蛋白质溶液的浓缩方法 ppt课件
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蛋白质一般的纯化流程(共15张PPT)
持膜內外電位差平衡h移在冰浴中加入烘乾並磨碎的ammoniumsulfate至飽和度為60取50ml待Байду номын сангаас化之蛋白質攪拌15分鐘後以9000xg離心15min取出沉澱物並標示鹽析濃度上清液重複上述步驟作ammoniumsulfate至飽和度100分別取出其沉澱物準備透析沉澱物以buffer溶解將溶液置于透析管中在001mph7的phosphatebuffer中進行4透析隔夜
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
《蛋白质的性质实验》PPT课件
Pr+ 醋酸铅或硫酸铜 沉淀
4、生物碱试剂：
Pr+ 鞣酸或苦味酸 沉淀
观察加水
2021/4/24
23
实验注意事项
(1).在操作过程中试管不能冲向他人以防止烫伤。 (2).操作强酸时要注意，吸管使用要规范。 (3).双缩脲反应铜离子不能多加，否则与氢氧化
钠形成蓝色的氢氧化铜，干扰试验结果。 (4).实验报告各部分内容都要包括，实验结果如
实验一 蛋白质的性质实验
王伟 中国海洋大学医药学院
2021/4/24
1
实验目的
1. 加深理解所学有关的蛋白质性质的理论 知识
2. 掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量 分析的方法及原理
2021/4/24
2
实验原理
一、蛋白质呈色反应 二、蛋白质沉淀反应
2021/4/24
3
一、蛋白质呈色反应
❖ 蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及 其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生 成有色物质的反应。不同蛋白质分子所含的氨基酸 残基不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全 一样。
2021/4/24
6
（二）双缩脲反应
❖ 当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一分 子氨，进而缩合成一分子双缩脲。其在碱性条件下 双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为 双缩脲反应。
❖ 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，此 类似反应也称蛋白质的双缩脲反应。凡分子中含有 两个以上肽键的化合物都呈此反应，故所有蛋白质 都能与双缩脲试剂发生反应。
OH + HNO3
HO
HO
NO2 + NaOH
O
2021/4/24
NO2 + H2O
蛋白质的分离纯化(1)
蛋白质等电点： 在某pH时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
食品技术原理 浓缩技术
蒸发器的管束很长,约6~8m,其截面积很小,具 有很大的传热面,溶液送入管束后很快强烈沸 腾,管子的中央部分充满料液蒸汽,蒸汽从管口 流出的速度高达100-l20m/s，料液就被带动而 沿管子内壁形成上升或下降的液膜，被蒸汽带 动而沿管壁流动的液体速度可达20m/s,所以这 种蒸发器被称为液膜式蒸发器，
对各种不同粘度、不同浓缩比要求、不同沸腾 温度的物料,调整传热板的尺寸可满足最佳操作 条件的要求， 板式蒸发器的板组 4片成1板组 按所需传热面积顺序装于机架上,对所有板组而 言,加料是平流的，
英国APV公司新型板式蒸发器
这种设备没有升膜段,全部料液以降膜方式 流过加热板,而加热板则比普通板式蒸发器 的大，如此,一片降膜进料板紧接一片蒸汽 加热板,即两片成一组,板的长度为以前的 升膜板和降膜板长度之和,而板宽则比以前 增加50%,因此,为完成同一任务,需要板数 较少,组合后长度较短，料液在此设备内不 再循环,且停留时间极短，
蒸发器为升膜式, 它包括一个长管加 热器和一个分离器 以及附属设备 ： 冷凝器 、真空泵 、 不凝气排除 装置 、 疏水器、捕沫器，
附属设备
1、冷凝器：蒸发器所产生的大量二次蒸 汽必须设法排除掉,方法是将其导入冷凝 器进行冷凝，一般均采用混合式冷凝器
2、疏水器：为求蒸发器的蒸汽利用经济、 保持传热良好，同其他水蒸气加热设备 一样,必须装置排除冷凝水的设备,即疏水 器，
➢ 3、真空泵：因为冷凝器所能冷凝的气体主 要为水蒸气，而空气等不凝结气体如不设 法除去,系统的真空度不可能长久维持，
➢ 使用真空泵的目的就是抽出这些不凝结气体，
➢ 4、不凝气排除装置：为保持加热室的传热 效率，
➢ 方法是在加热器侧壁上设抽气管口,并连以管子 和排气阀门，
对各种不同粘度、不同浓缩比要求、不同沸腾 温度的物料,调整传热板的尺寸可满足最佳操作 条件的要求， 板式蒸发器的板组 4片成1板组 按所需传热面积顺序装于机架上,对所有板组而 言,加料是平流的，
英国APV公司新型板式蒸发器
这种设备没有升膜段,全部料液以降膜方式 流过加热板,而加热板则比普通板式蒸发器 的大，如此,一片降膜进料板紧接一片蒸汽 加热板,即两片成一组,板的长度为以前的 升膜板和降膜板长度之和,而板宽则比以前 增加50%,因此,为完成同一任务,需要板数 较少,组合后长度较短，料液在此设备内不 再循环,且停留时间极短，
蒸发器为升膜式, 它包括一个长管加 热器和一个分离器 以及附属设备 ： 冷凝器 、真空泵 、 不凝气排除 装置 、 疏水器、捕沫器，
附属设备
1、冷凝器：蒸发器所产生的大量二次蒸 汽必须设法排除掉,方法是将其导入冷凝 器进行冷凝，一般均采用混合式冷凝器
2、疏水器：为求蒸发器的蒸汽利用经济、 保持传热良好，同其他水蒸气加热设备 一样,必须装置排除冷凝水的设备,即疏水 器，
➢ 3、真空泵：因为冷凝器所能冷凝的气体主 要为水蒸气，而空气等不凝结气体如不设 法除去,系统的真空度不可能长久维持，
