基因组文库的构建ppt课件
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基因组文库的构建
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
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6
限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
(b) mRNA
mRNA
mRNA 5kb
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7
一个典型的基因组文库含带有重叠基因片段的多拷 贝克隆。
典型的基因组文库应能“代表”整套的DNA片 段，这些序列和原来样本中存在的所有DNA序 列相一致，并保持原有的相关丰度。
当需要时，人们能从DNA文库中分离任何特定
的基因片段。
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2
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3
噬菌体克隆文库的构建。
(a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载体中 来构建基因组文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不 同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌 体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
16
限制性酶消解用来构建克隆DNA的物理图谱
用酶（KpnⅠ和 Hind Ⅲ）来剪切载体，构建一个 SalⅠ插入片段的不完全酶切图谱。
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17
M1 2 3 4 5 6 7 8 M
M：标记泳道， 是含有已知不同长度
的DNA，用来衡量 样本DNA的分子大 小。 1：SalⅠ-KpnⅠ； 2：HindⅢ； 3：SalⅠ-HindⅢ； 4：KpnⅠ-HindⅢ； 5：EcoRⅠ； 6：SalⅠ- EcoRⅠ； 7： KpnⅠEcoRⅠ； 8：HindⅢ- EcoRⅠ
医学分子生物学-基因组ppt课件
6、基因一般是连续的，无内含子(古细菌除外) V 7 、编码顺序一般不重叠
操纵子*
n 原核基因组特有的结构 n 数个功能上相关联的结构基因串联在一起,构
成信息区,连同其上游的调控区(包括启动子和 操纵基因)以及下游的转录终止信号所构成的 基因表达单位。 n 所转录的RNA为多顺反子。 n 操纵基因并非一个基因，而是一段能被特异阻 遏蛋白识别和结合的DNA序列。
连续克隆系逐个克隆法 ( 公共领域测序计划)
(1)建立插入人类基因组片段的酵母人工染色体( YAC) 克隆群。
(2)利用高频分布、易于检索的DNA标志或者DNA指 纹图谱建立克隆之间的联系，组成有序排列的连续克隆 系，最常使用的DNA标志有STS和表达的序列标签( expressed sequence tag ，EST)。
RNA病毒基因组所携带的遗传信息一般在同一条链上， 序列与mRNA相同的为正股 (+) ，与mRNA互补的 为负股 (－) 3、双链RNA 以负链RNA为模板转录出mRNA，如呼肠 孤病毒及噬真菌体。 4、单链负股RNA 5、单链正股RNA： 如逆转录病毒
病毒基因组结构与功能的特点*
¶ 种类单一：DNA or RNA ¶ 形式多样：单链、双链、分节段、环状、线状 ¶单倍体基因组： 每个基因在病毒中出现一次(特例:Retrovirus 双倍体 ) ¶ 大小不一：2x103----2x105bp ¶ 基因重叠：高效资源利用V ¶ 动物病毒与真核细胞基因组相似:有的含内含子— 间断;细菌病毒(噬 菌体)与原核细胞基因组相似—连续 ¶ 编码基因>90%
操纵子*
n 原核基因组特有的结构 n 数个功能上相关联的结构基因串联在一起,构
成信息区,连同其上游的调控区(包括启动子和 操纵基因)以及下游的转录终止信号所构成的 基因表达单位。 n 所转录的RNA为多顺反子。 n 操纵基因并非一个基因，而是一段能被特异阻 遏蛋白识别和结合的DNA序列。
连续克隆系逐个克隆法 ( 公共领域测序计划)
(1)建立插入人类基因组片段的酵母人工染色体( YAC) 克隆群。
(2)利用高频分布、易于检索的DNA标志或者DNA指 纹图谱建立克隆之间的联系，组成有序排列的连续克隆 系，最常使用的DNA标志有STS和表达的序列标签( expressed sequence tag ，EST)。
RNA病毒基因组所携带的遗传信息一般在同一条链上， 序列与mRNA相同的为正股 (+) ，与mRNA互补的 为负股 (－) 3、双链RNA 以负链RNA为模板转录出mRNA，如呼肠 孤病毒及噬真菌体。 4、单链负股RNA 5、单链正股RNA： 如逆转录病毒
病毒基因组结构与功能的特点*
¶ 种类单一：DNA or RNA ¶ 形式多样：单链、双链、分节段、环状、线状 ¶单倍体基因组： 每个基因在病毒中出现一次(特例:Retrovirus 双倍体 ) ¶ 大小不一：2x103----2x105bp ¶ 基因重叠：高效资源利用V ¶ 动物病毒与真核细胞基因组相似:有的含内含子— 间断;细菌病毒(噬 菌体)与原核细胞基因组相似—连续 ¶ 编码基因>90%
基因组学ppt课件
由于同源染色体同一区段DNA序列的 差异，当用限制酶处理时，可产生 长度不同的限制性片段。
14
什么是RFLP标记？(2)
Var. A
Var. B
EcoR I will not cut this squence 15
