第四章 人工染色体载体
第四章 人工染色体载体
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆
大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装
人工染色体克隆载体
人工染色体克隆载体：是一种“穿梭”载体，含有质立载体所必备的第一受体内原质立复制起始位点，还含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列，以及合速的选择标记基因。
固体发酵：某些微生物升长需水很上少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。
蛋白质工程：基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰改造拼接以生产能满足人类需要的新型蛋白质技术。
DNA疫苗：是利用可隆于载体上的抗原基因直接注射机体，被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。
人工种子：它是一种含有植物胚状体或芽营养成分激素以及其他成分的人工胶囊。
发酵工程：利用微生物生长速度快生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，再合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某中特定功能生产出人类所需的产品。
生物传感器：是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具。
载体：把能够承载外源基因，并将其带人受体细胞得以稳定维持的DNA分子。
胚胎移植：是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。
基因治疗：是利用遗传学的原理治疗人类的疾病。
细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并染色体等遗传物质重组的过程。
花药培养：经过适当的诱导，花粉囊中的花粉可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终生产花粉植株。
原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
固定化酶：指经物理或化学的方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受限制,而又能发挥催化作用的酶制剂.基因克隆；是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。
⊙生物技术有基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程基因工程包括目的基因分离与可隆载体重组转人受体细胞筛选和鉴定可隆子。
基因工程载体人工染色体载体
I
A
A
GTCACGTG
II 78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
基因工程载体人工染色体载体
（2）端粒（TEL） 两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
基因工程载体人工染色体载体
• T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所 以 将 致 瘤 基 因 全 部 缺 失 即 卸 甲 (disarmed) 后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB 至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
• Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的， 毒 性 基 因 可 以 顺 式 及 反 式 两 种 方 式 控 制 TDNA转移。
基因工程载体人工染色体载体
Triparental mating
• An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in trans
• The E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vector
基因工程载体人工染色体载体
基因工程载体人工染色体载体
Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.
酵母人工染色体载体
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι切 开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段DNA在 该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母 细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到子细胞中去， 达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA的转载导致抑制 基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落，而载体 自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝粒 正常功能的所有顺式调控信息，可保 证YAC在酵母细胞分裂时向两极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重组， 且能够稳定地复制；
7.HIS3顺序。
酵母人工染色体载体的构建：
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基因 序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒就是 YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
优缺点
概念
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome,YAC) 是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，是最早 构建成功的人工染色体载体，其工作环境也是在酿酒酵 母中。
酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长代时为90min， 含16条染色体，其大小为225~1900kb，总计有14×106bp。
1.YAC载体在酵母中复制的必需元件包括：
4.人工染色体载体
38
YAC具有自主复制
序列、克隆位点以及可在
细菌和酵母菌中选择的标 记基因。此外，YAC还具
pYAC4
EcoRI CEN4
URA3
有酵母菌染色体的一些特
点。可以接受100-1000kb 的外源DNA片段。
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写而成的，其原意是
指带cos位点的质粒。
2014-3-22
l fragment
10
考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。
pHC79
cos序列是l噬菌体DNA
ori
6400 bp
中将DNA包装到噬菌体 颗粒中所需的DNA序列。
配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色
体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体 载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然 染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
细菌人造染色体（BAC）
酵母人造染色体（YAC）
37
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第二节 酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
基因工程载体人工染色体载体
（4）克隆位点
位于 SUP4 基因内部。
插入失活选择：
SUP4酶失活的酵 母菌落呈红色； 不失活的菌落是白 色。
14
基因工程载体人工染色体载体
基因工程载体人工染色体载体
基因工程载体人工染色体载体
2、细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）
基因工程载体人工染色体载体
细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）
◆ BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的 一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb 的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构 成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA 片段。 ◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常 仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子， 在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本 身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克 隆位点。
基因工程载体人工染色体载体
1、酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC)
基因工程载体人工染色体载体
酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）
◆酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。 具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌 和酵母菌中选择的标记基因。 ◆ YAC可以接受100-1000 kb的外源DNA片段， 这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位 克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人 类人工染色体(human artificial chromosome， HAC)的研究。