➢ 使用真空泵的目的就是抽出这些不凝结气体，
➢ 4、不凝气排除装置：为保持加热室的传热 效率，
➢ 方法是在加热器侧壁上设抽气管口,并连以管子 和排气阀门，
蛋白质分离技术全ppt课件
第十节
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
而增加
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
第29页/共53页
上样缓冲液 Loading buffer
第6页/共53页
第7页/共53页
一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
第22页/共53页
3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
蛋白纯化课件ppt
5. 收集洗脱液并进行检测，确 定蛋白质的纯度和浓度。
6. 对实验结果进行分析和总结 。
实验操作流程
实验前准备
确保实验器材和试剂 的清洁和完好，准备 好实验记录本。
样品处理
将蛋白质样品加入离 心机中进行离心分离 ，收集上清液。
层析分离
使用注射器将上清液 注入层析柱中，根据 蛋白质的性质选择合 适的洗脱液进行洗脱 。
3
食品加工技术优化
研究食品加工过程中蛋白质的变化和作用，优化 加工工艺。
环境监测领域
污染物的生物标志物
纯化特定环境污染物结合的蛋白，作为污染物存在的生物 标志物。
生态毒理学研究
纯化环境中的毒性蛋白，研究其对生态系统的影响和作用 机制。
生态修复与治理
利用纯化的微生物降解酶，研究环境修复和治理的新方法 。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
应用
凝胶过滤法常用于分离纯化蛋白质、 酶、核酸等生物大分子，尤其适用于 分离分子量相近的蛋白质或多肽。
CHAPTER 03
蛋白纯化的步骤
样品准备
样品来源
选择合适的生物样品，如 细胞、组织或培养液，确 保样品中目标蛋白的含量 较高。
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎 细胞，释放细胞内的蛋白 质。
去除杂质
通过离心、过滤等方法去 除细胞碎片、颗粒物等杂 质。
粗分离
离心分离
根据蛋白质的密度和大小差异，采用离心法 进行初步分离。
沉淀与溶解
通过调节溶液的pH值、离子强度或添加有机溶剂， 使蛋白质沉淀，再通过溶解将蛋白质重新溶解在适 宜的缓冲液中。
凝胶电泳分离
利用电泳技术将蛋白质在凝胶上进行分离， 根据蛋白质的电荷和大小进行分离。
生物分离工程-第五章-萃取技术PPT课件
mCl
[R Cl - ] [Cl - ]
则
mAKeC mlCl1[H K 2][K H 1 K ]2 21
43
-化学萃取平衡之分配平衡（2）
二（2－乙基己基）磷酸萃取氨基酸为例，其所对应的离 子交换反应
A2(H2RA ) R(3H H R )
KeH[A[AR]([(HH3R]R[2)H])]
氨基酸的表观分配系数为
6
生物产品萃取根据分子量大小划分
小分子类 化合物相对分子量约小于1000，如氨基酸、 抗生素、维生素、有机酸等，采用有机溶 剂萃取
大分子类 相对分子量大于1000，如酶，抗体，蛋白 质等，有机溶剂不适用，可选用反胶团萃 取、双水相萃取等
7
工业上生产青霉素
大多采用醋酸丁酯为萃取剂，pH=1.8～2.2， 相比VO/VW=1/2～1/2.5，温度5℃，反萃取过 程采用碳酸氢钾或碳酸钾水溶液为反萃取剂。
A
A+
A+
AA+
A AClA
有机相
R+Cl-
RR++CA-l-
R+Cl-
R+Cl-
R+Cl-
42
化学萃取平衡之分配平衡
季胺盐萃取氨基酸为例，其所对应的离子交换反应
R C lA R A -C l
[RA-][Cl- ] KeCl [RCl- ][A- ]
氨基酸和氯离子对应的表观分配系数分别为
[R A- ] mA cA
51
2、双水相形成
当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作 用时，即一种分子周围将聚集同种分子而 排斥异种分子，则在达到平衡时，就形成 分别富含不同聚合物的两相 。
《蛋白沉淀反应》课件
01
02
03
04
蛋白质分离纯化
利用不同蛋白质在沉淀反应中 的差异，将目标蛋白质与其他
杂质分离。
蛋白质结构研究
通过观察不同条件下蛋白质的 沉淀行为，了解蛋白质的结构
与功能关系。
生物工程应用
在生物工程中，利用蛋白沉淀 反应从发酵液中分离纯化酶和
蛋白质。
临床诊断
在临床诊断中，利用蛋白沉淀 反应检测蛋白质的异常表达和
结果2
通过测定上清液和沉淀物的蛋 白质浓度，可以计算出蛋白质 的沉淀率。
结果3
通过比较不同pH值下的沉淀率 ，可以得出最佳的pH值范围。
结果4
通过比较不同盐浓度下的沉淀 率，可以得出最佳的盐浓度范
围。
03 蛋白沉淀反应的影响因素
盐浓度
盐浓度是影响蛋白沉淀反应的重要因素之一。随着盐浓度的 增加，蛋白质的溶解度逐渐降低，最终导致蛋白质从溶液中 沉淀出来。这种现象称为盐析。常用的盐析剂包括硫酸铵、 氯化钠等。
新技术的应用
01
蛋白沉淀反应技术将与生物信息 学、大数据等新技术结合，实现 更精准的蛋白质分离和纯化。
02
人工智能和机器学习将应用于蛋 白沉淀反应的优化和自动化，提 高实验效率和准确性。
新型蛋白沉淀剂的开发
新型蛋白沉淀剂将更加高效、特异和 温和，减少对蛋白质结构和功能的损 害。
开发新型蛋白沉淀剂将更加注重环保 和可持续性，减少对环境的负面影响 。
VS
在实际操作中，通常先将有机溶剂加 入到蛋白质溶液中，搅拌均匀后再缓 慢降低温度，以促进蛋白质的沉淀。 通过调节有机溶剂的浓度和温度，可 以实现对蛋白质的分离和纯化。
04 蛋白沉淀反应的优化与改 进
优化盐浓度
蛋白质的透析
而实现物质分离。
蛋白质透析的应用
生物制品分离纯化
在生物制品的分离纯化过程中， 蛋白质透析常用于去除盐、糖等 小分子杂质，提高产品的纯度。
实验室研究
在实验室研究中，蛋白质透析可 用于制备高纯度的蛋白质样品， 供后续实验使用。
