最新126分子生物学:基因的体外转录和翻译汇总

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2024版分子生物学常用技术共35张

2024版分子生物学常用技术共35张

电泳法
在电场作用下,利用蛋白质带电 性质和分子大小的差异进行分离, 如SDS-PAGE、双向电泳等。
亲和层析法
利用生物分子间的特异性相互作 用进行分离纯化,如免疫亲和层 析、金属螯合亲和层析等。
蛋白质鉴定和定量分析手段
质谱法
通过测量蛋白质分子的质 量和碎裂模式进行鉴定和 定量分析,如MALDI-TOF MS、LC-MS/MS等。
03
基因表达分析
利用基因芯片、RNA-seq等技术, 检测信号传导途径相关基因的表 达变化。
非受体介导信号传导途径研究方法
细胞内钙离子浓度检测
利用荧光探针等技术,实时监测细胞内钙离子浓度的变化。
氧化还原状态检测
通过检测细胞内氧化还原状态相关指标,如NADPH/NADP+比值、 谷胱甘肽水平等,评估非受体介导信号传导途径的活性。
数据库使用
通过在线访问或下载数 据,进行序列分析、基 因注释、比较基因组学 等研究。
序列比对和拼接算法原理及工具使用
序列比对算法
Smith-Waterman算法、BLAST算法等,用于寻找两个或多个 序列之间的相似性或同源性。
序列拼接算法
Overlap-Layout-Consensus(OLC)、de Bruijn图等,用于 将多个短序列拼接成长序列。
03
核酸测序技术
Sanger测序法原理及操作流程

分子生物学中的基因转录和翻译

分子生物学中的基因转录和翻译

分子生物学中的基因转录和翻译基因是生命的基本单位,是人类、动物和植物的遗传信息载体。基因可以转录为RNA,并且RNA可以被翻译为蛋白质。基因转

录和翻译是维持细胞和生物体正常生理功能的重要过程。

基因转录

基因转录是指DNA水平上的信息传递,即将DNA编码的信息转换为RNA信息,并用来推断蛋白质的氨基酸序列。

基因转录是由RNA聚合酶(RNA polymerase)复制DNA时合成RNA分子的过程,RNA聚合酶会在DNA串内扫描,寻找一段特

定的DNA序列,其通常以一个起始站点开始,称为启动子。在这

个地方,RNA聚合酶结合并开始克隆RNA。这个启动序列通常是由两个特定的功能元件组成。第一部分是TATA盒(TATA box),

它告诉RNA聚合酶在哪里开始转录。第二部分是增强子(enhancer)序列,它可以增加基因的表达并协调DNA复制的过程。

完成转录之后,pre-mRNA序列会被剪切并拼接,形成成熟的mRNA。mRNA可以被转运到细胞质中并参与翻译过程。转录的主要产物是mRNA,但是转录也可以产生其他类型RNA。

转录的调控是生物体中基因表达的关键控制因素。细胞可以通过控制RNA聚合酶与DNA的互作、核糖体合成和RNA降解等因素来控制基因转录的发生。此外,转录的调控还受到一些核酸因子和转录激活因子的影响。许多疾病,如肿瘤和自身免疫疾病,都与转录调控紊乱有关。

基因翻译

基因翻译是指RNA水平上的信息传递,即通过将RNA信息翻译为氨基酸序列,生成蛋白质。

蛋白质质量和结构的确定取决于氨基酸的顺序。20种不同的氨基酸可以以不同的序列组合来进一步分别形成不同的蛋白质。蛋白质的信息来源于mRNA,mRNA中通过第三个核苷酸测序,信息被读取为三个核苷酸组成的非重叠密码子的序列。在翻译过程中,一个RNA分子会通过核糖体与一个氨基酸专一地配对,然后一个又一个的氨基酸加入到正在被构建的多肽链中。