I
A
A
GTCACGTG
II 78-86bp
第四章 人工染色体载体
第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
第四章 人工染色体载体
P1噬菌体载体
P1噬菌体DNA多联体与包装的关系
三、P1人工染色体载体
➢ PAC系由pAd10sacBⅡ 衍化而来，除去了腺病毒(adenovirus) 的填充片段，插入了基于pUC质粒的序列
F质粒
➢ Cavalli-Sforza(1950)和Hayes（1952） ➢ 大肠杆菌(E.coli)接合交配期染色体标记的单向转移 ➢ 大小约100kb，编码60多种参与复制、分配和接合过程的
蛋白质
➢ 可以整合到宿主染色体中，在大肠杆菌 ➢ 染色体中有30多个位点进行随机整合(random intergration)
3.大小：一般5 kb左右，可克隆38～47 kb片段 包括噬菌体（38～52 kb）
N=ln(1-p)/ln(1-f)
哺乳动物 3x入片段占总 DNA的比值
N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109) 用噬菌体颗粒感染recA+ E.coli（pUC18∷探针） ④ 发生重组 ⑤ 再次包装 ⑥ 再次感染，宿主为recA- E.coli(ampr, kanr)pWE15四、黏粒的扩增和贮存1. 滤膜影印
25%甘油 TB平板， -70 C
cosN：来自 phage，可 被 phage 的 terminase特异切割
LoxP：类似 phage 的 cosN，来自P1 phage，其Cre蛋白 特异性切割该位 点
制备平均大小100kb的外源片段
未酶切 Hindlll酶切2hrs Hindlll酶切4hrs
切胶回收后检测
97.0kb
23kb
cI 溶源(lysogenic)：R 复制子 RepA par 裂解(lytic)：162bp pac
二、P1噬菌体载体
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第4章 人工染色体载体
黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体
表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性
载体
黏粒 P1 PAC BAC YAC
容量（kb） 复制子
30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS
宿主
拷贝数
重组DNA导入 宿主的方式
转导 转导 电转化 电转化 转化
筛选标记
— sacB sacB α-互补 ade2
克隆DNA 获取方法 碱抽提
大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1
脉冲场电 泳
1
4.1 黏粒载体
4.1.1 黏粒的结构特征和用途
o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理
图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤
2
4.1.3 黏粒克隆载体
1．黏粒pJB8
o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体
o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb
图4-3 黏粒载体c2RB图谱
3
图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤
o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
4
4.1.4 黏粒的优缺点
（1）同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性
（2）具有高容量的克隆能力
柯斯质粒的缺点
o 两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生 重组，结果使克隆的外源DNA片段重排或丢失。
o 含不同重组DNA的菌落生长速度不一。
当柯斯质 粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主 细胞作用的情况不同，结果会出现各种外源DNA 片段间的比例失调。
另外不同重组柯斯质粒的产 量相差悬殊。
o 包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装 效率不稳定。
而且，购买包装蛋白的费用较高。
5
4.2 酵母人工染色体载体
o YAC (Yeast Artificial Chromosome ) 酵母人工 染色体 o 利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染 色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿 酒酵母中。
o 酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90 分钟；含16条染色体，其大小为225-1900kb，总计 有14×106bp；具真核mRNA的加工活性。
4.2.1 YAC载体的复制元件和标记基因
o 最常用的是pYAC4。
o 由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状 态也是线状的。
但是，为了方便制备YAC载体， YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠 杆菌质粒载体的复制元件和选择标记。
o YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主 复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂 功能的着丝粒（centromere, CEN）和两个端粒 （TEL）。
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YAC载体必须含有元件
①端粒重复序列（telomeric repeat， TEL），定 位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不 被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。
②着丝粒（centromere， CEN），有丝分裂过程中 纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正 确分配到子细胞中。
在YAC中起到保证一个细胞内 只有一个人工染色体的作用。
如pYAC4使用的是酵 母第四条染色体的着丝粒。
③自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌 中DNA进行双向复制所必须的信号。
YAC载体的选择标记 o 主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组 氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合 成缺陷型基因ura3等，以及赭石突变（突变为 UAA） 抑制基因sup4。
o 与YAC载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的 胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。
带有 这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落， 当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中 时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白 色菌落。
o 利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中 含有外源DNA片段插入的重组子。
7
4.2.2 YAC载体的工作原理
o YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别 用来构建高等真核生物的基因组文库。
ClaI (25)
CEN4
HindIII (30) EcoRI (555)
ARS1
HindIII (9630)
Sma I (592) Sal I (944)
TRP1
XbaI (9201)
URA3
pYAC4
AP r
11454 bp
XhoI (3533)
PMB1
XhoI (6711) HindIII (6701)
HindIII (3543)
TEL
BamHI (4238)
TEL
BamHI (6006)
ClaI (4307) HindIII (5045)
HIS3
HindIII (5232)
8
图4-6 pYAC4载体工作原理图
o 外源DNA片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，形成红色菌落；
4.3 细菌人工染色体载体（BAC）
o 细菌人工染色体（ Bacteria Artificial Chromosome，BAC）是基于大肠杆菌的F质粒构建 的高通量低拷贝的质粒载体。
o F质粒是一个约100kb的质粒，编码60多种参与复 制、分配和接合过程的蛋白质。
o 虽然F质粒通常以双链闭环DNA（1-2拷贝/细胞） 的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少 30个位点处进行随机整合。
o F质粒可通过性菌毛转移给受体细胞。
9
4.3.1 BAC载体及其结构组成
o 约7.5kb，其本质实际上是一个质粒克隆载体。
o 复制单元的特殊性:来自F质粒，包括严谨型控 制的复制区oriS，启动DNA复制的由ATP驱动的 解旋酶（RepE）以及3个确保低拷贝质粒精确分 配至子代细胞的基因座（parA、parB和parC）。
o 低拷贝性可以减小外源基因的表达产物对宿主 细胞的毒副作用。
o 标记基因:氯霉素抗性基因
o BAC与YAC和PAC相似，没有包装限制，因此可接受 的基因组DNA大小也没有固定的限制。
o 大多数BAC文库中克隆的平均大小约120kb，个别的 BAC重组子中含有的基因组DNA最大可达300kb。
10
图4-10 P1噬菌体载体构建DNA文库的流程图
图4-11 PAC载体pCYPAC1遗传结构图。