临床应用
在某些临床应用中，如血浆置换 疗法，蛋白质透析可用于去除血 浆中的毒素或过量的药物。
透析效率问题
透析效率问题
透析效率低下可能导致体内毒素和多余水分不能被充分清除 。
解决方案
采用高效透析器，提高血流速度，缩短透析时间，增加透析 液流量等措施，以提高透析效率。同时，根据个体情况调整 透析方案，以达到最佳的透析效果。
蛋白质变性问题
蛋白质变性问题
在透析过程中，蛋白质可能会发生构象变化，导致其功能受损。
浓缩蛋白质溶液
通过去除部分溶剂，使蛋白质溶液得 到浓缩。
蛋白质透析的原理
半透膜原理
01
透析利用半透膜原理，允许小分子物质透过膜而大分子物质被截留，从而实现物质分离。分子量大小差异02
蛋白质分子量较大，无法透过半透膜，而小分子物质如盐、糖
等可以自由透过半透膜。
浓度差驱动
03
透析过程中，小分子物质从高浓度一侧扩散至低浓度一侧，从
疾病机制研究
蛋白质的透析可以帮助研究疾病的发病机制 和治疗机制，为疾病的预防和治疗提供新的 思路和方法。未来随着人类对疾病认识的深 入和技术的进步，蛋白质的透析在疾病机制 研究中的应用将更加广泛和深入。
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临床应用展望
个性化透析
随着基因组学和蛋白质组学的发展，未来蛋白质的透析将更加个性化，根据患者的具体情况制定个性化的透析方案， 提高治疗效果和患者的生存质量。
蛋白质的理化性质ppt课件
44
蛋白质的热变性与凝固作用
2、蛋白质的凝固作用
天然蛋白质变性后，变性蛋 白质分子互相凝集或相互穿插 缠绕在一起的现象成为蛋白质 的凝固（coagulation） 。
凝固作用分两个阶段： 首先是变性； 其次失去规律性的肽链聚集缠绕在一起而凝固或结絮;
45
淀，加热后变成红色 31
六、蛋白质的颜色反应
7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应
在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将 浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混， 在液面交界处，即有紫色环形成
色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸
32
六、蛋白质的颜色反应
8. 坂口反应—精氨酸特有的反应
19
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀 What’s salt precipitation of protein? 盐溶作用 盐析作用
20
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein? 定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以
沉淀原理：
① 脱水作用——破坏水化膜； ② 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。
24
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（2）有机溶剂沉淀法 处理条件： ① 低温操作；
② 沉淀完全后尽快分离；
（3）酸沉淀法 机制：破坏电荷，等电点沉淀。
25
四、蛋白质的沉淀作用
3.沉淀方法：
沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法 沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法
同性电荷蛋白质分子互相排斥。
7
蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜
蛋白质的热变性与凝固作用
2、蛋白质的凝固作用
天然蛋白质变性后，变性蛋 白质分子互相凝集或相互穿插 缠绕在一起的现象成为蛋白质 的凝固（coagulation） 。
凝固作用分两个阶段： 首先是变性； 其次失去规律性的肽链聚集缠绕在一起而凝固或结絮;
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淀，加热后变成红色 31
六、蛋白质的颜色反应
7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应
在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将 浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混， 在液面交界处，即有紫色环形成
色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸
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六、蛋白质的颜色反应
8. 坂口反应—精氨酸特有的反应
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蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀 What’s salt precipitation of protein? 盐溶作用 盐析作用
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蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein? 定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以
沉淀原理：
① 脱水作用——破坏水化膜； ② 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。
