RNAi片段siRNA设计原则
RNAi片段siRNA设计原则RNAi目标序列的选取原则应遵循以下几个
RNAi片段siRNA设计原则RNAi 目标序列的选取原则应遵循以下几个方面的原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
有研究结果显示GC 含量在45%-55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更为有效。
Tuschl 等建议在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA 的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使用BLAST(3)选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
(4)一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNA，平行实验以期提高成功率。
据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。
(5) siRNA的反义链3’端最好以UU结尾，这被公认是最有效的siRNA 结构。
现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi。
以下为一些文献中提出的原则补充，很不错。
General Guidelines1.siRNA targeted sequence is usually 21 nt in length.2.Avoid regions within 50-100 bp of the start codon and thetermination codon3.Avoid intron regions4.Avoid stretches of 4 or more bases such as AAAA, CCCC5.Avoid regions with GC content <30% or > 60%.6.Avoid repeats and low complex sequence7.Avoid single nucleotide polymorphism (SNP) sites8.Perform BLAST homology search to avoid off-target effects onother genes or sequences9.Always design negative controls by scrambling targeted siRNAsequence. The control RNA should have the same length andnucleotide composition as the siRNA but have at least 4-5 basesmismatched to the siRNA. Make sure the scrambling will not create new homology to other genes.Tom Tuschl's rules1.Select targeted region from a given cDNA sequence beginning50-100 nt downstream of start condon2.First search for 23-nt sequence motif AA(N19). If no suitablesequence is found, then,References1.Elbashir SM et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAsmediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature.411:494-498.2.Elbahir SM et al. (2001). Functional anatomy of siRNAs formediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate.EMBO J. 20:6877-6888.3.Elbashir SM et al. (2002). Analysis of gene function in somaticmammalian cells using small interfering RNAs. Methods.26:199-213.4.Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS,Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference. NatBiotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30.5./biotools/oligocalc.html6.Maurice Ho, Rational siRNA DesignRNAi target selection rules:1.Targeted regions on the cDNA sequence of a targeted geneshould be located 50-100 nt downstream of the start codon (ATG).2.Search for sequence motif AA(N19)TT or NA(N21), orNAR(N17)YNN, where N is any nucleotide, R is purine (A, G) and Y is pyrimidine (C, U).3.Avoid targeting introns, since RNAi only works in thecytoplasm and not within the nucleus.4.Avoid sequences with > 50% G+C content.5.Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats.6.Avoid 5URT and 3UTR, although siRNAs targeting UTRs havesuccessfully induced gene inhibition.7.Avoid sequences that share a certain degree of homology withother related or unrelated genes.How to obtain a cDNA sequence for target selectionBefore finding a RNAi target on the gene of your interest, first you have to get its mRNA sequence or sequence accession number as some siRNA design tools can take accession number as input. It is recommended to use the gene's RefSeq from NCBI, since the RefSeq represents non-redundant, curated and validated sequences. RefSeq mRNA sequences have unique accession numbers which start with NM or XM, followed by 6 digits. For example, NM_123456 (curated mRNA sequence) or XM_0123456 (model mRNA sequence predicted by genome sequence analysis). There are several ways of querying RefSeq.1.Search LocusLink by gene name or symbol at/LocusLink/. Once the locus of yourgene is found, scroll down to the "NCBI Reference Sequence(RefSeq)" section and look for mRNA.2.Search Entrez Gene at/entrez/query.fcgi?db=gene, and select the right gene of desired organism. Once the page for the gene is shown, scroll down to the "NCBI Reference Sequence (RefSeq)"and look for mRNA.3.Search Nucleotide database using Entrez query toolat /entrez/query.fcgi?db=Nucleotide and use Entrez Limits settings to restrict your query to the RefSeq database onlyo select "RefSeq" from the "Only from" menu, this restricts the query to the RefSeq collectiono select "mRNA" from the "Molecule" menu, this restricts the query to mRNA RefSeq recordsHomology searchThe RNAi targeted region on the mRNA sequence of a gene should not share significant homology with other genes or sequences in the genome, therefore, homology search is essential to minimizeoff-target effects. Although most siRNA design tools provide BLAST option, some simply use NCBI BLAST tools which sometimes are quite slow. Here are some BLAST tools for homology search.∙NCBI Blast tool: Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) or Search for short, nearly exact matches∙Blat tool on UCSC Genome Website/cgi-bin/hgBlat∙Ensembl Blast /Multi/blastview Examples of RNAi target selectionReferences1. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.2. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001 Jan15;15(2):188-200.。
