最新126分子生物学：基因的体外转录和翻译汇总
基因转录和翻译的分子机制
基因转录和翻译的分子机制基因是生命体的基本单位，在细胞内负责存储和传递遗传信息，并指导着细胞的生长、分化、代谢等各项生命活动。
基因的表达即指基因中所存储的遗传信息通过转录和翻译的过程被转换成蛋白质的过程。
转录和翻译是细胞生命活动的重要组成部分，也是细胞内分子机制的关键环节。
本文将深入探讨基因转录和翻译的分子机制。
一、基因转录的分子机制转录是指DNA序列指导下RNA聚合酶合成RNA的过程。
它至少包括三个阶段：起始、延伸和终止。
首先，RNA聚合酶与DNA结合，并在DNA中寻找起始点。
然后，RNA聚合酶开始合成RNA链，并且在DNA模板链上逐渐向前移动。
最后，在终止信号的帮助下，RNA聚合酶从DNA分离，且新合成的RNA链被释放。
转录的分子机制是十分复杂的，其中多个因素参与其中。
例如，RNA聚合酶需要找到适当的起始点进行转录，而这通常需要一些特殊的序列来标记转录起点。
同时，转录需要大量的转录因子的协作作用，它们可以与RNA聚合酶相互作用，并为其提供适当的修饰和调节。
此外，还有一些其他的因素也会影响转录的成功进行。
例如，DNA甲基化、组蛋白修饰、核小体调节因子等都可以改变基因的表达水平。
另外，一些异常也会出现在转录过程中，导致基因的表达受到影响。
例如，在某些情况下，转录出现了错误的起始点或非正常的延伸速度，会严重影响基因的正确表达。
二、基因翻译的分子机制翻译是指RNA序列指导下蛋白质的生物合成过程。
它是由核糖体负责进行的，是一种高度复杂的过程。
在这个过程中，mRNA作为模板，信息被翻译成相应的氨基酸序列，并组装成蛋白质分子。
翻译的过程主要有三个阶段：启动、延伸和终止。
启动阶段是指核糖体与mRNA起始序列的结合，这是翻译的第一步。
延伸阶段则是翻译的主要过程，核糖体负责将mRNA上的信息翻译成氨基酸序列。
最后，在终止信号帮助下，核糖体停止翻译，并将新合成的蛋白质从RNA链上释放出来。
翻译的过程也是高度复杂的。
分子生物学中的基因转录和翻译
分子生物学中的基因转录和翻译基因是生命的基本单位，是人类、动物和植物的遗传信息载体。
基因可以转录为RNA，并且RNA可以被翻译为蛋白质。
基因转录和翻译是维持细胞和生物体正常生理功能的重要过程。
基因转录基因转录是指DNA水平上的信息传递，即将DNA编码的信息转换为RNA信息，并用来推断蛋白质的氨基酸序列。
基因转录是由RNA聚合酶(RNA polymerase)复制DNA时合成RNA分子的过程，RNA聚合酶会在DNA串内扫描，寻找一段特定的DNA序列，其通常以一个起始站点开始，称为启动子。
在这个地方，RNA聚合酶结合并开始克隆RNA。
这个启动序列通常是由两个特定的功能元件组成。
第一部分是TATA盒(TATA box)，它告诉RNA聚合酶在哪里开始转录。
第二部分是增强子(enhancer)序列，它可以增加基因的表达并协调DNA复制的过程。
完成转录之后，pre-mRNA序列会被剪切并拼接，形成成熟的mRNA。
mRNA可以被转运到细胞质中并参与翻译过程。
转录的主要产物是mRNA，但是转录也可以产生其他类型RNA。
转录的调控是生物体中基因表达的关键控制因素。
细胞可以通过控制RNA聚合酶与DNA的互作、核糖体合成和RNA降解等因素来控制基因转录的发生。
此外，转录的调控还受到一些核酸因子和转录激活因子的影响。
许多疾病，如肿瘤和自身免疫疾病，都与转录调控紊乱有关。
基因翻译基因翻译是指RNA水平上的信息传递，即通过将RNA信息翻译为氨基酸序列，生成蛋白质。
蛋白质质量和结构的确定取决于氨基酸的顺序。
20种不同的氨基酸可以以不同的序列组合来进一步分别形成不同的蛋白质。
蛋白质的信息来源于mRNA，mRNA中通过第三个核苷酸测序，信息被读取为三个核苷酸组成的非重叠密码子的序列。
在翻译过程中，一个RNA分子会通过核糖体与一个氨基酸专一地配对，然后一个又一个的氨基酸加入到正在被构建的多肽链中。
翻译是一个复杂的过程，它涉及到许多因素，如翻译起始和停止位点的识别、翻译调节和后翻译修饰等。
基因的体外转录和翻译 共47页
23.07.2019
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基因体外转录体系在分子生物学和 细胞生物学研究中的用途和意义：
1、快速检测目的基因的转录情况； 2、分析转录因子调节基因转录的过程； 3、分析启动子序列的活性； 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA 剪切因子的组成和作用；
5、染色质结构调整与基因转录的关系；
6、制备RNA探针。
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一、基因体外转录的基本原理
基本原理：以DNA为模板，在无细 胞体系中一系列转录因子的作用下 经RNA聚合酶合成RNA的过程。
质粒DNA
模 板
线性DNA
核小体形式存在的DNA
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能用于体外转录的质粒载体
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基因体外翻译的基本原理 基因体外翻译的基本原理是以基因 转录产物RNA为模板，在核糖体上 进一步生产蛋白质的过程。
基因体外翻译的模板：
1、直接来自体外基因转录实验； 2、细胞内提取的mRNA； 3、通过PCR或RT-PCR产物转录后 的RNA。
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利用不同模板和翻译体系进行翻译
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（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
基因转录和翻译后修饰的生物化学研究
基因转录和翻译后修饰的生物化学研究基因转录和翻译是生物体内关键的两个过程，也是分子生物学的核心研究领域之一。
基因转录和翻译后修饰过程对于生物的正常生长和繁殖起着至关重要的作用，因此，研究这些过程是非常必要的。