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蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（2）有机溶剂沉淀法 处理条件： ① 低温操作；
② 沉淀完全后尽快分离；
（3）酸沉淀法 机制：破坏电荷，等电点沉淀。
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四、蛋白质的沉淀作用
3.沉淀方法：
沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法 沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法
同性电荷蛋白质分子互相排斥。
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蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜
蛋白质分析课件
《蛋白质分析》PPT课件
蛋白质的快速测定－双缩脲法
原理
《蛋白质分析》PPT课件
方法特点及应用范围
灵敏度较低，但操作简单快速，在生物 化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。 适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品的测定。也可定量测定分离 纯化后的蛋白质。
《蛋白质分析》PPT课件
步骤
标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白 质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含 量 40mg 、 50mg 、 60mg 、 70mg 、 80mg 、 90mg 、 100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质 样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四 氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（①或②）准确 稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上 层清夜离心5分钟，取离心分离后的透明液于 比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液 调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋 白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制 标准曲线。
《蛋白质分析》PPT课件
四、紫外吸收法
原理 蛋白质在UV280nm处有强烈吸收，这是由 于蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环 残基存在。由于存在于每一种食品的蛋 白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定， 所以可用比色法，即在280nm处比色测定 蛋白质的浓度。
《蛋白质分析》PPT课件
适用范围
应用 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于 许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故 还没有广泛应用于食品体系。 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量， 但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提 在碱液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。 尽管蛋白质中的肽键在190nm~220nm处的紫 外吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的 测定更困难。
蛋白质的快速测定－双缩脲法
原理
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方法特点及应用范围
灵敏度较低，但操作简单快速，在生物 化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。 适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品的测定。也可定量测定分离 纯化后的蛋白质。
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步骤
标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白 质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含 量 40mg 、 50mg 、 60mg 、 70mg 、 80mg 、 90mg 、 100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质 样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四 氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（①或②）准确 稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上 层清夜离心5分钟，取离心分离后的透明液于 比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液 调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋 白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制 标准曲线。