siRNA设计原则
8条与siRNA功能相关的原则：
1.GC含量30%-52%
2.sense链的15-19碱基中至少含有3个A/U
3.不含有反向重复序列
4.sense链的第19碱基为A
5.sense链的第3碱基为A
6.sense链的第10碱基为U
7.sense链的第19碱基不是G/C
8.sense链的第13碱基不是G
同时满足以下四点的siRNA能够达到较高的基因沉默效果：
1.antisense的5’端为A/U
2.sense的5’端为G/C
3.antisense的5’端的7个碱基中至少有5个A/U
4.siRNA序列中没有连续9个以上的GC片段
分析得到六个与基因沉默功能相关的siRNA序列特点：
1.sense链’5’与3’端的3个碱基中A/U含量不对称。
2.sense链的第1个碱基为G/C
3.sense链的第6个碱基为A
4.sense链的第19个碱基为A/U
5.sense链的第1个碱基不是U
6.sense链的第19个碱基不是G
另外，GC含量在31.6%-57.9%
文中指出，明显有效的siRNA序列需要满足3’端的3个碱基中A/U数量比5’端的3个碱基中A/U数量至少多1个，而且至少满足第2，3，4点中的两点。
SiRNA序列的设计
SiRNA序列的设计RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。
从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。
1.1 siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。
以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。
最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。
运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。
1.2 siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)，NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。
以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。
以AA N19 标准设计的siRNA，在哺乳动物细胞中70%～80%可产生RNAi 作用。
但是一些具有较小脱靶效应的siRNA序列不是以AA为起始的，所以现在不推荐以“AA为起始”作为选择标准之一[6]。
最新研究表明[7,8] ，27 nt或29 nt的siRNA与21 nt siRNA相比：（1）其抑制活性可提高数倍以上；（2）不易于诱导干扰素反应和激活PKR；（3）一些基因对21 nt siRNA不敏感，但是可以被27 nt siRNA有效的抑制；（4）与21 nt SiRNA相比，27 nt SiRNA对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到。
sirna设计原理
sirna设计原理小伙伴们！今天咱们来唠唠siRNA设计原理这个超有趣的事儿。
咱先得知道啥是siRNA。
简单说呢，siRNA就像是细胞里的小特工，专门去对付那些捣乱的基因。
它是一种双链RNA分子，长度不长不短，大概20 - 25个核苷酸左右。
这个长度可很有讲究哦。
你想啊，如果太短了，就像小短腿去追坏人，根本够不着目标；要是太长了呢，又容易拖泥带水，在细胞里施展不开手脚。
那怎么设计出有效的siRNA呢？这就像给小特工定制一套完美的装备。
首先得从基因序列下手。
我们要找的是基因的那些关键部位，就好比是坏人的弱点。
一般来说，要找那些相对特异的区域。
如果选的区域在很多基因上都有类似的，那就糟糕啦，小特工可能就认错目标，开始乱打一气了。
这就好比你要抓小偷，结果抓错成了路人甲，多尴尬呀。
而且哦，在基因序列里，有些地方是比较容易被小特工结合的，就像有些地方是小偷爱出没的角落。
这些地方的核苷酸组成有一定的特点。
比如说，GC含量就很重要。
GC含量不能太高也不能太低。
要是GC含量太高了，就像给小特工设置了一个超级复杂的密码锁，它很难解开然后去和目标结合；要是GC含量太低呢，又像是锁太简单，容易被其他不相干的东西干扰。
通常啊，GC含量在30% - 70%之间是比较理想的范围。
这就像是 Goldilocks原则，不多不少刚刚好。
再说说这个双链结构。
siRNA的双链可不是随随便便就形成的。
两条链之间的互补性要足够好。
这就像两个人跳舞，得配合得默契才行。
如果两条链之间互补性不好，就像跳舞的时候老是踩对方的脚，这个siRNA就不稳定，在细胞里还没发挥作用可能就散架了。
而且两条链的末端结构也有说法。
一般来说，末端要是平端或者有一点突出，就像小特工的武器有不同的造型，不同的末端结构会影响它和细胞里其他分子的相互作用。
另外呢，在设计siRNA的时候，还得考虑细胞环境这个大舞台。
细胞里可是一个超级复杂的世界，有各种各样的分子在跑来跑去。
rnai技术原理
rnai技术原理RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过降低特定基因的表达来调控基因功能的方法。
RNAi技术起源于一种细胞自身的保护机制，该机制通过降解特定的RNA分子来抑制与这些RNA相对应的基因的表达。
该技术可以用来研究和操控基因功能，为研究基因的功能和开发新的治疗方法提供了有力的工具。
RNAi技术的主要原理是通过小分子RNA分子（小干扰RNA，siRNA）的介导，将目标基因的mRNA分解从而抑制该基因的表达。
RNAi技术包括两个主要步骤：siRNA的合成和siRNA与目标基因的结合。
在合成siRNA的过程中，利用特定的酶系统将针对目标基因的RNA序列转录成双链RNA分子。
这些双链RNA分子会被酶切成长度约为20到25个核苷酸的小片段，并形成siRNA。
siRNA与目标基因的结合是通过与目标基因的mRNA序列互补配对而实现的。
一旦siRNA与目标基因的mRNA结合，酶复合物（RISC）会引导靶向基因的mRNA分解，从而阻断该基因的转录和翻译，进而抑制目标基因的表达。
通过引入合成的siRNA到细胞中，可以针对特定基因进行抑制。
然而，由于siRNA是非特异性的，可能会对其他非靶向基因产生副作用。
为了避免这种情况，研究人员通常会设计多个针对同一基因的siRNA序列，并经过筛选确定具有最佳特异性和效果的siRNA。
综上所述，RNAi技术通过利用siRNA与目标基因的mRNA 结合来抑制基因的表达，从而调控基因功能。
这项技术在基因功能研究、药物研发和疾病治疗等领域具有广泛的应用前景。
sirna制剂开发指导原则
以下是针对siRNA制剂开发的一些指导原则：
1. 靶向性：确保siRNA能够准确地靶向到目标基因。这可以通过设计合适的siRNA序列沉默。
2. 有效性：确保siRNA能够有效地抑制目标基因的表达。这可以通过优化siRNA的序列和 化学修饰，以提高siRNA的稳定性和递送效率。
3. 安全性：确保siRNA制剂对人体安全。这包括避免非特异性的副作用和免疫反应，以及 减少对非目标基因的影响。
sirna制剂开发指导原则
4. 递送系统：选择合适的递送系统来将siRNA引导到目标细胞内。递送系统可以是载体、纳 米粒子或其他递送工具，能够保护siRNA免受降解，并促进其进入细胞。
5. 稳定性：确保siRNA在体内具有足够的稳定性，以便能够在适当的时间和地点发挥作用。 这可以通过化学修饰siRNA的末端或链上碱基来增强其稳定性。
6. 适当的剂量：确定适当的siRNA剂量，以实现理想的基因沉默效果，同时避免毒副作用。
7. 临床可行性：考虑siRNA制剂的临床可行性，包括制备工艺的可扩展性、成本效益以及适 用于不同疾病类型的广泛应用性。
sirna制剂开发指导原则
这些指导原则可以帮助研发人员设计和开发具有高效性、安全性和稳定性的siRNA制剂， 以实现基因沉默的治疗效果。然而，siRNA制剂的开发是一个复杂的过程，需要综合考虑多 个因素，并进行充分的实验验证和临床试验。
sirna序列 写法
sirna序列写法
设计siRNA时，应遵循以下原则：
1. 从靶起始密码子下游50~100bp处开始向下游寻找腺嘌呤双核苷酸序列，将此双核苷酸序列和其下游相邻19个核苷酸作为siRNA序列设计模板。
5'和3'非编码区和起始密码子附近区域应尽量避免，因为这些区域是调节蛋白的结合位点，或翻译起始复合物结合区域，它们可能对RISC复合物的形成
造成干扰，而削弱RNAi的作用。
2. siRNA的G和C碱基含量最好在50%左右（30%~70%），尽量避免GGG的出现，以影响siRNA的解链，降低RNAi的效应。
3. 在EST和NCBI数据库使用Blast程序查找所设计的靶基因是唯一的。
设计完siRNA后，可以通过网站进行查询，例如赛默飞公司的siRNA设计网页（Invitrogen Block-iT RNAi Designer）或者sigma网站用于初步查
询拟设计siRNA的核苷酸序列。
以上内容仅供参考，如需了解更多信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。
siRNA 使用说明(两篇)
引言概述：siRNA（小干扰RNA）是一种小分子RNA片段，具有靶向特异性和高效沉默靶基因的能力。
本文将详细介绍siRNA的使用说明，主要包括siRNA的设计、转染方法、转染效率的评估、靶基因沉默效果的验证以及操作注意事项。
通过本文的阐述，用户能够更好地了解和掌握siRNA的使用方法，从而实现对目标基因表达的特异沉默。