一、基因转录基因转录是指将DNA模板复制成RNA分子的过程。
在该过程中，脱氧核糖核酸（DNA）中的信息通过转录过程被复制成核糖核酸（RNA）分子，RNA分子再通过翻译过程被转化为特定的蛋白质。
基因转录的启动基因是RNA聚合酶，其可使RNA从DNA模板上合成RNA分子。
转录的起点是启动子区域，在DNA上，启动子区域携带了转录因子能够结合的序列，这些转录因子可影响RNA聚合酶在启动子上的结合和转录。
基因转录的产物RNA是未成熟的前体RNA，在后续的剪切和修饰过程中，这些RNA会被加工成成熟的mRNA，可以指导翻译过程。
二、翻译过程翻译是指将RNA分子转化为特定的蛋白质的过程。
RNA分子被转录出来后，mRNA分子进一步在核内经历剪切，而后进入核膜孔然后转移到核外，最终升级为可合成特定蛋白质的mRNA，它能够被核糖体识别并利用对应的tRNA实现翻译。
核糖体是由RNA和蛋白质组成的超分子，它能够与mRNA上绑定的tRNA配对，然后通过多肽键形成蛋白质，多肽键起到连接氨基酸的作用。
三、修饰过程RNA修饰是指，mRNA分子在产生之后经历的一系列化学修饰，包括非编码RNA（ncRNA）的化学修饰和编码RNA的剪切修饰。
而在翻译的过程中，则涉及到蛋白质的翻译后修饰。
3.1 ncRNA的化学修饰ncRNA（Non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA分子，包括长非编码RNA、微小RNA和_piwi RNA等。
它们在基因表达调控、染色质修饰和RNA稳定性等方面发挥着重要的作用。
在ncRNA的修饰中，包括乙酰化、甲基化和糖基化等，这些修饰可影响ncRNA的结构、稳定性和功能。
3.2 编码RNA的剪切修饰编码RNA的剪切是指在转录后，mRNA的剪切过程。
分子生物学名词解释汇总
1、central dogma: 它描述了遗传信息的本质：核酸序列可以通过复制、转录、反转录，使之永存或互变，但核酸翻译成蛋白质是单向的，因为核酸序列不能从蛋白质序列中重新得到。
2、replication: DNA双链复制成两个相同的拷贝，这个过程保存和延续了遗传信息。
3、transcription: 一段DNA片段为模板合成RNA的过程。
4、translation: 是在mRNA模板上进行蛋白质合成的过程。
5、reverse transcription: 在逆转录酶的存在下以RNA为模板合成DNA的过程。
6、nucleoid: 细菌中包含基因组的区域，DNA是结合到蛋白质而不是被膜包住。
7、chromosome: 携带很多基因的基因组的分离单位。
每一条染色体包含长的双链DNA分子以及大约等量的蛋白质。
只有在细胞分裂中才可见的形态单位。
8、chromatin: 是真核生物细胞中期细胞核内DNA和蛋白质的复合体。
9、nucleosome: 染色质的基本结构亚基，由约200bp的DNA合组蛋白八聚体所组成。
10、histone: 真核生物中保守的DNA结合蛋白质，是染色质形成的基本亚基，四种组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）形成八聚体核心，而后DNA盘绕其上形成核小体，而核小体不包括组蛋白H1。
11、exon: 断裂基因中，在成熟mRNA产物中存在的任何片段。
12、intron: 一段DNA片段，它转录但通过将其两端的序列（外显子）剪接在一起而被除去出转录物。
13、SNP（单核苷酸多样性）: 指单个核苷酸变化引起的多态性（个体之间的序列差异），大部分的个体之间的遗传差异由此引起。
14、RFLP（限制性片段长度多样性）: 指限制性内切核酸酶所能识别的位点上的遗传差异（例如，靶位点上的碱基改变产生），这些差别引起相关限制性内切核酸酶切割产生不同长度片段。
RELP可用于遗传作图，将基因组与常见的遗传标记联系起来。
分子生物学知识点总结
分子生物学知识点总结分子生物学是研究生物体中分子结构、功能和相互作用的学科。
它在解释细胞和生命现象的分子基础方面发挥着重要作用。
以下是分子生物学的几个核心知识点总结：DNA的结构和功能DNA是生物体中遗传信息的储存和传递的分子。
它由核苷酸组成，每个核苷酸包含一个磷酸基团、一个五碳糖（脱氧核糖）和一个氮碱基。
DNA的双螺旋结构由两股互补的链组成，通过氢键相连。
DNA的功能包括遗传信息的复制、转录和翻译，是细胞遗传信息的储存库。
RNA的结构和功能RNA也是由核苷酸组成的分子，与DNA的结构类似，但包含的糖是核糖，而不是脱氧核糖。
RNA起到多种功能，其中包括转录DNA信息、参与蛋白质合成等。
mRNA是将DNA信息转录成蛋白质合成的模板，tRNA通过与mRNA和氨基酸的配对作用，在翻译过程中帮助氨基酸正确排列。
基因表达调控基因表达调控是细胞根据内外环境调节基因转录和翻译的过程。
它包括转录因子、启动子、启动子结合因子、RNA干扰等。
转录因子结合在DNA上的启动子区域，促进或抑制转录的发生。
通过不同的基因表达调控方式，细胞可以在不同的发育和环境条件下产生不同的蛋白质。
基因突变和遗传疾病基因突变是DNA序列发生突变或改变的现象。
它可以是点突变、插入突变、缺失突变等。
基因突变可能导致蛋白质功能的改变，从而引起遗传疾病。
例如，单基因遗传病如囊性纤维化和苯丙酮尿症，以及复杂遗传病如癌症，都与基因突变有关。
PCR技术聚合酶链反应（PCR）是一种体外扩增DNA的技术，可以从微弱的DNA样本中扩增特定片段。
PCR由三步循环组成：变性、退火和延伸。
它广泛应用于分子生物学研究、基因工程和医学诊断等领域。
基因克隆和DNA测序基因克隆是将特定的DNA片段插入载体DNA（如质粒）中，形成重组DNA分子。
通过基因克隆，可以大量复制目标DNA片段。
DNA 测序是确定DNA序列的过程，它有助于揭示基因的结构和功能，促进遗传学和进化生物学的研究。
分子生物学的基本原理与方法
分子生物学的基本原理与方法分子生物学是研究生物分子结构、功能和相互作用的学科，是现代生物学的重要分支。
本文将介绍分子生物学的基本原理和常用的实验方法。
一、分子生物学的基本原理分子生物学的基本原理是基于遗传物质DNA的复制、转录和翻译过程。