基因转录与翻译的分子生物学机制研究

基因转录与翻译的分子生物学机制研究

基因转录与翻译的分子生物学机制研究

基因转录与翻译是生命活动的重要过程,它们的分子生物学机

制一直是生物学界研究的热点。基因转录是指DNA的序列被转录

成RNA的过程,而翻译则是指RNA上的信息被翻译成蛋白质的

过程。下面将详细介绍这两个过程的分子机制。

一、基因转录的分子机制

基因转录是由RNA聚合酶(RNA polymerase)介导的。RNA

聚合酶是一种酶,它能够将DNA模板上的信息转录成RNA序列。RNA聚合酶的活性取决于许多因素,最为重要的是转录因子的结合。转录因子是一种蛋白质,它能够结合在DNA上,从而启动或

抑制基因的转录。转录因子主要由启动子(promoter)和增强子(enhancer)两类构建。

启动子是指位于基因的上游区域的DNA序列,它能够吸引

RNA聚合酶和其他转录因子的结合,从而启动基因的转录。增强

子则是指位于基因附近的DNA序列,它能够增强启动子的功能,

促进基因的高水平表达。RNA聚合酶在启动子和增强子的作用下

开始转录DNA模板,不断延伸RNA链,直到到达终止序列,再

停止转录。

二、翻译的分子机制

翻译是指将RNA上的信息翻译成氨基酸序列的过程。它是由核糖体(ribosome)介导的。核糖体是一种由蛋白质和RNA组成的大分子复合物,它能够将RNA上的信息翻译成蛋白质序列。核糖体的翻译过程主要包括三个步骤:启动、延伸和终止。

翻译的启动是由启动子序列指导的。在RNA的5'端,存在一个短序列,它被称为“启动子”(AUG),它是翻译的起始点。当核糖体识别到该序列时,它便会沿着RNA链在其上游结合,并在其下游开始翻译。

分子生物学如何研究基因的表达和调控

分子生物学如何研究基因的表达和调控

分子生物学如何研究基因的表达和调控

随着科技的不断进步和发展,分子生物学在遗传学领域中的研究日渐深入,基因的表达和调控是其研究的核心问题之一。本文主要旨在探讨分子生物学如何研究基因的表达和调控,以及分子生物学在这一领域中的应用。

一、基因的表达

基因的表达是指基因在细胞中发挥作用的过程,它是一个复杂的过程,包括基因转录和翻译两个过程。转录是指DNA序列转换成RNA序列的过程,其中的RNA主要有mRNA、tRNA和rRNA 等。翻译是指mRNA序列被翻译成蛋白质的过程,蛋白质是构成生命体细胞生物体化学活性的关键分子。

对于基因表达过程,分子生物学采用了一系列的技术手段进行研究,如常规的RNA/DNA杂交分析、Northern/Southern/Western blot分析、定量PCR分析、蛋白质质谱分析等。这些技术手段不仅可以研究基因的表达水平和模式,也可以检测基因的突变、拷贝数变化等。

二、基因的调控

基因的表达是一个受到多种因素调控的复杂过程,包括转录因

子的特异性结合、组蛋白修饰、DNA甲基化等。在这些调控过程中,转录因子起着重要作用。

转录因子是指与DNA序列有特异性结合并调控基因转录的蛋

白质,它们主要通过结合DNA序列上的调控元件来对基因的表达

进行调控。一个基因可以被多个转录因子调控,同样一个转录因

子也可以调控多个基因。

调控元件是指DNA序列上识别和结合转录因子的区域,包括

启动子、增强子、沉默子、基础子等。启动子是指位于基因转录

开始位点上游的区域,是转录复合体的结合点。增强子是指与启

动子相邻的DNA区域,它通过转录因子的结合增强启动子的活性。沉默子是指细胞中的某些DNA序列,当转录因子结合沉默子时,

分子生物学名词解释汇总

分子生物学名词解释汇总

1、central dogma: 它描述了遗传信息的本质:核酸序列可以通过复制、转录、反转录,使之永存或互变,但核酸翻译成蛋白质是单向的,因为核酸序列不能从蛋白质序列中重新得到。