正文内容：一、siRNA的设计1.确定靶基因：首先需要明确自己要沉默的目标基因，可以通过文献调研、数据库查询等方式确定目标基因。
2.设计siRNA序列：根据目标基因的序列信息，可以使用在线工具或者软件进行siRNA序列的设计。
siRNA的设计需要满足一定的规则，如目标序列的选择、GC含量、二次结构等方面的考虑。
二、siRNA的转染方法1.载体选择：siRNA可以通过多种载体转染到细胞内，如质粒转染、病毒载体转染等。
根据实验需要和细胞特性，选择适合的转染载体。
2.转染试剂：根据实验需要，选择适合的转染试剂，如化学转染试剂、电穿孔法等。
3.转染条件优化：对于每个细胞系和siRNA，转染条件需要进行优化，包括转染试剂浓度、转染时间、细胞密度等。
三、siRNA转染效率的评估1.转染效率的检测：可以通过荧光探针标记siRNA，利用荧光显微镜观察转染效率。
2.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，来评估siRNA的沉默效果。
3.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来评估siRNA的沉默效果。
四、靶基因沉默效果的验证1.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，可以验证siRNA的沉默效果。
2.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来验证siRNA的沉默效果。
3.功能实验：通过观察细胞的表型变化、增殖能力的变化等方面，来验证siRNA的沉默效果。
五、操作注意事项1.siRNA的保存：应在20°C下保存，避免反复冻融。
2.转染前的细胞处理：细胞的状态和密度对转染效率有影响，应注意细胞的处理方法和细胞密度的选择。
(完整版)siRNA设计原则
量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA序列的设计方面进行更多的改进。
本文将在以下几个方面探讨siRNA序列设计方面的最新研究进展，作为应用RNAi技术时的参考。
RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。
从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。
1.siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。
以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。
最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。
运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。
2. siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)，NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。
以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。
RNAi片段siRNA设计原则
RNAi片段siRNA设计原则RNAi target selection rules:1.Targeted regions on the cDNA sequence of a targeted gene should be located 50-100 nt downstream of the start codon (ATG).2.Search for sequence motif AA(N19)TT or NA(N21), or NAR(N17)YNN, where N isany nucleotide, R is purine (A, G) and Y is pyrimidine (C, U).3.Avoid targeting introns, since RNAi only works in the cytoplasm and not within the nucleus.4.Avoid sequences with > 50% G+C content.5.Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats.6.Avoid 5URT and 3UTR, although siRNAs targeting UTRs have successfully induced gene inhibition.7.Avoid sequences that share a certain degree of homology with other related or unrelated genes.How to obtain a cDNA sequence for target selectionBefore finding a RNAi target on the gene of your interest, first you have to get its mRN A sequence or sequence accession number as some siRNA design tools can take accessionnumber as input. It is recommended to use the gene's RefSeq from NCBI, since the Ref Seq represents non-redundant, curated and validated sequences. RefSeq mRNA sequences h ave unique accession numbers which start with NM or XM, followed by 6 digits. For exa mple, NM_123456 (curated mRNA sequence) or XM_0123456 (model mRNA sequence pr edicted by genome sequence analysis). There are several ways of querying RefSeq.1.Search LocusLink by gene name or symbol at /LocusLink/. Once the locus of your gene is found, scroll down to the "NCBI Reference Sequen ce (RefSeq)" section and look for mRNA.2.Search Entrez Gene at /entrez/query.fcgi?db=gene, and select the right gene of desired organism. Once the page for the gene is shown, scroll d own to the "NCBI Reference Sequence (RefSeq)" and look for mRNA.3.Search Nucleotide database using Entrez query tool at /entrez/query.fcgi?db=Nucleotide and use Entrez Limits settings to restrict your query to t he RefSeq database onlyo select "RefSeq" from the "Only from" menu, this restricts the query to the RefSeq collectiono select "mRNA" from the "Molecule" menu, this restricts the query to mR NA RefSeq recordsHomology searchThe RNAi targeted region on the mRNA sequence of a gene should not share significant homology with other genes or sequences in the genome, therefore, homology search is ess ential to minimize off-target effects. Although most siRNA design tools provide BLAST o ption, some simply use NCBI BLAST tools which sometimes are quite slow. Here are so me BLAST tools for homology search.∙NCBI Blast tool: Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) or Search for short, nearly exact matches∙Blat tool on UCSC Genome Website /cgi-bin/hgBlat∙Ensembl Blast /Multi/blastviewExamples of RNAi target selectionReferences1. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucl eotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411 (6836):494-8.2. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleoti de RNAs. Genes Dev. 2001 Jan 15;15(2):188-200.