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四、紫外吸收法
原理 蛋白质在UV280nm处有强烈吸收，这是由 于蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环 残基存在。由于存在于每一种食品的蛋 白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定， 所以可用比色法，即在280nm处比色测定 蛋白质的浓度。
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适用范围
应用 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于 许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故 还没有广泛应用于食品体系。 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量， 但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提 在碱液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。 尽管蛋白质中的肽键在190nm~220nm处的紫 外吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的 测定更困难。
蛋白质溶液的浓缩方法
• 吸附剂的选择： （1）吸附剂不能与溶液发生化学反应； （2）吸附剂对蛋白质不吸附； （3）吸附剂易于溶液分开。 常用的吸附剂：PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝胶等。 常用的吸附方法：透析袋法和凝胶浓缩法。
21
2.1 透析袋吸附法
• 透析袋吸附法在透析技术的基础 上改良而来的。 传统的透析是基于分子质量大小 的液相分离技术，它由透过半透 膜的选择性扩散来实现。但是纯 粹的透析主要用于除去小分子类 的溶质，而要达到浓缩（即除去 溶剂）的目的则费时较长。 透析袋吸附法是将透析液换成可 以吸水的溶液或者固体吸附剂， 这样可实现很好的浓缩作用。
33
4.3 超滤膜的选择
超滤膜
相对流速(ml/min/cm2)
性能特点
聚醚砜，pH范围1 ~ 14
3,000 MWCO
0.05
5,000 MWCO
0.24
10,000 MWCO
0.41
30,000 MWCO
0.41
50,000 MWCO
0.45
100,000 MWCO
0.35
三醋酸纤维素，pH范围4 ~ 8
（2）选用一种水溶性非离子多聚物，使蛋白质在 同一液相中，由于分子相互排斥而凝聚导致蛋白析出。该 方法操作时先离心除去大悬浮颗粒，调整溶液PH值和温 度至适度，然后加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷贮一 段时间，即形成沉淀。
19
2. 吸附法
2.1 透析袋吸附法 2.2 凝胶吸附法
20
吸附法
• 定义：通过吸附剂直接去除溶液中的水分子以达到浓缩蛋 白质溶液的目的。 吸附法是最简单快速的浓缩蛋白质溶液的方法，所需 仪器简单，特别适用于稳定性较差的蛋白质。
23
2.2 凝胶吸附法
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2.1 透析袋吸附法
• 透析袋吸附法在透析技术的基础 上改良而来的。 传统的透析是基于分子质量大小 的液相分离技术，它由透过半透 膜的选择性扩散来实现。但是纯 粹的透析主要用于除去小分子类 的溶质，而要达到浓缩（即除去 溶剂）的目的则费时较长。 透析袋吸附法是将透析液换成可 以吸水的溶液或者固体吸附剂， 这样可实现很好的浓缩作用。
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4.3 超滤膜的选择
超滤膜
相对流速(ml/min/cm2)
性能特点
聚醚砜，pH范围1 ~ 14
3,000 MWCO
0.05
5,000 MWCO
0.24
10,000 MWCO
0.41
30,000 MWCO
0.41
50,000 MWCO
0.45
100,000 MWCO
0.35
三醋酸纤维素，pH范围4 ~ 8
（2）选用一种水溶性非离子多聚物，使蛋白质在 同一液相中，由于分子相互排斥而凝聚导致蛋白析出。该 方法操作时先离心除去大悬浮颗粒，调整溶液PH值和温 度至适度，然后加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷贮一 段时间，即形成沉淀。
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2. 吸附法
2.1 透析袋吸附法 2.2 凝胶吸附法
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吸附法
• 定义：通过吸附剂直接去除溶液中的水分子以达到浓缩蛋 白质溶液的目的。 吸附法是最简单快速的浓缩蛋白质溶液的方法，所需 仪器简单，特别适用于稳定性较差的蛋白质。
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2.2 凝胶吸附法
蛋白质的分离与提纯
蛋白质的理化性质
蛋白质的两性解离 蛋白质的胶体性质 分离基础 蛋白质的变性、沉淀和凝固 蛋白质的紫外吸收 鉴别和检验 蛋白质的呈色反应
}
}
蛋白质的胶体性质