DNA是生物体内的遗传物质，它携带了生物个体的遗传信息。
DNA的复制是指DNA分子通过自我复制过程，使得每个新合成的DNA分子与原始DNA分子具有相同的遗传信息。
转录是指DNA通过酶的作用，产生RNA分子的过程。
转录产生的RNA可以是信使RNA （mRNA）、转运RNA（tRNA）或核糖体RNA（rRNA），这些RNA 分子在翻译过程中发挥重要的作用。
翻译是指RNA分子通过核糖体的作用，将RNA上的密码子翻译成氨基酸序列，合成蛋白质。
分子生物学的基本原理还包括基因的表达调控机制。
基因表达是指基因通过转录和翻译过程产生蛋白质的过程。
在这个过程中，细胞内的信号分子会识别和结合到基因的启动子区域，调控基因的转录水平。
转录因子是一种可以结合到启动子区域的蛋白质，它们可以促进或抑制基因的转录过程。
此外，还有一些表观遗传学的机制，如DNA甲基化和组蛋白修饰等，也参与了基因的表达调控。
二、分子生物学的基本方法1. DNA提取：DNA提取是从生物体组织或细胞中分离纯化DNA的过程。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和柱层析法等。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种用于增加DNA片段数量的方法，它可以在体外通过模拟DNA复制过程，快速地合成大量特定DNA序列。
PCR可以应用于基因检测、DNA序列扩增和基因克隆等领域。
3. 凝胶电泳：凝胶电泳是分子生物学中常用的实验方法，可以将DNA、RNA或蛋白质根据其大小和电荷迁移率分离。
通过观察样品在凝胶上的迁移情况，可以判断目标分子的大小和纯度。
4. 蛋白质表达与纯化：蛋白质表达与纯化是分子生物学中用于获得特定蛋白质的方法。
分子生物学名词解释
中心法则：生物体遗传信息流动途径。
现包括反转录和RNA复制等内容。
复制：是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。
转录：以DNA的一条链的一定区段为模板，按照碱基配对原则，合成一条与DNA链互补的RNA链的过程。
翻译：以mRNA为模板，氨酰-tRNA为原料直接供体，在多种蛋白质因子和酶的参与下，在核糖体上将mRNA分子上的核苷酸顺序表达为有特定氨基酸顺序的蛋白质的过程。
翻译的基本要素：tRNA、核糖体和mRNA顺式作用元件：指调控真核生物结构基因转录的DNA序列，包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和反应元件等。
它们通过与反式作用因子相互作用来发挥转录调控作用。
反式作用因子：指真核基因的转录调节蛋白，包含DNA结合结构域和转录激活结构域。
它们与顺式作用元件、RNA聚合酶相互作用，以及转录因子之间相互协同或者拮抗，反式调控另一基因的转录。
操纵子：原核生物绝大多数基因按照功能相关性成簇串联排列，与启动子、操纵基因等调控元件共同组成一个转录单位，实现协调表达。
（原核生物中控制蛋白质合成的功能单位，包括结构基因和调控部分。
）乳糖操纵子：控制β半乳糖苷酶诱导合成的操纵子。
包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因)，以及结构基因lacZ、lacY和lacA。
在没有诱导物时，调节基因lacI编码阻遏蛋白，与操纵基因O结合后抑制结构基因转录；乳糖的存在可与阻遏蛋白结合诱导结构基因转录，以代谢乳糖。
色氨酸操纵子：控制色氨酸合成的元件之一。
大肠杆菌的色氨酸操纵子有启动子和操纵基因控制一个多顺反子mRNA的转录，控制编码色氨酸生物合成需要的各种酶，另外，还有前导区和衰减区。
当培养基中有足够的色氨酸时，操纵子关闭，，缺乏色氨酸时，操纵子开启。
诱导与阻遏：若调节蛋白和操纵基因结合后，抑制其所调控的基因转录，称阻碍物，反之诱导。
（与调节蛋白结合的效应小分子，辅诱导物）基因表达：指将来自基因的遗传信息合成功能性基因产物的过程。
最新名词解释(分子生物学)
名词解释1.操纵子（operon）：是真核生物基因的一个基本转录单位，由编码序列及上游的调控序列组成。
编码序列通常包括几个功能相关的结构基因，调控序列由启动序列（启动子），操纵序列（操纵基因）及其他调节序列构成。
2.顺式作用元件（cis-acting element）：是真核基因表达是调控转录过程的特殊DNA序列，以转录因子结合而起作用，通常包括启动子，增强子，沉默子等。
3.反式作用因子（trans-acting factor）：与其他基因的顺式作用元件结合，调节基因转录活性的蛋白质因子，根据其功能不同可分为基本转录因子和特异性转录因子。
4.启动子（promoter）：位于结构基因上游，与RNA聚合酶识别，结合的特异DNA 序列，与基因转录起始有关。
5.增强子（enhancer）：指决定基因的时间，空间特异性表达，增强启动子的转录活性的特殊DNA序列，作用特点是无方向性，位置或距离不固定。
6.沉默子（silencer）：某些基因含有负性调节原件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。
7.基因表达调控（regulation of gene expression）：指细胞或生物体在接受环境信号刺激时或适应环境变化的过程中在基因表达水平上做出应答的分子机制。
8.基因重组（gene recombination）：DNA片段在细胞内、细胞间、甚至是在不同物种之间进行交换，重组后具有复制和表达功能。
9.基因工程：按照人为预愿获得目的基因，与载体拼接形成重组体，重组体转入宿主细胞，筛选和鉴定出含阳性重组体宿主细胞，经大量增殖，最总获得该目的基因决定的大量表达产物的过程。
10.同源重组（homologous recombination）：发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称基因重组。
11.DNA克隆：在体内对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入适当细胞内，使其在细胞内扩增和繁殖，从而获得该DNA分子大量拷贝的过程，又叫基因克隆或重组DNA技术。