更多信息:siRNA Design Guidelines (Ambion) - Using siRNA for gene silencing is a rapid ly evolving tool in molecular biology. There are several methods for preparing siRNA, s uch as chemical synthesis, in vitro transcription, siRNA expression vectors, and PCR ex pression cassettes. Irrespective of which method one uses, the first step in designing a s iRNA is to choose the siRNA target site. This guidelines for choosing siRNA target site s are based on both the current literature, and on empirical observations by scientists at Ambion. Using these guidelines, approximately half of all siRNAs yield>50% reduction in target mRNA levels.siRNA Design Rules (Protocol Online) - General siRNA design rules and rational siRNA design.相似一篇General Guidelines1.siRNA targeted sequence is usually 21 nt in length.2.Avoid regions within 50-100 bp of the start codon and the termination codon3.Avoid intron regions4.Avoid stretches of 4 or more bases such as AAAA, CCCC5.Avoid regions with GC content <30% or > 60%.6.Avoid repeats and low complex sequence7.Avoid single nucleotide polymorphism (SNP) sites8.Perform BLAST homology search to avoid off-target effects on other genes or sequences9.Always design negative controls by scrambling targeted siRNA sequence. The control RNA should have the same length and nucleotide composition as the siRNA but have at least 4-5 bases mismatched to the siRNA. Make sure the scrambling will not createnew homology to other genes.Tom Tuschl's rules1.Select targeted region from a given cDNA sequence beginning 50-100 nt downstream of start condon2.First search for 23-nt sequence motif AA(N19). If no suitable sequence is found, then,3.Search for 23-nt sequence motif NA(N21) and convert the 3' end of the sense siRNA to TT4.Or search for NAR(N17)YNN5.Target sequence should have a GC content of around 50%A = Adenine; T = Thymine; R = Adenine or Guanine (Purines); Y = Thymine or Cytosi ne (Pyrimidines); N = Any.Rational siRNA designBy experimentally analyzing the silencing efficiency of 180 siRNAs targeting the mRNA of two genes and correlating it with various sequence features of individual siRNAs, Reyn olds et al at Dharmacon, Inc identified eight characteristics associated with siRNA functio nality. These characteristics are used by rational siRNA design algorithm to evaluate poten tial targeted sequences and assign scores to them. Sequences with higher scores will have higher chance of success in RNAi. The table below lists the 8 criteria and the methods o f score assignment.A sum score of 6 defines the cutoff for selecting siRNAs. All siRNAs scoring higher tha n 6 are acceptable candidates.*Tm = 79.8 + 18.5*log10([Na+]) + (58.4 * GC%/100) + (11.8 * (GC%/100)2) - (820/Leng th)For example, the Tm can be calculated as follows for the siRNA UUCUCCAGCUUCUA AAAUATm = 79.8 + 18.5*log10(0.05) + (58.4 * 31.6/100) + (11.8 * (31.6/100)2) - (820/19)Tm = 32.19There are two siRNA design tools which implement this siRNA design algorithm: one is offered by Dharmacon, Inc; the other is a downloadable Excel template, written by Mauric e Ho at t.hk/RNAi/siRNA.References1.Elbashir SM et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411:494-498.2.Elbahir SM et al. (2001). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J. 20:6877-6888.3.Elbashir SM et al. (2002). Analysis of gene function in somatic mammalian cellsusing small interfering RNAs. Methods. 26:199-213.4.Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS, Khvorova A. RationalsiRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30.5./biotools/oligocalc.html6.Maurice Ho, Rational siRNA Design。
sirna序列设计原则
sirna序列设计原则引言：小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）是一种能够靶向特定基因进行沉默的小分子RNA，因其具有高度选择性和特异性，被广泛应用于基因沉默、基因功能研究和药物研发等领域。
siRNA序列的设计是siRNA研究的重要环节，合理设计的siRNA序列能够提高siRNA的稳定性和特异性，从而提高基因沉默效率。
本文将介绍siRNA序列设计的原则和方法。
一、选择靶点：siRNA的靶点应位于目标基因的mRNA序列上，通常选择在启动子区域和编码区域附近的区域。
在选择靶点时，应避免选择过于保守的区域，以免导致非特异性沉默。
二、序列长度：siRNA的长度通常为19-25个核苷酸，其中双链部分为19个核苷酸。
较短的siRNA序列易于合成和转染，较长的siRNA序列具有更好的特异性和稳定性。
三、序列设计：1. 避免GC含量过高或过低：siRNA序列的GC含量应在30-50%之间，过高或过低的GC含量可能影响siRNA的稳定性和特异性。
2. 避免重复序列：siRNA序列中应避免出现重复序列，以免产生非特异性沉默效应。
3. 避免启动子区域和剪切位点：siRNA序列的设计应避免位于启动子区域和剪切位点，以免对基因表达和剪切产生不良影响。
4. 避免稳定性差的序列：siRNA序列中应避免出现易于形成稳定二级结构的序列，以免影响siRNA的转染和沉默效率。
5. 避免T尾：siRNA序列的设计应避免在3'端以T结尾，以免被细胞内核酸酶识别并降解。
四、特异性验证：在设计siRNA序列后，应进行特异性验证以确保siRNA能够靶向特定基因进行沉默。
常用的验证方法包括荧光素酶报告基因实验、实时荧光定量PCR等。
五、合成和转染：siRNA序列的合成通常采用化学合成方法，合成的siRNA应具有较高的纯度和纯性。
转染时，siRNA应与转染试剂或载体进行复合，以提高siRNA的转染效率和沉默效率。
（完整版）siRNA设计原则
（完整版）siRNA设计原则量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA序列的设计方面进行更多的改进。
本文将在以下几个方面探讨siRNA序列设计方面的最新研究进展，作为应用RNAi技术时的参考。
RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。
从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。
1.siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。