蛋白质在溶液中形成的颗粒直径大约1～100 nm，属于胶体颗粒的范围，所以蛋白质是 胶体物质，蛋白质的水溶液是亲水胶体溶液。 蛋白质形成亲水胶体溶液的稳定因素：分子 表面的水化层和电荷层。 蛋白质的水溶液是稳定的亲水胶体溶液。溶 液扩散慢，粘度大，不能透过半透膜。
电泳法
离心法
离心法
+
=
返回
沉淀法
返回
透析法
返回
过滤法
返回
层析法
返回
电泳法
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PART 3
Part 3：SDS-PAGE电泳
化1003班 宋昊东
？
何为SDS-PAGE电泳法？？
sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 原理： 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有 两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶 、SDS-聚丙烯酰胺凝 胶（SDS-PAGE） 非变性聚丙烯酰胺凝胶：电泳过程中，蛋白质保持完 整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及 其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 SDS-PAGE：仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分 开蛋白质。该技术最初于建立1967年，在样品介质和丙 烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚 基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽 略电荷因素）。
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蛋白质溶液的浓缩方法
1
蛋白质溶液的浓缩方法
1 蛋白质种类和特性 2 蛋白质浓缩 3 常用浓缩方法 4 小结与展望
2
蛋白质溶液的浓缩方法
3
蛋白质溶液的浓缩方法
• 胶体性质 – 蛋白质的分子量在1万-100万之间，直径在1-100nm 之间，属于胶体粒子。蛋白质的水溶液是一种比较稳 定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多 极性基团，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2 等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容 易在蛋白质颗粒外面形成—层水膜。
• 常用的浓缩方法： »沉淀法（蛋白质的沉淀性质） »吸附法（吸水剂） »冻干法（真空低温脱水） »超滤法（分子量）
5
1. 沉淀法
1.1 盐析法 1.2 低温有机溶剂沉淀法 1.3 等电点沉淀法 1.4 生成盐复合物沉淀法 1.5 选择变性沉淀法 1.6 非离子多聚物沉淀法
6
蛋白质溶液的浓缩方法
10
蛋白质溶液的浓缩方法
• 硫酸铵盐析法的注意事项： （1）由于蛋白质沉淀的密度与硫酸铵饱和溶液的密度相 近，因此离心分离沉淀物时一般需要高速离心机。 （2）硫酸铵会使溶液略微酸化，可用氨水进行调节。 （3）注意饱和度表中规定的温度，加入固体硫酸铵盐后 的体积变化已考虑在表中； （4）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才 过滤或离心。离心多用于低浓度硫酸铵溶液，而过滤多用 于高浓度硫酸铵溶液； （5）硫酸铵中可能含有少量的重金属离子，使用前必须 用H2S处理。
12
蛋白质溶液的浓缩方法
• 影响因素： （1）温度：低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶 解度，提高提取效率； （2）样品浓度和pH： 与盐析法中的作用基本相同； （3）金属离子：一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定pH 下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在 水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白 质的生物活性。 （4）离子强度：盐浓度太高或太低都对分离有不利影响 ，对蛋白质和多糖而言，盐浓度不超过5%比较合适，使 用的乙醇量不宜超过二倍体积。
13
蛋白质溶液的浓缩方法
• 优缺点： 优点：（1）分辨力高于盐析法，即蛋白质只在一个比较 窄的有机溶剂浓度下沉淀； （2）沉淀不用脱盐，过滤更为容易。
缺点：容易使蛋白质变性失活，操作要求在低温下进行。 如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0~4℃低温下进行。蛋 白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。
11
蛋白质溶液的浓缩方法
• 原理： （1）甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂
介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力； （2）上述有机溶剂是强亲水试剂，破坏蛋白质胶体
分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。
• 有机溶剂的选择： 有机溶剂首选能与水混容的，常用乙醇、甲醇、丙酮
等。大多数蛋白质通过加入等体积的丙酮或四倍体积的乙 醇就可以沉淀下来，但也造成的了蛋白质溶液的稀释，所 以蛋白质溶液的浓度一般要在1mg/ml以上。
14
蛋白质溶液的浓缩方法
• 原理：两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低。