基因的体外转录和翻译
2020年4月28日星期二
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收集细胞核：沉淀用细胞分离液洗1次， 550g离心8min，收集细胞核沉淀。
裂解细胞核：取沉淀重悬于原体积 1/100的细胞核裂解液中，搅拌30min， 100000g离心30min。
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核提取物的浓缩：测上清体积，按1ml 上清液加入0.33g硫酸铵粉末。 5~10min内缓慢加入并搅拌30min。 100000g离心15min沉淀蛋白。沉淀物
30min。
2020年4月28日星期二
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(4)收集核提取物：25000g离心 30min，收集上清液后，用缓冲液 透析2h后，4℃，25000g离心20min， 上清液置-70℃保存。
(5)核提取物的蛋白定量：核抽提物 总蛋白浓度采用Bradford法测定， 以牛白蛋白为参照。
2020年4月28日星期二
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利用不同模板和翻译体系进行翻译
时，应匹配相应的翻译起始序列。 如用原核细胞翻译体系时RNA模板 应含有SD序列，应用真核翻译体 系时，应有帽子结构；在RNA的3ˊ 未端含有合适的终止信号。
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基因体外翻译的基本实验流程
体外翻译系统的制备：该系统为基 因体外翻译提供必要的条件。
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体外翻译的实验方法主要用于：
1、基因产物的快速确定； 2、基因突变体的快速和分析；
3、蛋白质活性研究； 4、众多基因产物的同时表达； 5、大分子间的相互作用； 6、影响翻译过程的物质检出；
7、表达对细胞有毒性的蛋白和易
于被细胞内蛋白酶降解的蛋白和形
分子生物学名词解释汇总
1、central dogma: 它描述了遗传信息的本质：核酸序列可以通过复制、转录、反转录，使之永存或互变，但核酸翻译成蛋白质是单向的，因为核酸序列不能从蛋白质序列中重新得到。
2、replication: DNA双链复制成两个相同的拷贝，这个过程保存和延续了遗传信息。
3、transcription: 一段DNA片段为模板合成RNA的过程。
4、translation: 是在mRNA模板上进行蛋白质合成的过程。
5、reverse transcription: 在逆转录酶的存在下以RNA为模板合成DNA的过程。
6、nucleoid: 细菌中包含基因组的区域，DNA是结合到蛋白质而不是被膜包住。
7、chromosome: 携带很多基因的基因组的分离单位。
每一条染色体包含长的双链DNA分子以及大约等量的蛋白质。
只有在细胞分裂中才可见的形态单位。
8、chromatin: 是真核生物细胞中期细胞核内DNA和蛋白质的复合体。
9、nucleosome: 染色质的基本结构亚基，由约200bp的DNA合组蛋白八聚体所组成。
10、histone: 真核生物中保守的DNA结合蛋白质，是染色质形成的基本亚基，四种组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）形成八聚体核心，而后DNA盘绕其上形成核小体，而核小体不包括组蛋白H1。
11、exon: 断裂基因中，在成熟mRNA产物中存在的任何片段。
12、intron: 一段DNA片段，它转录但通过将其两端的序列（外显子）剪接在一起而被除去出转录物。
13、SNP（单核苷酸多样性）: 指单个核苷酸变化引起的多态性（个体之间的序列差异），大部分的个体之间的遗传差异由此引起。
14、RFLP（限制性片段长度多样性）: 指限制性内切核酸酶所能识别的位点上的遗传差异（例如，靶位点上的碱基改变产生），这些差别引起相关限制性内切核酸酶切割产生不同长度片段。
RELP可用于遗传作图，将基因组与常见的遗传标记联系起来。
分子生物学名词解释
是指对基因表达过程的调节。
可诱导调节：
是指一些基因在某些代谢物的诱导下使其活化，由原来的关闭状态转变为开放状态。
如：
大肠杆菌的乳糖操纵子。3可阻遏调节：
是指一些基因由于某些代谢物的积累，而使其由原来的开放状态转变为关闭状态。
如：
色氨酸操纵子。
可诱导的操纵子：
是一些编码糖和氨基酸分解代谢蛋白的基因。
增强子：
真核生物中提高启动子效率的顺式作用元件，可以不同的方向，在相对于启动子的任何位置发挥作用。
反式作用因子:
指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质，也叫转录因子。
同源域：
是指编码60个保守氨基酸序列的DNA片段，广泛存在于真核生物基因组内。
应答元件：
可阻遏的操纵子：
是一些合成各种细胞代谢过程中所必须的小分子物质。
葡萄糖效应或降解物抑制作用：
细菌培养基中在葡萄糖存在的情况下，即使加入乳糖、半乳糖等诱导物，与其对应的操纵子也不会启动，这种现象称为葡萄糖效应或降解物抑制作用。
诱导物：
如果某物质能促使细胞产生一特定的酶，该物质就叫做诱导物。
辅阻遏物：
如果某物质能阻止细胞产生一特定的酶，该物质就叫做辅阻遏物。
断裂基因：
真核生物基因除了与mRNA相对应的编码序列外，还含有一些不编码的序列插在编码序列之间，这些非编码序列在加工为成熟的mRNA时被去除。这样的结构基因称为断裂基因。
外显子：
基因中与mRNA一致的序列，即编码序列，称为外显子。一个基因总是以外显子为起点和终点。
内含子：
基因中编码序列之间的介入序列，在原初转录物加工为mRNA时被去除，即非编码序列，称为内含子。4组成性剪接：
分子生物学：基因的体外转录和翻译ppt课件
2019/12/19
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(4)收集核提取物：25000g离心 30min，收集上清液后，用缓冲液 透析2h后，4℃，25000g离心20min， 上清液置-70℃保存。