以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA 序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。
最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。
运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。
2. siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)，NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。
以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。
rnai实验步骤
rnai实验步骤介绍RNA干扰（RNA interference，简称rnai）是一种通过特定的RNA分子介导靶向mRNA降解或靶向基因沉默的生物学过程。
这个技术已经成为研究基因功能和治疗疾病的重要工具。
本文将详细介绍rnai实验的步骤，包括试验前的准备工作，材料和方法，实验操作过程以及结果分析等方面。
试验前准备设计RNAsiRNA序列在进行rnai实验之前，我们需要设计合适的RNAsiRNA序列，这些序列将会与目标基因的mRNA相结合并导致其沉默。
为了设计合适的siRNA序列，需要考虑以下几个因素： - 目标基因的序列和结构：需要选择与目标基因序列特异性互补的siRNA序列。
- siRNA序列的长度：一般选择长度为21-23个核苷酸的siRNA序列。
- siRNA序列的化学修饰：可以通过在siRNA序列的两端引入稳定性修饰，如2’-O-甲基化或磷酸二酯（2’-O-Me和PS），来增加siRNA的稳定性和效果。
合成siRNA在设计好siRNA序列后，需要将其合成。
siRNA可以通过化学合成方法或体外转录法合成。
一般来说，我们可以选择商业提供的siRNA合成服务，也可以自行合成。
细胞培养在进行rnai实验之前，我们需要培养细胞并将其分配到培养皿或板上。
常用的细胞系包括HEK293细胞和HeLa细胞等。
细胞应该在适当的培养基中培养，并保持在合适的温度和气体条件下。
材料与方法实验材料•培养皿或板：用于细胞培养和实验操作。
•细胞系：适合您研究的细胞系。
•培养基：适合细胞系的培养基，如DMEM或MEM等。
•转染试剂：用于将siRNA转染到细胞内，例如RNAiMAX。
•siRNA：化学合成或体外转录合成的siRNA。
•对照组：使用非特异性siRNA或未转染的细胞作为对照组。
细胞培养1.将培养基加热到37°C，使其达到适宜的温度。
2.将培养基倒入培养皿或板中，使其均匀覆盖整个表面。
3.使用吸管将细胞悬液加入培养皿或板中，使细胞悬浮于培养基中。
如何在线设计siRNA？
如何在线设计siRNA？今天我们来学学siRNA的设计1. siRNA原理siRNA为small interfering RNA的缩写，siRNA与靶向特异性的mRNA结合，通过RNA介导的沉默复合体RISC（RNA-induce siliencing complex）介导mRNA的降解。
siRNA长度一般为21-23nt，被RISC识别结合之后，siRNA发生解旋。
然后RISC在siRNA 的反义链指导下，寻找具有同源序列的内源性的mRNA，并在距离5’端10-11位剪辑之间切割mRNA，从而导致转录后基因沉默。
siRNA的原理如下：也可以来看一看RNAi的视频介绍：2. siRNA设计原则RNAi发挥作用的核心在于siRNA的序列结构，因此不同的siRNA 导致的沉默效果差异非常巨大。
影响siRNA功能因素主要包括siRNA 序列结构特点、靶向mRNA的空间结构、RISC与siRNA的相互作用、以及siRNA与mRNA错配。
目前siRNA设计的原则有两种方式：(1) 统计不同siRNA对靶序列抑制程度得到siRNA设计原则。
这个原则就是统计目前已有的siRNA序列，根据序列特点和序列沉默效果分析得到。
a. GC含量在30%-52%b. 有义链15-19位至少有3个A或者Uc. 避免出现倒置重复，以防形成发卡结构d. 有义链的第3位核苷酸为Ae. 有义链的第10位核苷酸为Uf. 有义链的第19位核苷酸为Ag. 有义链的第19位核苷酸不能为G或Ch. 有义链的第13位核苷酸不能为G(2) 以siRNA序列上的能量为依据，筛选有效序列。
a. 总的siRNA双联能量<>b. 反义链5'端的结合能<>c. 有义链的5'端结合能在5-9e. GC含量在36%-53%f. 中间7-12位的结合能<>g. 反义链5’端与正义链5'端的能量差最好在-1~03. siRNA设计步骤首先选择一个靶基因的目的片段位置，并显示出代表性的siRNA 序列；其次从候选的siRNA中排除含有SNP位点的和位于非开放阅读框架的片段；接下来去除一些不利siRNA序列，如简并碱基、毒性结构域、重复序列、高GC/低GC序列；然后从热烈学、高级结构等打分，列出从高到低的序列；随后将siRNA片段进行Blast分析，去除非特异结合的序列；最后预设计几条siRNA序列4. siRNA在线设计网址siRNA有很多在线设计工具。
RNAi片段siRNA设计原则
RNAi片段siRNA设计原则RNAi 目标序列的选取原则应遵循以下几个方面的原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
有研究结果显示GC 含量在45%-55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更为有效。
Tuschl 等建议在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA 的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使用BLAST(3)选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
(4)一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNA，平行实验以期提高成功率。
据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。
(5) siRNA的反义链3’端最好以UU结尾，这被公认是最有效的siRNA 结构。
现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi。
以下为一些文献中提出的原则补充，很不错。
General Guidelines1.siRNA targeted sequence is usually 21 nt in length.2.Avoid regions within 50-100 bp of the start codon and thetermination codon3.Avoid intron regions4.Avoid stretches of 4 or more bases such as AAAA, CCCC5.Avoid regions with GC content <30% or > 60%.6.Avoid repeats and low complex sequence7.Avoid single nucleotide polymorphism (SNP) sites8.Perform BLAST homology search to avoid off-target effects onother genes or sequences9.Always design negative controls by scrambling targeted siRNAsequence. The control RNA should have the same length andnucleotide composition as the siRNA but have at least 4-5 basesmismatched to the siRNA. Make sure the scrambling will not create new homology to other genes.Tom Tuschl's rules1.Select targeted region from a given cDNA sequence beginning50-100 nt downstream of start condon2.First search for 23-nt sequence motif AA(N19). If no suitablesequence is found, then,3.Search for 23-nt sequence motif NA(N21) and convert the 3' endof the sense siRNA to TT4.Or search for NAR(N17)YNN5.Target sequence should have a GC content of around 50%A = Adenine; T = Thymine; R = Adenine or Guanine (Purines); Y =A sum score of 6 defines the cutoff for selecting siRNAs. All siRNAs scoring higher than 6 are acceptable candidates.*Tm = 79.8 + 18.5*log10([Na+]) + (58.4 * GC%/100) + (11.8 * (GC%/100)2) - (820/Length)For example, the Tm can be calculated as follows for the siRNA UUCUCCAGCUUCUAAAAUATm = 79.8 + 18.5*log10(0.05) + (58.4 * 31.6/100) + (11.8 * (31.6/100)2) - (820/19)Tm = 32.19There are two siRNA design tools which implement this siRNA design algorithm: one is offered by Dharmacon, Inc; the other is a downloadable Excel template, written by Maurice Ho att.hk/RNAi/siRNA.References1.Elbashir SM et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAsmediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature.411:494-498.2.Elbahir SM et al. (2001). Functional anatomy of siRNAs formediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate.EMBO J. 20:6877-6888.3.Elbashir SM et al. (2002). Analysis of gene function in somaticmammalian cells using small interfering RNAs. Methods.26:199-213.4.Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS,Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference. NatBiotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30.5./biotools/oligocalc.html6.Maurice Ho, Rational siRNA DesignRNAi target selection rules:1.Targeted regions on the cDNA sequence of a targeted geneshould be located 50-100 nt downstream of the start codon (ATG).2.Search for sequence motif AA(N19)TT or NA(N21), orNAR(N17)YNN, where N is any nucleotide, R is purine (A, G) and Y is pyrimidine (C, U).3.Avoid targeting introns, since RNAi only works in thecytoplasm and not within the nucleus.4.Avoid sequences with > 50% G+C content.5.Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats.6.Avoid 5URT and 3UTR, although siRNAs targeting UTRs havesuccessfully induced gene inhibition.7.Avoid sequences that share a certain degree of homology withother related or unrelated genes.How to obtain a cDNA sequence for target selectionBefore finding a RNAi target on the gene of your interest, first you have to get its mRNA sequence or sequence accession number as some siRNA design tools can take accession number as input. It is recommended to use the gene's RefSeq from NCBI, since the RefSeq represents non-redundant, curated and validated sequences. RefSeq mRNA sequences have unique accession numbers which start with NM or XM, followed by 6 digits. For example, NM_123456 (curated mRNA sequence) or XM_0123456 (model mRNA sequence predicted by genome sequence analysis). There are several ways of querying RefSeq.1.Search LocusLink by gene name or symbol at/LocusLink/. Once the locus of yourgene is found, scroll down to the "NCBI Reference Sequence(RefSeq)" section and look for mRNA.2.Search Entrez Gene at/entrez/query.fcgi?db=gene, and select the right gene of desired organism. Once the page for the gene is shown, scroll down to the "NCBI Reference Sequence (RefSeq)"and look for mRNA.3.Search Nucleotide database using Entrez query toolat /entrez/query.fcgi?db=Nucleotide and use Entrez Limits settings to restrict your query to the RefSeq database onlyo select "RefSeq" from the "Only from" menu, this restricts the query to the RefSeq collectiono select "mRNA" from the "Molecule" menu, this restricts the query to mRNA RefSeq recordsHomology searchThe RNAi targeted region on the mRNA sequence of a gene should not share significant homology with other genes or sequences in the genome, therefore, homology search is essential to minimizeoff-target effects. Although most siRNA design tools provide BLAST option, some simply use NCBI BLAST tools which sometimes are quite slow. Here are some BLAST tools for homology search.•NCBI Blast tool: Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) or Search for short, nearly exact matches•Blat tool on UCSC Genome Website/cgi-bin/hgBlat•Ensembl Blast /Multi/blastview Examples of RNAi target selectionReferences1. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.2. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001 Jan15;15(2):188-200.。
RNAi siRNA shRNA 设计
大量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi 技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA序列的设计方面进行更多的改进。
本文将在以下几个方面探讨siRNA序列设计方面的最新研究进展，作为应用RNAi技术时的参考。
1 SiRNA序列的设计RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。
从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。
1.1 siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。
以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。
最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA 理想的靶点。
运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。
1.2 siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)， NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。
以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。
rnai技术原理
rnai技术原理RNAi技术原理RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种特殊的基因沉默机制，通过抑制特定基因的表达来调控生物体的基因功能。
该技术可以精确地靶向特定基因，并通过转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing）的方式来抑制其表达。
RNAi技术的应用广泛，不仅在基础生物学研究中发挥重要作用，还有很大的潜力用于疾病治疗和农业生产。
RNA干扰的原理可以简单概括为以下几个步骤：转录、切割、降解和沉默。
在RNAi技术中，特定基因被转录成mRNA（信使RNA），这是基因表达的中间产物。
然后，由一个特殊的酶称为Dicer切割mRNA，将其分割成短小的双链RNA片段，称为小干扰RNA（small interfering RNA，简称siRNA）。