什么是RFLP标记？(3)
16
(二) RFLP methodology
Cutting DNA into smaller fragments by restriction enzymes
散的顺序按原来位置组装,需要图譜 进行指导.百度文库- 基因组存在大量重复顺序,会干扰排序, 因此要高密度基因组图.
2)由于一些分子标记同基因座位紧密连锁，为靶基因 的图位克隆(map based cloning)提供了可能。
3)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正.
5
二、遗传图与物理图
1）遗传作图（Genetic mapping） 采用遗传学分析方 法将基因或其它DNA分子标记标定在染色体上构建连
以 SSR 为代表，包括 RAPD，AFLP, SSCP
3) 第三代分子标记, 以基因序列为基础:
以 SNP 为代表
12
一、第一代分子标记---RFLP
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段长度多态性
14
什么是RFLP标记？(2)
Var. A
Var. B
EcoR I will not cut this squence 15
什么是RFLP标记？(3)
16
(二) RFLP methodology
Cutting DNA into smaller fragments by restriction enzymes
散的顺序按原来位置组装,需要图譜 进行指导.百度文库- 基因组存在大量重复顺序,会干扰排序, 因此要高密度基因组图.
2)由于一些分子标记同基因座位紧密连锁，为靶基因 的图位克隆(map based cloning)提供了可能。
3)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正.
5
二、遗传图与物理图
1）遗传作图（Genetic mapping） 采用遗传学分析方 法将基因或其它DNA分子标记标定在染色体上构建连
以 SSR 为代表，包括 RAPD，AFLP, SSCP
3) 第三代分子标记, 以基因序列为基础:
以 SNP 为代表
12
一、第一代分子标记---RFLP
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段长度多态性
基因组文库构建
(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) 基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段 大小供体DNA大小：>300kbp主要应用：大基因 组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体 在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量 供体DNA。
PAC(P1 人工染色体 ) BAC( 细菌人工染色体 ) MACs( 哺乳类人工染色 体)
细菌噬菌体 P1 F 质粒 基于 Epstein-Barr 病 毒的游离载体
100 ～300kb 300kb >300kb
人类人工游离染色体 (human artificial episomal chromosome,HAEC)是一类发展 中的 MACs, 它来自于 Epstein-Barr 病毒
真 核 基 因 组 DNA
λ 取 代 型 λ 噬 菌 体 载 体
COS C h a ro n 4 A 机 械 剪 切 E coR I E coR I 酶 切 加 人 工 接 头 酶 切
连 接
cos
体 外 包 装
cos
转 染 E .c o li
三.质粒载体构建cDNA文库
双 链 质 粒 DNA 5’ pB R322 5’ 3’ RT 酶 限 制 酶 用 N aO H 降 解 m R N A 用 K le n o w 酶 合 成 第 二 链 3’ A A A AA An 加 锚 定 引 物 (寡 聚 T ) 3’ AA A A An 5’ TTTT
宏基因组文库构建-PPT精选文档
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆 Amp ori
MCS
目标宿主可用的 抗性gene
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位
• 功能缺失
在获得相应突变体的前提下
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 隆时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存
文库比λ phage困难得多
YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段
BAC 可减少DNA分子间的重组
基因克隆的策略
基因克隆的本质 从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”
ห้องสมุดไป่ตู้
a suite of culture-independent techniques are needed to complement efforts to culture the thousands or millions of unknown species in the
什么是宏基因组文库？
sequencing of ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to describe uncultured bacteria in the environment.