(5)核提取物的蛋白定量：核抽提物 总蛋白浓度采用Bradford法测定， 以牛白蛋白为参照。
2019/12/19
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（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
缺点：分离过程中一些特殊的试剂 破坏了细胞核膜，造成核内容物的 部分流失及操作过程中精胺易使 DNA模板产生沉淀
2019/12/19
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过程：
收集细胞：收集一定数量的培养细 胞，300g离心5min，沉淀用分离 液清洗2次。 裂解细胞纯化细胞核：沉淀中加入 预冷的匀浆液1/10(原体积)，冰浴 10min后，匀浆，镜检，至90%细
5、染色质结构调整与基因转录的关系；
6、制备RNA探针。
2019/12/19
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基因体外转录体系
DNA模板：含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
2019/12/19
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细胞核抽提物的制备：
2019/12/19
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什么是基因的体外转录和翻译
基因的体外转录和翻译是20世纪70 年代发展起来的一项分子生物学和 细胞生物学实验技术，是研究离体 条件下(非细胞体系)基因表达情况 的理想体系。
分子生物学名词解释最全
分子生物学名词解释最全第一章名词解释1.基因（gene）是贮存遗传信息的核酸（DNA或RNA）片段，包括编码RNA和蛋白质的结构基因以及转录调控序列两部分。
2. 结构基因（structural gene）指基因中编码RNA和蛋白质的核苷酸序列。
它们在原核生物中连续排列，在真核生物中则间断排列。
3.断裂基因（split gene真核生物的结构基因中，编码区与非编码区间隔排列。
4. 外显子（exon）指在真核生物的断裂基因及其成熟RNA中都存在的核酸序列。
5.内含子（intron）指在真核生物的断裂基因及其初级转录产物中出现，但在成熟RNA中被剪接除去的核酸序列。
6.多顺反子RNA（polycistronic/multicistronic RNA）一个RNA分子上包含几个结构基因的转录产物。
原核生物的绝大多数基因和真核生物的个别基因可转录生成多顺反子RNA。
7.单顺反子RNA（monocistronic RNA）一个RNA分子上只包含一个结构基因的转录产物。
真核生物的绝大多数基因和原核生物的个别基因可转录生成单顺反子RNA。
8. 核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA, hnRNA）是真核生物细胞核内的转录初始产物，含有外显子和内含子转录的序列，分子量大小不均一，经一系列转录后加工变为成熟mRNA。
9. 开放阅读框（open reading frame, ORF）mRNA分子上从起始密码子到终止密码子之间的核苷酸（碱基）序列，编码一个特定的多肽链。
10.密码子（codon） mRNA分子的开放读框内从5' 到3' 方向每3个相邻的核苷酸（碱基）为一组，编码多肽链中的20种氨基酸残基，或者代表翻译起始以及翻译终止信息。
21.无义突变（nonsense mutation）基因突变使原来编码某种氨基酸的密码子变为终止密码子，导致多肽链合成提前终止。
22.移码突变（frame-shifting mutation）基因的缺失突变或插入突变引起三联体密码阅读的方式发生改变，编码出具有不同一级结构的多肽链。
基因的体外转录与翻译
2020年10月10日星期六
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Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法 约高四倍，这是因为蛋白质与染料 结合后产生的颜色变化很大，蛋白 质－染料复合物有更高的消光系数， 因而光吸收值随蛋白质浓度的变化 比Lowry法要大的多。
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（2）测定快速、简便，只需加一种 试剂。完成一个样品的测定，只需 要5分钟左右。由于染料与蛋白质结 合的过程，大约只要2分钟即可完成， 其颜色可以在1小时内保持稳定，且 在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定 性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严格地控制时间。
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（2）仍有一些物质干扰此法的测 定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1N的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性， 因而不能用Beer定律进行计算，而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
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3、分离得到的细胞核比较纯且没有核蛋 白的流失。
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体外基因转录反应
体外基因转录一般用硅化的1.5ml塑 料管，在24~32℃条件下进行，为 了保证产物的稳定，反应体系中必 须加入RNase抑制剂，终止反应时，