• 适用范围：只适用于水化程度不大、在等电点时溶解度很 低的蛋白质，如酪蛋白。对于亲水性很强的蛋白质，在等 电点附近仍然有很大的溶解度，用等电点法沉淀不完全。 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用，以提高其沉淀能力。
• 原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水 分子，使溶液中自由水分子数减小，从而破坏蛋白质表面 的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
8
蛋白质溶液的浓缩方法
• 盐类的选择：价格低； 溶解度好； 溶解过程中产热少； 盐溶液密度与沉淀的密度有明显差别。
一般来说：高价阴离子：PO43- > SO42- > Ac-和NO3-， 单价阳离子：NH4+ > K+和Na+， 高价阴离子的沉淀效果优于单价阳离子。
• 优缺点： 优点：很多蛋白质的等电点在偏酸性范围内，调节pH时所 需要的无机酸价格低，操作也比较方便。 缺点：对低pH敏感的蛋白应避免使用此法。
15
蛋白质溶液的浓缩方法
蛋白质可生成盐类复合物沉淀，主要方法： （l）与酸性功能团作用的金属复合盐法（如铜盐、银盐 、锌盐、铅盐、锂盐、钙盐等），沉淀可通以H2S使金属 变成硫化物而除去； （2）与碱性功能团作用的有机复合盐法（如苦味酸盐、 苦酮酸盐、丹宁酸盐等），沉淀加入无机酸并用乙酸萃取 ，或用离子交换法除去。 （3）无机复合盐法（如磷钨酸盐、磷钼酸盐等）。
9
蛋白质溶液的浓缩方法
e.g 硫酸铵盐析法浓缩蛋白质溶液 硫酸铵因其价格便宜、溶解度高且对温度的敏感性低
而被常用于沉淀蛋白质。
操作方法：（1）加入固体硫酸铵，适用于要求饱和度较 高而不增大溶液体积的情况； （2）加入饱和硫酸铵溶液，适用于要求饱和度不高而原 来溶液体积不大的情况； （3）透析平衡法（多用于结晶），先将盐析的样品装于 透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫 酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后目的蛋白析出。
• 沉淀法浓缩蛋白质溶液，指将蛋白质分子凝聚从溶液中析 出的现象。
• 沉淀法是比较传统的分离纯化蛋白质的方法，目前仍然广 泛使用。一般常用的沉淀浓缩有硫酸铵沉淀法、（低温） 有机溶剂沉淀法、丙酮沉淀法、免疫沉淀法、三氯醋酸沉 淀法、聚乙二醇沉淀法等。
7
蛋白质溶液的浓缩方法
• 定义：盐析一般指溶液中加入无机盐而使某种蛋白质溶解 度降低而析出的过程。
但值得注意的是，重金属、某些有机酸与无机酸和蛋 白质形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用 质对某些物理或化学因素的敏感性不同， 有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。
• 两性解离和等电点 – 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，在一定的pH条 件下，能解离为带电基团从而使蛋白质带电。
• 蛋白质的变性
4
蛋白质溶液的浓缩方法
• 蛋白质溶液的浓缩连接了蛋白质的提取和蛋白质的分离纯 化，是获取高浓度或高活性蛋白质的重要步骤。
• 浓缩目的：提高蛋白质浓度；减少样品体积； 便于进一步纯化。
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蛋白质溶液的浓缩方法
1 蛋白质种类和特性 2 蛋白质浓缩 3 常用浓缩方法 4 小结与展望
2
蛋白质溶液的浓缩方法
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 胶体性质 – 蛋白质的分子量在1万-100万之间，直径在1-100nm 之间，属于胶体粒子。蛋白质的水溶液是一种比较稳 定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多 极性基团，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2 等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容 易在蛋白质颗粒外面形成—层水膜。
• 常用的浓缩方法： »沉淀法（蛋白质的沉淀性质） »吸附法（吸水剂） »冻干法（真空低温脱水） »超滤法（分子量）
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1. 沉淀法
1.1 盐析法 1.2 低温有机溶剂沉淀法 1.3 等电点沉淀法 1.4 生成盐复合物沉淀法 1.5 选择变性沉淀法 1.6 非离子多聚物沉淀法
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蛋白质溶液的浓缩方法
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 硫酸铵盐析法的注意事项： （1）由于蛋白质沉淀的密度与硫酸铵饱和溶液的密度相 近，因此离心分离沉淀物时一般需要高速离心机。 （2）硫酸铵会使溶液略微酸化，可用氨水进行调节。 （3）注意饱和度表中规定的温度，加入固体硫酸铵盐后 的体积变化已考虑在表中； （4）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才 过滤或离心。离心多用于低浓度硫酸铵溶液，而过滤多用 于高浓度硫酸铵溶液； （5）硫酸铵中可能含有少量的重金属离子，使用前必须 用H2S处理。
