《细胞与免疫学技术与原理》3

缺点：
目前电融合技术存在 的主要问题是融合细胞存 活率低。
细胞融合技术的应用
1、利用基因定位绘制人类基因图
(1) 小鼠×人杂交细胞，人染色 体优先丢失，而只留下一条或少 数几条人的染色体； (2) 染色体分带技术可以把人与 鼠的染色体区分开，而且能区别 每一根人的染色体； (3) 电泳技术可以鉴别不同种动 物的蛋白和酶。
PEG的作用与细胞表面结构间 形成离子键有关。 PEG可与水分子借氢键结合， 在高浓度(50％)的PEG溶液中自由 水消失，导致细胞脱水而发生质膜 结构的变化，由此引起细胞融合。
化学诱导法的特点
优点：
具有细胞融合的通用性；与病毒 比较，容易制备和控制；活性稳定； 使用方便。 缺点： 对细胞毒性很大；诱导产生杂交 细胞的频率仍在很低水平；不能在显 微镜下观察细胞的融合过程。
化学法——PEG
优点：
聚乙二醇（PEG）来源方便，使用简便 活性稳定 诱导细胞融合的频率较仙台病毒高达数百倍 诱导植物和动物细胞融合
聚乙二醇的作用机理
PEG的水溶性极强，在液相介质 中，它的许多醚键带有微弱负电荷； 在Ca2+参与下，PEG将带正电荷的表 面蛋白或带负电荷的糖蛋白，通过 Ca2+桥连在—起，使细胞发生聚集、 融合。
2、利用杂交细胞生产活性物质 单克隆抗体工业的兴起就是 利用B淋巴细胞被特异的抗原刺激 后能应答而分泌特异的抗体的特 点同骨髓瘤细胞的长命不死的特 点两者融而为一。
推论： 可能利用胰脏细胞生产胰岛素， 利用甲状腺细胞生产甲状腺素，利 用垂体细胞生产生长激素、各种促 性腺激素、催乳素以及各种神经激 素等。还可以利用麝香腺细胞生产 麝香。
科学家把大鳞副泥鳅同鳗尾泥鳅杂 交培育了融合鱼。 将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合， 培育了融合鱼苗。这些融合鱼各具两对 触须，形态类似鲤鱼。
（4）在植物新品种育种上的应用
萝卜和甘蓝、粉蓝烟草和郎氏烟草、 番茄和马铃薯、烟草和大豆、甘蔗和高 粱、芥菜和紫芸苦等，这些杂种植物采 用有性杂交的方法是难以得到的。 我国科学家已培育出普通烟草与黄 花烟草、普通烟草与粉蓝烟草、烟草与 矮牵牛、烟草与天仙子等种间和属间体 细胞杂种植株。
（5）如果控制系统不受污染，能长期运转。
缺点：
由于中空纤维每次生产的 消耗器价格尚贵，如果使用不 当会增加生产成本。
3、细胞培养专用微载体
微载体含义: 微载体指直径在60～250μm 、能够适用于贴壁细胞生长的微 珠。 一般是由天然葡聚糖或者各 种合成的聚合物组成。
微载体培养的优点：
1. 表面积/体积（S/V）大。 2. 兼有悬浮培养和贴壁培养两种方法 优点。 3. 简便的显微镜观察。能监测出细胞 在微珠生长情况。 4. 培养基利用率高。
细胞生长繁殖过程中的代谢废物都属 小分子物质，可从管壁渗进“内 室” 。 一般细胞在接种1～3周后，就可以完 全充满管壁的空隙。细胞停止增殖后， 仍可以维持其高水平代谢和分泌功能， 长达几个星期甚至几个月。
优点：
（1）培养器体积小，细胞高密度生长； （2）浓缩产品的功能； （3）产物纯度高； （4）自动化程度高，细胞生长周期长。
3、生产实践方面的应用
（1）在生物医药上的应用 如：单克隆抗体的生产 （2）在微生物构建新菌株方面的应用