可加入蛋白酶以降解核提取物中的 RNase。同时加入酵母tRNA作为产 物RNA的载体起到保护作用。反应
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利用不同模板和翻译体系进行翻译
时，应匹配相应的翻译起始序列。 如用原核细胞翻译体系时RNA模板 应含有SD序列，应用真核翻译体 系时，应有帽子结构；在RNA的3ˊ 未端含有合适的终止信号。
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分子生物学名词解释--英汉双译
●Anticodon反密码子：tRNA反密码环中部的碱基三联体，可以识别mRNA上相应的密码子。
●Antisense strand/Template strand反义链/模板链：在DNA双链中，根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链，也称负链。
●Attenuator弱化子：在trp mRNA 5’端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段，称为前导区，在有色氨酸存在时，mRNA的转录总是在123-150这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子。
因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子（attenuator）。
●C-value C值：在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA总量是恒定的，即C值。
●C-value paradox C值悖论：指物种进化程度与C值大小不相关的现象。
●Central dogma中心法则：是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。
也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。
这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。
在某些病毒中的RNA自我复制和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程是对中心法则的补充。
如图：●Cis-acting element顺势作用元件：可影响自身基因表达活性的DNA序列。
通常是非编码序列，包括启动子、增强子等。
●Cistron顺反子：编码一个多肽的mRNA称顺反子。
●Codon密码子：又称三联体密码（triplet code）,是mRNA分子中编码一个氨基酸的三个相邻的核苷酸。
●Commaless连续性：编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。
●Complexity复杂度：指核酸或DNA的每一个单一序列所含的碱基对数。
●Core promoter核心启动子：指RNA聚合酶精确起始转录所必需的序列元件。
分子生物学复习题
1、分子生物学的定义。
从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。
2、简述分子生物学的主要研究内容。
a.DNA重组技术（基因工程）（1）可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽 ;（2）可用于定向改造某些生物的基因组结构 ;（3）可被用来进行基础研究b.基因的表达调控在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。
c.生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学）一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能时，必须具备两个前提：(1)拥有特定的空间结构（三维结构）；(2)发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。
结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。
它包括3个主要研究方向：(1) 结构的测定 (2) 结构运动变化规律的探索 (3) 结构与功能相互关系d.基因组、功能基因组与生物信息学研究3、谈谈你对分子生物学未来发展的看法？(1)分子生物学的发展揭示了生命本质的高度有序性和一致性，是人类认识论上的重大飞跃。
生命活动的一致性，决定了二十一世纪的生物学将是真正的系统生物学，是生物学范围内所有学科在分子水平上的统一。
(2)分子生物学是目前自然学科中进展最迅速、最具活力和生气的领域，也是新世纪的带头学科。
(3)分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以及信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，同时也推动这些学科的发展。
(4)分子生物学涉及认识生命的本质，它也就自然广泛的渗透到医学、药学各学科领域中，成为现代医药学重要的基础。
1、DNA双螺旋模型是哪年、由谁提出的?简述其基本内容。
DNA双螺旋模型在1953年由Watson和Crick提出的。
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释1。
分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。
2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。
3。
连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。
4。
预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。