每个siRNA片段都由21-25个碱基对组成，其中一条链被选择性地保留，成为导引链（guide strand），而另一条链则被丢弃。
接下来，导引链与一个复合物结合，称为RNA-诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，简称RISC）。
RISC由多种蛋白质组成，其中最重要的是Argonaute蛋白。
RISC通过与导引链的碱基序列互补配对，将其靶向特定的mRNA分子。
一旦导引链与特定的mRNA配对，RISC中的蛋白质就会通过特定的酶活性将目标mRNA分解成小片段，从而阻断了该基因的表达。
这个过程称为降解。
被降解的mRNA片段不再能被翻译成蛋白质，从而达到了基因沉默的效果。
被RNAi技术抑制的基因可以在细胞水平或整个生物体内产生各种效应。
在细胞水平，RNAi技术可以通过抑制特定基因的表达，调节细胞的生理过程，影响细胞的增殖、分化和凋亡等。
在整个生物体内，RNAi技术可以用来研究基因功能、鉴定新的药物靶点，并有潜力用于治疗各种疾病，如癌症、心血管疾病和传染病等。
此外，RNAi技术还可以应用于农业领域，用于改良作物的抗病性和产量。
siRNA设计原则
量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA序列的设计方面进行更多的改进。
本文将在以下几个方面探讨siRNA序列设计方面的最新研究进展，作为应用RNAi技术时的参考。
RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。
从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。
1.siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。
以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。
最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。
运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。
2. siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)，NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。
以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。
SiRNA与RNAi试验技术手册
目前 RNAi 的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双 链 RNA 可来自于 RNA 病毒感染、转座子的转录产物、外源导入的基因。这些来源的双链 RNA 诱发了细胞内的 RNAi 机制，结果是病毒被清除、转座子的表达被阻断、外源导入基因表达 被阻断，同时与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
一、什么是 siRNA 和 RNAi？
双链 RNA 经酶切后会形成很多小片段，称为 siRNA，这些小片段一旦与信使 RNA(mRNA) 中的同源序列互补结合，会导致 mRNA 失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉 默”了，双链 RNA 对基因表达的阻断作用就被称为 RNA 干预（RNA interference, RNAimail:master@
网址：
（技术部整理编辑）
B、在 RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合 物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活 RISC 需要一个 ATP 依赖的将小分子
RNA 解双链的过程。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上，并在距离 siRNA3’ 端 12 个碱基的位置切割 mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个 RISC 都包含一个 siRNA 和一个不同于 Dicer 的 RNA 酶。
另外，还有研究证明含有启动子区的 dsRNA 在植物体内同样被切割成 21-23nt 长的片段, 这种 dsRNA 可使内源相应的 DNA 序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.
Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对 5'和 3'端的非编码区（untranslated regions， UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复 合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。 (2)、将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那 些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用/BLAST/）。 (3)、选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最 有效的siRNA序列。 3、阴性对照
sirna的研发流程-概述说明以及解释
sirna的研发流程-概述说明以及解释1.引言1.1 概述siRNA（小干扰RNA）是一种小分子RNA分子，可以通过特定的机制干扰靶向基因的表达。
它的发现引起了生物医学领域的广泛兴趣，并被认为是一种潜在的基因治疗工具。
siRNA研发流程是指通过一系列的实验和分析，寻找并设计出具有高效靶向特异性和生物活性的siRNA分子的过程。
在siRNA研发流程中，研究人员首先需要确定目标基因，即希望通过干扰其表达来达到治疗或研究目的的基因。
然后，他们会使用计算方法和实验证据来设计符合一定准则的siRNA分子。
这些准则包括具有特异性的核苷酸序列、稳定性和生物活性等方面的要求。
接下来，在合成和制备阶段，siRNA分子会通过化学合成或基因工程技术来制备。
这一步骤要求高纯度的siRNA产物，并确保其质量符合要求。
此外，可以使用化学修饰或封血清转染等方法来改善siRNA的稳定性和递送效率。
在合成和制备阶段完成后，siRNA分子将进入体外和体内评估阶段。
这些评估会涉及到诸如靶向特异性、RNA干扰效率和细胞毒性等方面的实验。
通过这些评估，研究人员可以确定哪些siRNA分子具有较好的生物活性和特异性。
最后，研究人员会通过进一步的实验和分析，确定最优siRNA分子并进行进一步的研究或应用。
这些实验可以包括体内动物实验和临床前研究等。
总之，siRNA研发流程是一个复杂而系统的过程，需要通过一系列的实验和分析来确定最佳的siRNA分子。
通过这个流程，研究人员可以为基因治疗和疾病研究提供强有力的工具，为未来的siRNA研究和应用铺平道路。
文章结构部分是对整篇文章的框架进行说明，让读者可以清晰地了解文章的分章节和论述顺序。
在本篇文章中，主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分（1.引言）主要包括概述、文章结构和目的三个小节。
在概述部分（1.1 概述）可对siRNA的研发进行简要介绍，指出该领域的重要性和研究的现状。
文章结构部分（1.2 文章结构）即本部分，用于说明整篇文章的组织结构，阐明各个章节的内容和顺序，以引导读者阅读。
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RNAi片段siRNA设计原则RNAi 目标序列的选取原则应遵循以下几个方面的原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
有研究结果显示GC 含量在45%-55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更为有效。
Tuschl 等建议在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA 的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使用BLAST(3)选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
(4)一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNA，平行实验以期提高成功率。
据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。
(5) siRNA的反义链3’端最好以UU结尾，这被公认是最有效的siRNA 结构。
现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi。
以下为一些文献中提出的原则补充，很不错。