2、replication: DNA双链复制成两个相同的拷贝,这个过程保存和延续了遗传信息。

3、transcription: 一段DNA片段为模板合成RNA的过程。

4、translation: 是在mRNA模板上进行蛋白质合成的过程。

5、reverse transcription: 在逆转录酶的存在下以RNA为模板合成DNA的过程。

6、nucleoid: 细菌中包含基因组的区域,DNA是结合到蛋白质而不是被膜包住。

7、chromosome: 携带很多基因的基因组的分离单位。每一条染色体包含长的双链DNA分子以及大约等量的蛋白质。只有在细胞分裂中才可见的形态单位。

8、chromatin: 是真核生物细胞中期细胞核内DNA和蛋白质的复合体。

9、nucleosome: 染色质的基本结构亚基,由约200bp的DNA合组蛋白八聚体所组成。

10、histone: 真核生物中保守的DNA结合蛋白质,是染色质形成的基本亚基,四种组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)形成八聚体核心,而后DNA盘绕其上形成核小体,而核小体不包括组蛋白H1。

11、exon: 断裂基因中,在成熟mRNA产物中存在的任何片段。

12、intron: 一段DNA片段,它转录但通过将其两端的序列(外显子)剪接在一起而被除去出转录物。

13、SNP(单核苷酸多样性): 指单个核苷酸变化引起的多态性(个体之间的序列差异),大部分的个体之间的遗传差异由此引起。

分子生物学中的转录和翻译过程

分子生物学中的转录和翻译过程

分子生物学中的转录和翻译过程转录和翻译是分子生物学中的两个重要过程。转录是指从

DNA模板合成RNA分子的过程,其中RNA作为信息的中介传递

到细胞内的核外,然后供翻译使用。翻译是指将RNA翻译成蛋白

质序列的过程,是生命体系中产生多种功能蛋白质的基础。本文

将分别介绍这两个过程的机制和重要性。

一、转录过程

转录是一种基因表达过程,它涉及到模板DNA的开放和RNA

合成。本质上,转录是一种DNA依赖性RNA合成过程,能够启

动生物体内大多数核苷酸序列的表达。相比DNA,RNA分子更易于合成和分解,并且具有许多不同类型:传递RNA(tRNA)、转运RNA(rRNA)和信使RNA(mRNA)等。

转录过程的主要步骤如下:

1. 启动子序列的结合:RNA聚合酶必须与某种DNA序列结合

才能启动合成RNA的过程。启动子序列通常位于基因的起始位置,用于指示RNA酶具体在哪一片段开始转录。

2. 开链:RNA酶从DNA双链中打开某一区段,从而产生一个

开放的DNA单链。该单链被稳定地保护,以避免在转录期间被其

他元件损坏。

3. 合成RNA:RNA聚合酶沿着单链DNA向前移动,并利用进入口处的核苷酸再合成一个反义核苷酸链的RNA分子。RNA聚

合酶仅将核苷酸添加到5'末端,仅被用作RNA合成起始部分的碱

基标志在3'末端停止合成。整个过程持续到RNA合成末端的终止

序列,然后RNA成品释放,并RNA聚合酶从DNA模板中离开。

二、翻译过程

翻译是将RNA序列转化为蛋白质的序列的过程,可以分为三

个主要步骤:启动、延长和终止。启动从AUG(起始)密码子开始,在三联码(一种由三个核苷酸组成的密码子,每个三联码都

基因转录和翻译调控的分子机制

基因转录和翻译调控的分子机制

基因转录和翻译调控的分子机制

在生物学中,基因转录和翻译调控是非常重要的过程。通过这些过程,细胞可以在多种生理和环境条件下应对不同的情况。这篇文章将探讨基因转录和翻译调控的分子机制。

一、基因转录

基因转录是指DNA编码的信息被转录成RNA。这一过程的关键步骤是RNA 聚合酶(RNAP)与DNA交互并从3'端向5'端移动。过程中,RNAP能够转录出一个完整的RNA链。RNA链会延伸至终止密码子,然后与RNAP分离。

基因转录的调控方法主要包括两种:正向调控和负向调控。正向调控是指转录因子(TF)与启动子相互作用,增强RNAP与DNA的结合,促进基因转录。负向调控则是TF与DNA结合,阻止转录复合物的形成,从而抑制基因转录。这样的调控方式可以帮助细胞精准地控制基因转录速率,满足生物体在不同生理状态下的需求。