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 影响因素： （1）温度：低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶 解度，提高提取效率； （2）样品浓度和pH： 与盐析法中的作用基本相同； （3）金属离子：一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定pH 下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在 水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白 质的生物活性。 （4）离子强度：盐浓度太高或太低都对分离有不利影响 ，对蛋白质和多糖而言，盐浓度不超过5%比较合适，使 用的乙醇量不宜超过二倍体积。
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 优缺点： 优点：（1）分辨力高于盐析法，即蛋白质只在一个比较 窄的有机溶剂浓度下沉淀； （2）沉淀不用脱盐，过滤更为容易。
缺点：容易使蛋白质变性失活，操作要求在低温下进行。 如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0~4℃低温下进行。蛋 白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 原理： （1）甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂
介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力； （2）上述有机溶剂是强亲水试剂，破坏蛋白质胶体
分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。
• 有机溶剂的选择： 有机溶剂首选能与水混容的，常用乙醇、甲醇、丙酮
等。大多数蛋白质通过加入等体积的丙酮或四倍体积的乙 醇就可以沉淀下来，但也造成的了蛋白质溶液的稀释，所 以蛋白质溶液的浓度一般要在1mg/ml以上。
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 原理：两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低。
• 适用范围：只适用于水化程度不大、在等电点时溶解度很 低的蛋白质，如酪蛋白。对于亲水性很强的蛋白质，在等 电点附近仍然有很大的溶解度，用等电点法沉淀不完全。 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用，以提高其沉淀能力。
• 原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水 分子，使溶液中自由水分子数减小，从而破坏蛋白质表面 的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 盐类的选择：价格低； 溶解度好； 溶解过程中产热少； 盐溶液密度与沉淀的密度有明显差别。
一般来说：高价阴离子：PO43- > SO42- > Ac-和NO3-， 单价阳离子：NH4+ > K+和Na+， 高价阴离子的沉淀效果优于单价阳离子。
• 优缺点： 优点：很多蛋白质的等电点在偏酸性范围内，调节pH时所 需要的无机酸价格低，操作也比较方便。 缺点：对低pH敏感的蛋白应避免使用此法。
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蛋白质溶液的浓缩方法
蛋白质可生成盐类复合物沉淀，主要方法： （l）与酸性功能团作用的金属复合盐法（如铜盐、银盐 、锌盐、铅盐、锂盐、钙盐等），沉淀可通以H2S使金属 变成硫化物而除去； （2）与碱性功能团作用的有机复合盐法（如苦味酸盐、 苦酮酸盐、丹宁酸盐等），沉淀加入无机酸并用乙酸萃取 ，或用离子交换法除去。 （3）无机复合盐法（如磷钨酸盐、磷钼酸盐等）。
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蛋白质溶液的浓缩方法
e.g 硫酸铵盐析法浓缩蛋白质溶液 硫酸铵因其价格便宜、溶解度高且对温度的敏感性低
而被常用于沉淀蛋白质。
操作方法：（1）加入固体硫酸铵，适用于要求饱和度较 高而不增大溶液体积的情况； （2）加入饱和硫酸铵溶液，适用于要求饱和度不高而原 来溶液体积不大的情况； （3）透析平衡法（多用于结晶），先将盐析的样品装于 透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫 酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后目的蛋白析出。
• 沉淀法浓缩蛋白质溶液，指将蛋白质分子凝聚从溶液中析 出的现象。
• 沉淀法是比较传统的分离纯化蛋白质的方法，目前仍然广 泛使用。一般常用的沉淀浓缩有硫酸铵沉淀法、（低温） 有机溶剂沉淀法、丙酮沉淀法、免疫沉淀法、三氯醋酸沉 淀法、聚乙二醇沉淀法等。
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 定义：盐析一般指溶液中加入无机盐而使某种蛋白质溶解 度降低而析出的过程。
但值得注意的是，重金属、某些有机酸与无机酸和蛋 白质形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用 质对某些物理或化学因素的敏感性不同， 有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。
• 两性解离和等电点 – 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，在一定的pH条 件下，能解离为带电基团从而使蛋白质带电。
• 蛋白质的变性
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 蛋白质溶液的浓缩连接了蛋白质的提取和蛋白质的分离纯 化，是获取高浓度或高活性蛋白质的重要步骤。
• 浓缩目的：提高蛋白质浓度；减少样品体积； 便于进一步纯化。