General Guidelines1.siRNA targeted sequence is usually 21 nt in length.2.Avoid regions within 50-100 bp of the start codon and thetermination codon3.Avoid intron regions4.Avoid stretches of 4 or more bases such as AAAA, CCCC5.Avoid regions with GC content <30% or > 60%.6.Avoid repeats and low complex sequence7.Avoid single nucleotide polymorphism (SNP) sites8.Perform BLAST homology search to avoid off-target effects onother genes or sequences9.Always design negative controls by scrambling targeted siRNAsequence. The control RNA should have the same length andnucleotide composition as the siRNA but have at least 4-5 basesmismatched to the siRNA. Make sure the scrambling will not create new homology to other genes.Tom Tuschl's rules1.Select targeted region from a given cDNA sequence beginning50-100 nt downstream of start condon2.First search for 23-nt sequence motif AA(N19). If no suitablesequence is found, then,3.Search for 23-nt sequence motif NA(N21) and convert the 3' endof the sense siRNA to TT4.Or search for NAR(N17)YNN5.Target sequence should have a GC content of around 50%A = Adenine; T = Thymine; R = Adenine or Guanine (Purines); Y =A sum score of 6 defines the cutoff for selecting siRNAs. All siRNAs scoring higher than 6 are acceptable candidates.*Tm = 79.8 + 18.5*log10([Na+]) + (58.4 * GC%/100) + (11.8 * (GC%/100)2) - (820/Length)For example, the Tm can be calculated as follows for the siRNA UUCUCCAGCUUCUAAAAUATm = 79.8 + 18.5*log10(0.05) + (58.4 * 31.6/100) + (11.8 * (31.6/100)2) - (820/19)Tm = 32.19There are two siRNA design tools which implement this siRNA design algorithm: one is offered by Dharmacon, Inc; the other is a downloadable Excel template, written by Maurice Ho att.hk/RNAi/siRNA.References1.Elbashir SM et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAsmediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature.411:494-498.2.Elbahir SM et al. (2001). Functional anatomy of siRNAs formediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate.EMBO J. 20:6877-6888.3.Elbashir SM et al. (2002). Analysis of gene function in somaticmammalian cells using small interfering RNAs. Methods.26:199-213.4.Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS,Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference. NatBiotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30.5./biotools/oligocalc.html6.Maurice Ho, Rational siRNA DesignRNAi target selection rules:1.Targeted regions on the cDNA sequence of a targeted geneshould be located 50-100 nt downstream of the start codon (ATG).2.Search for sequence motif AA(N19)TT or NA(N21), orNAR(N17)YNN, where N is any nucleotide, R is purine (A, G) and Y is pyrimidine (C, U).3.Avoid targeting introns, since RNAi only works in thecytoplasm and not within the nucleus.4.Avoid sequences with > 50% G+C content.5.Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats.6.Avoid 5URT and 3UTR, although siRNAs targeting UTRs havesuccessfully induced gene inhibition.7.Avoid sequences that share a certain degree of homology withother related or unrelated genes.How to obtain a cDNA sequence for target selectionBefore finding a RNAi target on the gene of your interest, first you have to get its mRNA sequence or sequence accession number as some siRNA design tools can take accession number as input. It is recommended to use the gene's RefSeq from NCBI, since the RefSeq represents non-redundant, curated and validated sequences. RefSeq mRNA sequences have unique accession numbers which start with NM or XM, followed by 6 digits. For example, NM_123456 (curated mRNA sequence) or XM_0123456 (model mRNA sequence predicted by genome sequence analysis). There are several ways of querying RefSeq.1.Search LocusLink by gene name or symbol at/LocusLink/. Once the locus of yourgene is found, scroll down to the "NCBI Reference Sequence(RefSeq)" section and look for mRNA.2.Search Entrez Gene at/entrez/query.fcgi?db=gene, and select the right gene of desired organism. Once the page for the gene is shown, scroll down to the "NCBI Reference Sequence (RefSeq)"and look for mRNA.3.Search Nucleotide database using Entrez query toolat /entrez/query.fcgi?db=Nucleotide and use Entrez Limits settings to restrict your query to the RefSeq database onlyo select "RefSeq" from the "Only from" menu, this restricts the query to the RefSeq collectiono select "mRNA" from the "Molecule" menu, this restricts the query to mRNA RefSeq recordsHomology searchThe RNAi targeted region on the mRNA sequence of a gene should not share significant homology with other genes or sequences in the genome, therefore, homology search is essential to minimizeoff-target effects. Although most siRNA design tools provide BLAST option, some simply use NCBI BLAST tools which sometimes are quite slow. Here are some BLAST tools for homology search.•NCBI Blast tool: Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) or Search for short, nearly exact matches•Blat tool on UCSC Genome Website/cgi-bin/hgBlat•Ensembl Blast /Multi/blastview Examples of RNAi target selectionReferences1. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.2. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001 Jan15;15(2):188-200.。