原生质体融合也成了微生物育种的重 要手段。乳糖发酵短杆菌和黄色短杆菌是 两种重要的氨基酸生产菌，黄色短杆菌是 赖氨酸高产菌株，但生长缓慢，发酵周期 长，生产中易染菌，将它与生长快的乳糖 发酵短杆菌融合，得到了新的赖氨酸生产 菌，提高了对葡萄糖的转化率，发酵周期 缩短4%。
真核细胞能对其分泌产 物进行修饰，例如二硫键的 形成、糖甲酰化等，使产物 具有完整的生物学功能。
真核细胞可以不断合成和分 泌，不断收获，后加工过程也相 对简单，细胞可以重复利用。因 此，利用培养的动物细胞生产的 生物制品，具有很高的市场价值。
目前利用动物细胞大规模 培养技术可以生产许多有价 值的生物制品，包括重要的 疫苗、高效的治疗药物和灵 敏的诊断试剂等。
大规模动物细胞培养 的生物反应器
1、滚 瓶 系 统
优点：
结构简单、投资少、技术 成熟、重演性好，放大只是简 单地增加滚瓶数。
缺点：
滚瓶系统劳动强度大，单位体 积提供细胞生长的表面积小，占用
空间大，按体积计算细胞产率低，
监测和控制环境条件受到限制。
2、中空纤维管生物反应器
中空纤维管生物反应器用途较广，既可培养悬浮 生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密 度最高可达10６/ml数量级。
植物方面
薯番茄和番茄薯 人们用马铃 薯和番茄通过细胞融合获得杂 种薯番茄和番茄薯 甘蓝型欧洲油菜 用甘蓝和白 菜的细胞融合使两个物种的染 色体组相加，人工合成了甘蓝 型欧洲油菜。
微生物方面
苏云金杆菌能杀玉米螟， 灭蚊球孢菌有杀蚊子的效能， 科学家们将这两种菌的原生质 体融合获得了既能灭蚊又能杀 螟的新菌株。
（5）在发酵工程中的应用
日本科学家把两个不同种类的酵母 强行融合起来，并使融合成的细胞繁殖， 制成新的酵母。这一技术为今后改良酵 母开辟了新途径，把最尖端的生物工程 中的细胞融合办法应用到传统的酿酒技 术中，成为守旧的酿造技术体系革新的 一个起点。
体细胞融合的技术，如 今已在动物间实现了小鼠和 田鼠，小鼠和 小鸡，甚至 于小鼠和人等许多远 缘和 超远缘的体细胞杂交。
这些都是自然进化所不能出 现的新品种，他主要是通过细胞 融合技术来实现的。 细胞融合是细胞工程最基本 的核心技术。
细胞融合（又称体细胞杂交）： 是指用自然或人工方法使 两个或更多个不同的细胞融合 成一个细胞的过程。并使之分 化再生、形成新物种或新品种 的技术。
融合材料
• • 植物或微生物原生质体 动物单个细胞
p-灌注液 h-收获液
i-管内
中空纤维反应器示意图
e-管外
中空纤维培养示意图
中空纤维管生物反应器已进 入工业生产，主要用于培养 杂交瘤细胞产生单克隆抗体。
中空纤维用聚砜或丙烯的聚合物制成。 管壁的厚约 50 ～ 75 μm，海绵状，富含 毛细管。 管径200μm。 管壁是极薄的半透膜。它能截留住分子 量分别为1×104、5×104、10×104道尔 顿三种。
体外大规模培养真核细胞要比 原核细胞困难得多。 无细胞壁，不耐受搅拌，易 破碎，营养要求高，生长条件不 易控制，增殖周期长，产品的产 量低。
原核细胞经基因工程技术所合 成的生物制品，不是分泌型的而 是同细胞相结合的，需要破碎细 胞，释出产物，再经浓缩、纯化； 因后加工过程复杂，而使产品的 得率受到损失。
一个培养筒由数千根中空纤维所组成
