胶为干凝胶形式，使用前需溶胀。凝胶的型号见教材P18

1_生物化学实验——实验7 凝胶层析技术-to同学们

三、实验步骤
1、溶胶
1 g的Sephadex G-70，加30 ml去离子水煮沸1 h,室温溶胀3 h，冷却至室温待装柱（助教已准备好）；
2、装柱
层析柱安装好，关闭出口，将溶胀好凝胶徐徐倒入柱内，使其自然沉降，得到均匀的柱床，用3~5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床达到平衡；
3、加样
打开出口缓冲液流出，液面刚刚没过床面，关闭出口，滴管小心沿着层析柱内壁小心加于床表面，再打开流出口，使样品刚刚进入床内；
五、注意事项
1、装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱； 2、上样时沿柱内壁缓缓加入，不能冲击凝胶柱表面； 3、洗脱过程中防止凝胶柱洗脱液流干； 4、洗脱完成后凝胶要回收重复使用。
样品上柱
分析用量柱床体积的1-2%；制备用量柱床体积的20-30%
洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪检测
凝胶的保存Baidu Nhomakorabea法
0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰
部分收集器部分收集器
返回
洗脱体积Ve Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi
Kd：样品组分在流动相和固定相之间的分配系数，与被分离组分分子量大小及凝胶颗粒孔径和凝胶颗粒间空隙有关，分配系数 Kd =（Ve － Vo）/ Vi Kd=O，则Ve=Vo，即物质(全排阻)完全不能进入凝胶内部，洗脱容积等于Vo； Kd=1，Ve=Vo+Vi，即小分子可完全渗入凝胶内部，洗脱容积为Vo+Vi； 0<Kd>1,Ve=Vo+KdVi,即表示组分大小可部分进入凝胶颗粒内部

生化蛋白质实验报告

引言：

蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能中起着至关重

要的作用。生化蛋白质实验旨在研究蛋白质的组成、结构和功能，以及它们在

生物体内的相互作用。本实验通过一系列的步骤来分离和纯化蛋白质，并对其

进行进一步的分析和鉴定。

实验材料与方法：

1. 细胞培养：使用细胞培养技术培养目标蛋白质所在的细胞系，确保细胞处于

健康生长的状态。

2. 细胞裂解：通过加入细胞裂解液，使细胞膜破裂释放蛋白质。

3. 蛋白质分离：利用离心技术将裂解液中的细胞碎片与蛋白质分离。

4. 蛋白质纯化：采用色谱层析技术，如亲和层析、离子交换层析等，将目标蛋

白质从其他蛋白质中纯化出来。

5. 蛋白质分析：利用凝胶电泳技术对纯化后的蛋白质进行分析，如SDS-PAGE、Western blot等。

实验结果与讨论：

通过以上步骤，我们成功地从细胞中提取并纯化出目标蛋白质。在SDS-PAGE

凝胶电泳中，我们观察到了明显的蛋白质带，表明纯化过程取得了一定的成功。进一步的Western blot实验结果显示，目标蛋白质在细胞系中的表达水平较高，并且具有较好的免疫原性。

在蛋白质组成分析方面，我们使用质谱技术对纯化后的蛋白质进行了鉴定。质

谱分析结果显示，目标蛋白质的分子量约为50 kDa，与文献报道的相符。此外，通过质谱分析还发现了一些可能是目标蛋白质的修饰，如磷酸化、甲基化等，

这些修饰对蛋白质的功能和调控具有重要的影响。

蛋白质结构是了解其功能和相互作用的关键。在实验中，我们采用了X射线晶

体学技术对目标蛋白质的结构进行了解析。通过解析蛋白质的晶体结构，我们

生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法