二、RNA后转录修饰

一旦RNA链被合成出来,它还需要接受后转录修饰,包括剪切、剪接、3'端加工、m6A修饰等等。这些修饰合成成的RNA能够具有不同的功能。

例如,预mRNA(处理前的mRNA)在被剪切时会去掉内含子部分,成为可翻译的mRNA。这一过程中,剪接酶会在内含子的边界处行使其功能,从而导致mRNA的剪切。这种修饰方式可以帮助细胞控制不同基因的表达,从而在不同生理条件下起到调节效果。

三、翻译

翻译是指mRNA被转录成蛋白质。翻译发生在核糖体中,通过Chopin和Philips的实验,发现了核糖体与mRNA的结合是非常重要的。核糖体能够从5'端

开始读取mRNA上编码的密码子,进行翻译。

翻译的过程中,tRNA会携带特定的氨基酸,与mRNA上的密码子对应。这样,核糖体可以保证正确地输出蛋白质。这一过程中存在大量的转录因子,它们基于强弱的作用力和生物体中的需要来控制翻译的速度和质量。

基因的体外转录和翻译

基因的体外转录和翻译

2020年4月28日星期二
36
(3)裂解液4℃下搅动5min,16000g 离心15min后,上清液即为细胞裂解 物。
细胞的主要来源:酵母细胞、麦芽
组织细胞、兔网织红细胞和Hela细 胞。
2020年4月28日星期二
37
2、细胞核糖体的分离:
(1)收集一定数量的成纤维细胞,迅
速放于冰上,4℃ 600g离心10min,
2020年4月28日星期二
16
Bradford法的突出优点是: (1)灵敏度高,据估计比Lowry法 约高四倍,这是因为蛋白质与染料 结合后产生的颜色变化很大,蛋白 质-染料复合物有更高的消光系数, 因而光吸收值随蛋白质浓度的变化 比Lowry法要大的多。
2020年4月28日星期二
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(2)测定快速、简便,只需加一种 试剂。完成一个样品的测定,只需 要5分钟左右。由于染料与蛋白质结 合的过程,大约只要2分钟即可完成, 其颜色可以在1小时内保持稳定,且 在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定 性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严格地控制时间。
2020年4月28日星期二
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体外转录方法的选择 体外转录的方法有
用不同RNA聚合酶的基因转录体系 原核转录体系 真核转录体系 使用不同DNA模板的转录体系 细胞核抽提物的转录体系
2020年4月28日星期二

分子生物学-转录

分子生物学-转录

子依赖型. 第一类终止子终止转录不需其它蛋白因子参与, 而第二类则
转录无任何影响, 只有在其被聚合酶转录后会造成转录终止. 被转录
的倒转重复序列区段可以通过自身碱基配对形成发夹结构(Hairpin), 可以对转录三维复合物产生一种张力而容易引起复合物的解体; 当 此种茎环结构与富含A:U区相邻时, 由于A:U配对间较弱的作用力, 可以最终促使上游形成的茎环结构使转录复合物解体而终止转录.
The phases of transcription cycle
Promoter consensus sequence and spacing consensus
σand αsubunits recruit RNA polymerase core enzyme to the promoter
转录并脱离其它GTFs。
The general transcription factors of RNA polymerase II
GTFs
TBP
Number of subunits
1
TFⅡA
TFⅡB TFⅡE
2
1 2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
TFⅡF
TFⅡH TAFs
3
9 11
Transcription initiation by RNA polymerase Ⅱ
的平台。体外实验结果显示,其它GTFs与RNA聚合酶Ⅱ按照一定的顺序在启动子

分子生物学名词解释汇总

分子生物学名词解释汇总

1、central dogma: 它描述了遗传信息的本质:核酸序列可以通过复制、转录、反转录,使之永存或互变,但核酸翻译成蛋白质是单向的,因为核酸序列不能从蛋白质序列中重新得到。