5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。
首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。
6。
稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。
7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型,推测相应基因的功能。
8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb）作为基本测量单位(图距）的基因组图。
9。
质谱图 :不同质荷比的离子经质量分析器分开后,到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形.10。
侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11。
离子交换层析：是以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的层析。
12。
Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程.13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。
14。
电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。
15。
多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程.16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签(Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达),方便后继的纯化步骤或者检测.17。
分子生物学：转录和翻译的相互作用教案
本教案主要关注分子生物学中转录和翻译的相互作用，旨在帮助学生掌握这一重要概念，并有效地应用于分子生物学的研究中。
一、教材概述1.1 教材名称：分子生物学：转录和翻译的相互作用1.2 教材目的：帮助学生掌握基础的分子生物学知识，在研究和应用分子生物学方法时能够更好地理解和应用转录和翻译的相互作用。
1.3 教材内容：1.3.1 转录的概念和机制1.3.2 基因的结构和功能1.3.3 RNA的生物学功能和调控1.3.4 翻译的概念和机制1.3.5 蛋白质结构和功能1.3.6 基因表达调控1.4 教材特点：1.4.1 直观易懂、理论与实践结合1.4.2 知识点把握准确、侧重能力培养1.4.3 内容全面、深入浅出1.5 教材评价：本教材是一本思路清晰、逻辑严密的分子生物学教材，具有较高的教学适用性和学科准确度。
二、教学目标2.1 知识层面：2.1.1 理解转录和翻译的概念和机制2.1.2 了解基因的结构和功能2.1.3 掌握RNA的生物学功能和调控2.1.4 理解蛋白质结构和功能2.1.5 了解基因表达调控的机制2.2 能力层面：2.2.1 能够用分子生物学方法研究和分析基因表达调控2.2.2 能够设计和实施基因编辑和转染实验2.2.3 能够解读和撰写分子生物学实验的结果和报告三、教学要点3.1 转录的概念和机制3.1.1 概念：转录是DNA到RNA的过程。
3.1.2 机制：由RNA聚合酶将DNA的模板链上的核苷酸通过磷酸二酯键形成RNA，形成的RNA分子与DNA的模板链互补。
3.2 基因的结构和功能3.2.1 概念：基因是DNA序列，决定了生物体的结构和功能。
3.2.2 结构：由启动子、转录起始位点、外显子、内含子、转录终止位点、多个调控序列构成。
3.2.3 功能：通过编码蛋白质、RNA的形式来实现其生物学功能。
3.3 RNA的生物学功能和调控3.3.1 生物学功能：mRNA、tRNA、rRNA等RNA的生物学功能。
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增强子等顺式作用元件外，还需各
种反式作用元件的参与。
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基因体外转录体系
DNA模板：含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
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细胞核抽提物的制备：
细胞核抽提物：DNA转录由RNA聚合酶、 各种转录因子及必要的环境条件等，这 一切必需由细胞提供。常用于制备细胞 核抽提物的细胞有酵母细胞、兔网织红 细胞和Hela细胞
1、快速检测目的基因的转录情况； 2、分析转录因子调节基因转录的过程； 3、分析启动子序列的活性； 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA 剪切因子的组成和作用；
5、染色质结构调整与基因转录的关系；
6、制备RNA探针。
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一、基因体外转录的基本原理
基本原理：以DNA为模板，在无细 胞体系中一系列转录因子的作用下 经RNA聚合酶合成RNA的过程。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰 法（Bradford法），是根据蛋白质与 染料相结合的原理设计的。这种蛋 白质测定法具有超过其他几种方法 的突出优点，因而正在得到广泛的 应用。这一方法是目前灵敏度最高 的蛋白质测定法。
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考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液 中与蛋白质结合，使染料的最大吸收 峰的位置（lmax），由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为 兰色。经研究认为，染料主要是与蛋 白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸） 和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与 蛋白质浓度成正比。