内室：每根纤维的管内成为“内室”； 外室：管与管之间的间隙，可灌流无
血清培养液供细胞生长，成为“外 室”。
接种的细胞贴附“外室”的管壁上， 并吸取从“内室”渗透出来养分，迅 速生长繁殖。 培养液中的血清输入到“外室”，由 于血清和细胞分泌产物（如单克隆抗 体）的分子量大而无法穿透到“内室” 去，只能留在“外室”并且不断被浓 缩。
第三讲
细胞工程及其应用
细胞工程是指应用细胞生物学和 分子生物学的方法，通过类似于工程 学的步骤，在细胞整体水平或细胞器 水平上，按照人们的意愿来改变细胞 的遗传特性和生物学特性，以获得新 型生物或特种细胞产品的一门综合性 科学技术。
第一节 细胞融合技术
动物方面
组装鼠 美国耶鲁大学教授马格
特和彼德斯利用黑毛鼠，白毛鼠， 黄毛鼠三种颜色的老鼠的受精卵组 装成披着黄百黑三种颜色的老鼠。 绵山羊 英国和美国还组装成功 了绵羊和山羊的嵌合体，培育出具 有绵羊的卷曲浓密的长毛，山羊式 的仰角的绵山羊，毛肉兼用。
动物细胞大规模培养和表达，对于 生产抗体类蛋白质药物具有明显优势： 1、活性高、稳定性好，占生物技术药物 生产方式的70%以上，能够保证产品中二 硫键多等复杂结构蛋白的活性； 2、效率高、成本低，能够提升生物技术 药物的创新能力和竞争力。 动物细胞大规模培养是当今生物技 术药物生产的主流方式。
目前通过动物细胞培养获得生物 制品的研制，必须依赖3个关键技术的 发展： （1）基因工程和细胞工程的发展； （2）大规模动物细胞培养技术和生物反 应器开发； （3）产品的分离浓缩和提纯技术的提高。
物理法——电融合诱导法
概述：
在直流电脉冲的诱导下，原生质 体质膜表面的电荷和氧化还原电位发 生改变，使异种原生质体黏合并发生 质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接， 直到闭合成完整的膜形成融合体。
细 胞
电脉冲
细胞膜变薄
细胞膜出现微孔
微孔不大
电势不断上升 达到临界膜电势
微孔太大
细胞膜
细胞膜
重新闭合
不能闭合
5. 6. 7. 8.
收获细胞过程不复杂。 放大容易。 劳动强度小。 培养系统占有空间小。 微载体培养细胞是目前公认的 最有发展前途的一种培养模式。
二、动物细胞在微载体上 贴壁生长机理
贴壁依赖动物细胞在微载体表面 上增殖，可分为贴壁、生长和扩展成 单层三个阶段。
ห้องสมุดไป่ตู้
细胞能否在微载体表面贴附， 取决于： 1、细胞与微载体接触的机率 2、细胞与微载体的相融性
5、激素：红细胞生成素（EPO）、
促黄体 生成素（LH）、促滤胞素 （FSH）等。 6、肿瘤特异性抗原：癌胚抗原 （CEA）等。 7、单克隆抗体（MCAB）。 8、病毒杀虫剂：杆状病毒等。
全球销售额最高的6大类生物技术药物：
1、肿瘤治疗药物 2、胰岛素 3、anti-TNF-α药物 4、促红细胞生成素（EPO） 5、β-干扰素 6、凝血因子 这6大类中有5类都是经哺乳动物细胞 表达生产的，只有β-干扰素是大肠杆菌和 酵母表达的。
利用细胞杂交技术来制备工程细胞 生产活性物质的优点：
（1）细胞融合率比较高； （2）操作也比基因工程简单； （3）所产生的蛋白都是已糖基化了的天然蛋白； （4）动物细胞大批量生产技术的发展和改进与细 胞内高效表达体系的建立，为动物细胞工程的蛋 白生产开辟新途径。