2、replication: DNA双链复制成两个相同的拷贝,这个过程保存和延续了遗传信息。

3、transcription: 一段DNA片段为模板合成RNA的过程。

4、translation: 是在mRNA模板上进行蛋白质合成的过程。

5、reverse transcription: 在逆转录酶的存在下以RNA为模板合成DNA的过程。

6、nucleoid: 细菌中包含基因组的区域,DNA是结合到蛋白质而不是被膜包住。

7、chromosome: 携带很多基因的基因组的分离单位。每一条染色体包含长的双链DNA分子以及大约等量的蛋白质。只有在细胞分裂中才可见的形态单位。

8、chromatin: 是真核生物细胞中期细胞核内DNA和蛋白质的复合体。

9、nucleosome: 染色质的基本结构亚基,由约200bp的DNA合组蛋白八聚体所组成。

10、histone: 真核生物中保守的DNA结合蛋白质,是染色质形成的基本亚基,四种组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)形成八聚体核心,而后DNA盘绕其上形成核小体,而核小体不包括组蛋白H1。

11、exon: 断裂基因中,在成熟mRNA产物中存在的任何片段。

12、intron: 一段DNA片段,它转录但通过将其两端的序列(外显子)剪接在一起而被除去出转录物。

13、SNP(单核苷酸多样性): 指单个核苷酸变化引起的多态性(个体之间的序列差异),大部分的个体之间的遗传差异由此引起。

基因的分子生物学3篇

基因的分子生物学3篇

基因的分子生物学

第一篇:基因的发现与结构

基因是生物体内的遗传物质,掌握基因分子生物学对于理解遗传学和细胞分子生物学有着至关重要的意义。而要了解基因,首先需要了解基因的发现和结构。本篇将从发现基因的历史出发,介绍基因的结构、功能和分类。

一、基因的发现

基因的发现历史可以追溯到康德尔和洛希提出的“遗传病理学”学说。他们认为父母对后代的遗传是通过“血”的传递实现的。此后,许多科学家先后展开了一系列的基因研究,如摩尔根和他的学生门德尔等人的基因定位实验,和沃特森和克里克提出的基因结构模型等。这些研究奠定了遗传学和分子生物学的基础。

二、基因的结构

大体上,基因是由DNA (deoxyribonucleic acid, 脱氧核糖核酸) 组成的,并且这些基因携带着遗传信息。DNA分为四种碱基:腺嘌呤(Adenine, A)、胸腺嘧啶(Thymine, T)、鸟嘌呤(Guanine, G)和胞嘧啶(Cytosine, C)。这些碱基以复合物的形式排列成了DNA链。每条DNA链由磷酸基团和脱氧核糖醛基团组成,两条链通过碱基之间形成的氢键粘在一起。基因的长度不固定,从几百个碱基到数百万个碱基不等。而基因的信息则是通过DNA链中的不同碱基序列存储的。这种存储方式使用了DNA所具有的“四字母”编码系统,每三个碱基编码一个氨基酸。

三、基因的功能

基因所携带的遗传信息分为两类:表型信息和表达控制

信息。表型信息指的是基因所编码的蛋白质,而表达控制信息则是指调节基因表达的元件,如启动子、转录因子等。基因的表达是指基因信息转化为蛋白质的过程,而基因表达的过程同样分为两个环节:转录和翻译。其中转录是指由RNA依据DNA

DNA复制转录翻译汇总

DNA复制转录翻译汇总

replication)。
DNA半保留复制示意图
复制
亲代DNA
子代DNA
DNA半保留复制研究实验结果示意图
半保留复制的意义 按半保留复制方式,子代DNA与亲代DNA的碱 基序列一致,即子代保留了亲代的全部遗传信 息,体现了遗传的保守性。 遗传的保守性,是物种稳定性的分子基础,但
不是绝对的。
2、有一定的复制起始点
3、引发体和RNA引物
引物酶(primerase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚 合酶(DDRP),该酶以DNA为模板,聚合一段RNA 短链引物(primer),以提供自由的3’-OH,使子代DNA
链能够开始聚合。
引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。
引物酶催化合成短链RNA引物分子
线性DNA在复制完成后,其末端由于引物RNA 的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶
(telomerase)的催化下,进行延长反应。
5 3 3 5
5 3 5
3
端粒酶(telomerase)
端 粒 酶 是 一种 RNA蛋 白质 复 合体 , 它可 以其 RNA 为模板,通
过 逆转 录 过程 对 末端
triphosphate)为底物,即dATP,dGTP, dCTP,dTTP。
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 +PPi