1、一般方法
优点：细胞核完整、内含物丰富
缺点：在分离的细胞核中可能存 在少量细胞质106/ml的培养细胞 20ml，1500rpm离心5min，用新配制的 0.01mol/LPBS洗涤，收集细胞。 (2)低渗液裂解细胞并纯化细胞核：将收
集的细胞迅速加入原体积1/10的低渗缓
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第一节 基因的体外转录
• 一、基因体外转录的目的和意义 • 基因的体外转录体系最早由Pelham和
Jakson于1976年创立的，经很多实验室的 不断修订和改进，现已成为一项成熟的分 子生物学和细胞生物学技术，已被多家试 剂公司提供标准的实验程序。
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基因体外转录体系在分子生物学和 细胞生物学研究中的用途和意义：
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(3)裂解细胞核：向细胞核沉淀中加
入2倍体积的低盐缓冲液(20mmol/L
HEPES，pH 7.9，25％甘油，
1.5mmol/L MgCl2，20mmol/L KCl，
0.2mmol/L EDTA，0.2mmol/L PMSF，
0.5mmol/L DTT)，冰浴10min，用玻 璃匀浆器匀浆。滴加入2倍核沉淀 体积的高盐缓冲液冰浴 轻轻搅拌
30min。
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(4)收集核提取物：25000g离心 30min，收集上清液后，用缓冲液 透析2h后，4℃，25000g离心20min， 上清液置-70℃保存。
(5)核提取物的蛋白定量：核抽提物 总蛋白浓度采用Bradford法测定， 以牛白蛋白为参照。
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附：Bradford法测蛋白含量
126分子生物学：基因的体外转 录和翻译
基因表达包括：转录和翻译两个过 程。
基因表达的调控包括：染色体结构 的调节、DNA结构的调节、转录过 程的调控、转录后的调控、翻译过 程的调控及翻译后的调控。
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基因体外转录和翻译的作用：为研 究基因转录和蛋白质翻译提供了一 个十分理想实验体系和技术平台及 找到了一个研究与探讨转录和翻译 这两个复杂的现象的重要手段和方 法。
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（2）仍有一些物质干扰此法的测 定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1N的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性， 因而不能用Beer定律进行计算，而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
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2、精胺－亚精胺混合物改进法 优点：分离到的细胞核比较纯净
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Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法 约高四倍，这是因为蛋白质与染料 结合后产生的颜色变化很大，蛋白 质－染料复合物有更高的消光系数， 因而光吸收值随蛋白质浓度的变化 比Lowry法要大的多。
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（2）测定快速、简便，只需加一种 试剂。完成一个样品的测定，只需 要5分钟左右。由于染料与蛋白质结 合的过程，大约只要2分钟即可完成， 其颜色可以在1小时内保持稳定，且 在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定 性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严格地控制时间。
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（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
质粒DNA
模 板
线性DNA
核小体形式存在的DNA
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能用于体外转录的质粒载体
转录的必要条件：无论是真核细胞
的转录体系还是原核细胞的转录体
系，基因转录时都必须有启动子序
列，且该序列能被转录体系识别。
原核细胞体外转录体系常用的启动
子有T3、T7及SP6启动子。
真核细胞体外转录体系除需启动子，
冲液[0.01mmol/ L HEPES(4－羟基乙基哌
嗪乙磺酸) pH 7.9,10mmol/LKCl，
1.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，0.2mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)]，冰浴30min，用 玻璃匀浆器匀浆，3000rpm离心15min 得细胞核沉淀。
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缺点：分离过程中一些特殊的试剂 破坏了细胞核膜，造成核内容物的 部分流失及操作过程中精胺易使 DNA模板产生沉淀