培美曲塞联合奥沙利铂对人胃癌BGC823细胞生长的影响

培美曲塞联合奥沙利铂对人胃癌BGC-823细胞生长的影响任　峰1，陈　伟2，王英杰2，许洪卫2苏州大学附属第四医院暨无锡市第四人民医院　1. 检验科；2. 普外科，无锡　214062[摘要]　目的：探讨培美曲塞与奥沙利铂对人胃癌细胞BGC-823的生长抑制作用以及可能的作用机制。

方法：采用不同浓度培美曲塞和奥沙利铂单独或联合作用于BGC-823细胞。

应用MTT 法检测BGC-823细胞生长抑制率，FCM 检测细胞周期的变化，蛋白质印迹法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ，PCNA ）和细胞周期蛋白D1（cell cycle D1，cyclin D1）的表达水平。

结果：培美曲塞和奥沙利铂均可抑制BGC-823细胞的生长（P ＜0.05），且呈时间和剂量依赖性。

这两种药物均可明显增加G 1期细胞比例，降低S 期细胞比例。

蛋白质印迹法检测结果显示，cyclin D1和PCNA 表达量均明显降低，其中培美曲塞和奥沙利铂联合处理具有协同效应，培美曲塞（80 µg/mL ）处理24 h 后序贯奥沙利铂（40 µg/mL ）处理24 h 组BGC-823细胞的生长抑制率明显高于双药联合处理组以及奥沙利铂（40 µg/mL ）处理24 h 后序贯培美曲塞（80 µg/mL ）处理24 h 组（P ＜0.05）。

结论：培美曲塞和奥沙利铂均可抑制胃癌细胞BGC-823的生长，细胞被阻滞于G 1期。

在双药联合处理中，以培美曲塞序贯奥沙利铂对胃癌细胞的生长抑制最强。

[关键词]　胃肿瘤；抗肿瘤联合化疗方案；细胞凋亡；培美曲塞；奥沙利铂；细胞，BGC-823[中图分类号]　R735.2[文献标志码]　A[文章编号]　1000-7431 (2011) 12-1067-05Effect of pemetrexed combined with oxaliplatin on the growth of human gastric cancer cell BGC-823REN Feng 1, CHEN Wei 2, WANG Ying-jie 2, XU Hong-wei 21. Department of Clinical Laboratory;2. Department of General Surgery, Fourth Affiliated Hospital of Soochow University, Fourth People’s Hospital of Wuxi, Wuxi 214062, China[ABSTRACT]　Objective: To investigate the growth inhibition effects of pemetrexed and oxaliplatin on human gastric cancer cell line BGC-823 in vitro , and to explore the possible mechanism. Methods: The BGC-823 cells were treated with different concentrations of pemetrexed or oxaliplatin alone or in combination. The growth inhibition rate of BGC-823 cells was detected by MTT method, and the change of cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry (FCM). The expressions levels of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and cell cycle D1 (cyclin D1) proteins in BGC-823 cells were examined by Western blotting. Results: The growth of BGC-823 cells was inhibited by pemetrexed or oxaliplatin in a dose- and time-dependent manner (P ＜0.05). The percentage of cells in G 1 phase was increased while which in S phase was decreased by the treatment of pemetrexed or oxaliplatin. The expression levels of PCNA and cyclin D1 proteins were significantly decreased, and the combination regimen of pemetrexed and oxaliplatin exerted a synergistic effect. The growth inhibition rate of BGC-823 cells treated with pemetrexed (80 μg/mL) for 24 h followed by oxaliplatin (40 μg/mL) for 24 h was significantly decreased as compared with those of the cells treated with pemetrexed (80 μg/mL) combined with oxaliplatin (40 μg/mL) at the same time or treated with oxaliplatin (40 μg/mL) for 24 h followed by pemetrexed (80 μg/mL) for 24 h (P ＜0.05). Conclusion: Pemetrexed and oxaliplatin can both inhibit the proliferation of gastric cancer BGC-823 cells and arrest the cells at G 1 phase. The sequential regimen of pemetrexed followed by oxaliplatin may have the strongestgrowth-inhibitory effect on gastric cancer cells among different doublet regimens.[KEY WORDS]　Stomach neoplasms; Antineoplastic combined chemotherapy protocols; Apoptosis; Pemetrexed; Oxaliplatin; Cell, BGC-823[TUMOR , 2011, 31 (12): 1067-1071][基金项目] 1. 国家自然科学基金资助项目（编号：30171039） 2. 江苏省自然科学基金资助项目（编号：BK2008115）Correspondence to: XU Hong-wei （许洪卫） E-mail: xuhongwei@ Received 2011-08-11 Accepted 2011-10-18003DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12.Copyright© 2011 by TUMOR肿瘤2011年12月第31卷第12期　TUMOR Vol. 31, December 2011 1067基础研究·Basic Research培美曲塞是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂，通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长[1]。

培美曲塞在胃癌患者中具有明显的抗肿瘤活性。

临床研究报道提示，培美曲塞联合奥沙利铂治疗晚期胃癌具有明显的疗效[2]。

奥沙利铂是具有细胞毒作用的抗癌药物，属于新的铂类抗癌药物，体内和体外研究均证实奥沙利铂在顺铂耐药的肿瘤模型中仍然有效，在包括人结直肠癌模型在内的多种肿瘤模型系统中，奥沙利铂均表现出广谱的体外细胞毒及体内抗肿瘤活性[3]。

然而，目前国内外有关培美曲塞对胃癌细胞生长作用的研究报道还很少。

本研究以奥沙利铂作为对照，探讨培美曲塞联合奥沙利铂对人胃癌细胞BGC-823生长的影响，并从细胞角度分析其可能的作用机制，以期为临床用药提供可靠的实验依据。

1　材料与方法1.1　材料　人胃癌细胞株BGC-823由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培养液购自Gibco公司；培美曲塞与奥沙利铂均由美国礼来公司提供；MTT购自美国Sigma公司；电化学发光液、兔抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、细胞周期蛋白D1（cell cycle D1，cyclin D1）单克隆抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；酶联免疫检测仪购自美国Bio-Rad公司；FACSAria流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。

1.2　细胞培养　用含10%小牛血清的DMEM培养液，在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养人胃癌细胞株BGC-823。

待细胞铺满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸钠混合消化液分散成单细胞，进行传代培养，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3　MTT法检测细胞生长抑制情况1.3.1　药物作用分组　调整细胞密度后，按8×103个/孔接种于96孔板上，培养过夜后，进行分组。

（1）空白对照组：不含药物培养液。

（2）单药处理组，培美曲塞药物浓度分别为10、20、40、80和160 µg/mL，奥沙利铂药物浓度分别为10、20、40、80和120 µg/mL，这2种药物分别处理BGC-823细胞12、24和48 h。