分子生物学:基因的体外转录和翻译ppt课件

分子生物学:基因的体外转录和翻译ppt课件
Jakson于1976年创立的,经很多实验室的 不断修订和改进,现已成为一项成熟的分 子生物学和细胞生物学技术,已被多家试 剂公司提供标准的实验程序。
2019/12/19
5
基因体外转录体系在分子生物学和 细胞生物学研究中的用途和意义:
1、快速检测目的基因的转录情况; 2、分析转录因子调节基因转录的过程; 3、分析启动子序列的活性; 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA 剪切因子的组成和作用;
缺点:分离过程中一些特殊的试剂 破坏了细胞核膜,造成核内容物的 部分流失及操作过程中精胺易使 DNA模板产生沉淀
2019/12/19
21
过程:
收集细胞:收集一定数量的培养细 胞,300g离心5min,沉淀用分离 液清洗2次。 裂解细胞纯化细胞核:沉淀中加入 预冷的匀浆液1/10(原体积),冰浴 10min后,匀浆,镜检,至90%细
集的细胞ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ速加入原体积1/10的低渗缓
冲液[0.01mmol/ L HEPES(4-羟基乙基哌
嗪乙磺酸) pH 7.9,10mmol/LKCl,
1.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇),0.2mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)],冰浴30min,用 玻璃匀浆器匀浆,3000rpm离心15min 得细胞核沉淀。
附:Bradford法测蛋白含量
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰 法(Bradford法),是根据蛋白质与 染料相结合的原理设计的。这种蛋 白质测定法具有超过其他几种方法 的突出优点,因而正在得到广泛的 应用。这一方法是目前灵敏度最高 的蛋白质测定法。

体外翻译系统在分子生物学研究中的应用

体外翻译系统在分子生物学研究中的应用

体外翻译系统在分子生物学研究中的应用

李 前综述 孙曼霁审阅

军事医学科学院毒物药物研究所(北京,100850)

摘要 体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统,是分子生物学中一种常规的表达系统。该系统可用于蛋白质快速分析鉴定,基因转录和翻译的调控机理的研究以及分子间的相互作用的研究,如蛋白质和蛋白质的相互作用,蛋白质与DN A的相互作用,蛋白质与RN A的相互作用等。

关键词 体外翻译系统; 基因表达调控

体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统,是一种相对胞内表达系统而言的开放表达体系。翻译系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的改变,因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内表达系统具有许多优点如内源性mRNA干扰很小(由于体外翻译系统是用指定的模板进行目的蛋白质合成,因而可以大大降低或消除在体内翻译系统中由于内源mRNA所造成的背景);可以同时加入多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用;体外翻译系统可以对基因产物进行特异性标记,便于在反应混合物中检测。此外体外翻译系统是一种蛋白质快速鉴定系统,蛋白质表达可以不需要先进行克隆。目前,体外翻译系统有兔网织红细胞系统、麦胚提取物系统、E.coli S30系统3种。

1 真核体外翻译系统在分子生物学研究中的应用

1.1 兔网织红细胞系统

体外翻译系统中兔网织红细胞系统是真核体外翻译系统中应用最广泛的一种,常用于较大的mR-NA种类鉴定,基因产物性质的分析,转录和翻译调控的研究,以及共翻译加工的研究等等。兔网织红细胞用新西兰大白兔制备[1],通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞。网织红细胞裂解后,提取物用微球菌核酸酶破坏内源m RNA,最大限度降低翻译背景。裂解物包含蛋白质合成所必须的细胞内组分(tRNA,核糖体,氨基酸,起始、延伸、终止因子)。为了使系统更适于m RNA的翻译,兔网织红细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统,以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制,此外还添加了tRNAs混合物用于扩大m RNA翻译的范围,以及乙酸钾和乙酸镁等。兔网织红细胞具有一定的翻译后加工活性,包括翻译产物的乙酰化,异戊二烯化,蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信号肽切除以及蛋白质糖基化等翻译后加工事件可以通过加入犬微粒体膜来实现[2]。

分子生物学:基因组、基因组学与转录组学

分子生物学:基因组、基因组学与转录组学
目录
与基因功能相关的结构
编码区序列(coding region sequence )
在细胞内表达为蛋白质或功能RNA的DNA序列
非编码序列(non-coding sequence)
基因表达需要的调控区(regulatory region)序列, 包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)等。
➢ 少数启动子(如编码tRNA基因的启动子)位于 转录起始点的下游,这些DNA序列可以被转录。
目录
2. 增强子增强邻近基因的转录
增强子是增强真核基因启动子工作效率的顺 式作用元件,是真核基因中最重要的调控序列, 决定着每一个基因在细胞内的表达水平。
➢ 能够在相对于启动子的任何方向和位置(上游或者下游) 上发挥这种增强作用,大部分位于上游。
基因组、基因组学与 转录组学
目录
第一节 基因
目录
1958年提出“中心法则”,通过DNA复制,生物体
的遗传信息传给子代,通过转录和翻译,遗传信息 传给RNA和蛋白质,从而决定生物的表现。 中心法则
The Central Dogma of Molecular Biology
目录
中心法则 (The Central Dogma)
目录
鸟枪法测序的原理与策略
目录
(三)生物信息学是预测基因组结构和功能的 重要手段
三大生物信息中心:

(整理)分子生物学总结

(整理)分子生物学总结

第一章基因与基因组

一、基因与基因组特点(重点)

1.Gene:a gene includes the entire nucleic acid sequence necessary for the expression of its product (peptide or RNA).

2.Genome(基因组):细胞内所携带的全部遗传信息DNA的总和。

3.C值(C-value): 单倍体DNA所包含的全部DNA量。

4.C值矛盾(C-value Paradox):物种的C值和它进化复杂性之间没有严格的对应关系。

5.真核生物基因组的特点:

(1)基因组较大

(2)往往有很多染色体,多复制起始位点(ori)

(3)DNA与蛋白质结合,形成核小体(nucleosome) ,再缠绕成染色质chromatin (染色体chromosome )

(4)转录和翻译在时间和空间上是分隔的。

(5)转录产物为单顺反子(mono-cistron)

(6)有可移动的DNA序列

(7)有大量的重复序列、基因家族(gene family)、不连续基因(discontinuous gene) (真核生物基因组三大特点)

6.真核生物基因组的序列类型:高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列。

7.基因家族(gene family):基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因。

产生机理(理解):不对等交换、几种基因家族:Alu基因家族、rRNA基因家族、组蛋白基因家族、珠蛋白基因家族疾病:Thalassemia(地中海贫血)

8.珠蛋白基因家族α2β2,α型亚基基因在16号染色体上,β型亚基基因在11号染色体上,珠蛋白基因以基因家族的形式排列。

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2020/8/4
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(2)仍有一些物质干扰此法的测 定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 (SDS)和0.1N的NaOH (3)标准曲线也有轻微的非线性, 因而不能用Beer定律进行计算,而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
2020/8/4
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源自文库、精胺-亚精胺混合物改进法 优点:分离到的细胞核比较纯净
2020/8/4
3
第一节 基因的体外转录
• 一、基因体外转录的目的和意义 • 基因的体外转录体系最早由Pelham和
Jakson于1976年创立的,经很多实验室的 不断修订和改进,现已成为一项成熟的分 子生物学和细胞生物学技术,已被多家试 剂公司提供标准的实验程序。
2020/8/4
4
基因体外转录体系在分子生物学和 细胞生物学研究中的用途和意义:
1、快速检测目的基因的转录情况; 2、分析转录因子调节基因转录的过程; 3、分析启动子序列的活性; 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA 剪切因子的组成和作用;
5、染色质结构调整与基因转录的关系;
6、制备RNA探针。
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一、基因体外转录的基本原理
基本原理:以DNA为模板,在无细 胞体系中一系列转录因子的作用下 经RNA聚合酶合成RNA的过程。
质粒DNA
模 板
线性DNA
核小体形式存在的DNA
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能用于体外转录的质粒载体
转录的必要条件:无论是真核细胞
的转录体系还是原核细胞的转录体
系,基因转录时都必须有启动子序
列,且该序列能被转录体系识别。
原核细胞体外转录体系常用的启动
子有T3、T7及SP6启动子。
真核细胞体外转录体系除需启动子,
缺点:分离过程中一些特殊的试剂 破坏了细胞核膜,造成核内容物的 部分流失及操作过程中精胺易使 DNA模板产生沉淀
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(3)裂解细胞核:向细胞核沉淀中加
入2倍体积的低盐缓冲液(20mmol/L
HEPES,pH 7.9,25%甘油,
1.5mmol/L MgCl2,20mmol/L KCl,
0.2mmol/L EDTA,0.2mmol/L PMSF,
0.5mmol/L DTT),冰浴10min,用玻 璃匀浆器匀浆。滴加入2倍核沉淀 体积的高盐缓冲液冰浴 轻轻搅拌
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(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是: (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差, 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰 法(Bradford法),是根据蛋白质与 染料相结合的原理设计的。这种蛋 白质测定法具有超过其他几种方法 的突出优点,因而正在得到广泛的 应用。这一方法是目前灵敏度最高 的蛋白质测定法。
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考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液 中与蛋白质结合,使染料的最大吸收 峰的位置(lmax),由465nm变为 595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为 兰色。经研究认为,染料主要是与蛋 白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595,与 蛋白质浓度成正比。
增强子等顺式作用元件外,还需各
种反式作用元件的参与。
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基因体外转录体系
DNA模板:含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
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细胞核抽提物的制备:
细胞核抽提物:DNA转录由RNA聚合酶、 各种转录因子及必要的环境条件等,这 一切必需由细胞提供。常用于制备细胞 核抽提物的细胞有酵母细胞、兔网织红 细胞和Hela细胞
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Bradford法的突出优点是: (1)灵敏度高,据估计比Lowry法 约高四倍,这是因为蛋白质与染料 结合后产生的颜色变化很大,蛋白 质-染料复合物有更高的消光系数, 因而光吸收值随蛋白质浓度的变化 比Lowry法要大的多。
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(2)测定快速、简便,只需加一种 试剂。完成一个样品的测定,只需 要5分钟左右。由于染料与蛋白质结 合的过程,大约只要2分钟即可完成, 其颜色可以在1小时内保持稳定,且 在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定 性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严格地控制时间。
126分子生物学:基因的体外转 录和翻译
基因表达包括:转录和翻译两个过 程。
基因表达的调控包括:染色体结构 的调节、DNA结构的调节、转录过 程的调控、转录后的调控、翻译过 程的调控及翻译后的调控。
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基因体外转录和翻译的作用:为研 究基因转录和蛋白质翻译提供了一 个十分理想实验体系和技术平台及 找到了一个研究与探讨转录和翻译 这两个复杂的现象的重要手段和方 法。
冲液[0.01mmol/ L HEPES(4-羟基乙基哌
嗪乙磺酸) pH 7.9,10mmol/LKCl,
1.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇),0.2mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)],冰浴30min,用 玻璃匀浆器匀浆,3000rpm离心15min 得细胞核沉淀。
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30min。
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(4)收集核提取物:25000g离心 30min,收集上清液后,用缓冲液 透析2h后,4℃,25000g离心20min, 上清液置-70℃保存。
(5)核提取物的蛋白定量:核抽提物 总蛋白浓度采用Bradford法测定, 以牛白蛋白为参照。
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附:Bradford法测蛋白含量
1、一般方法
优点:细胞核完整、内含物丰富
缺点:在分离的细胞核中可能存 在少量细胞质成分
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(1)收集细胞:取5×106/ml的培养细胞 20ml,1500rpm离心5min,用新配制的 0.01mol/LPBS洗涤,收集细胞。 (2)低渗液裂解细胞并纯化细胞核:将收
集的细胞迅速加入原体积1/10的低渗缓
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