基因文库的构建
然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走 读，直至线型染色体DNA的端点
染色体走读法（chromosome walking）
亚克隆旁测序列
走读的起点克隆片段 探针标记
第一轮杂交 第二轮杂交
第二轮杂交
阳性克隆
阳性克隆
染色体走读法（chromosome walking）
走读的起点克隆片段
基因文库的构建程序
从基因文库中筛选目的基因
密集铺板（1-10万）
目的重组克隆
杂
挖
铺
铺
交
取
板பைடு நூலகம்
板
基因文库的构建程序
基因文库构建的技术性问题
在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是： 严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：
将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端
基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）
基因文库的基本概念
基因文库构建的基本战略
用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA 用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库
染色体走读法（chromosome walking）
亚克隆旁测序列
走读的起点克隆片段 探针标记
第一轮杂交 第二轮杂交
第二轮杂交
阳性克隆
阳性克隆
染色体走读法（chromosome walking）
走读的起点克隆片段
基因文库的构建程序
从基因文库中筛选目的基因
密集铺板（1-10万）
目的重组克隆
杂
挖
铺
铺
交
取
板பைடு நூலகம்
板
基因文库的构建程序
基因文库构建的技术性问题
在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是： 严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：
将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端
基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）
基因文库的基本概念
基因文库构建的基本战略
用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA 用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库
基因组作图ppt课件
32
SSLP （简单序列长度多态性）
ppt课件.
➢ SSLP是一系列不同长度的重复序列，不同的等位基因含有 不同的重复单位。有两种类型：
❖ 小卫星序列 (minisatellite)：又称可变数目串联重复 (variable number of tandem repeat, VNTR)，重复单位可以 是几十个核苷酸；
的BAC序列。然后由相互关联、部分重叠的BAC克隆连
成一个大的重叠群（Contig）。理想状况下，整条染色
体就是由一个完整的重叠群构成。
11
ppt课件.
利用重克叠隆群步移法法测序，国际上通行的标准要求BAC测序达
到十倍覆盖率，使所测的序列达到99.99％以上的准确度。 该方法的技术难度较高，尤其大片段基因组文库（BAC） 和精细物理图构建是技术性极强的工作。
26
ppt课件.
RFLP
➢ 由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变 引起的；
➢ 最早由Bostein 于1980年提出， 是第一种用于 作图研究的分 子标记，第一 代DNA分子标 记。
27
ppt课件.
同源染色体同一区段DNA 序列的差异， 限制酶识别的碱基顺序有专一性
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ppt课件.
ppt课件.
基因组作图
1
染色体结构与基因
基因组计划的基本目标
cDNA文库构建-PPT课件 135页PPT
现代生物技术讲座
cDNA文库的构建
主要内容
基因文库的概念及意义 cDNA基因文库的类型 几种cDNA文库的介绍 SMART技术构建全长cDNA文库
一、基因文库的概念及意义
文库（library）：指一种全体的集合。 基因文库（gene library ）:是某一生物类型全部基因 的集合，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。
在研究基因功能和表达调控时，建立减法文库是一个很好的 策略。它是通过野生行DNA和缺失型DNA，或不同时空、不同环 境条件下的两种CDNA样品反复杂交，去处杂交体后，将剩余的 DNA或CDNA片段进行克隆而构建的文库。
（二）根据文库的功能分：克隆文库和表达文库
（1）克隆文库 由克隆载体构建，载体具有复制子、多克隆位 点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。
★根据DNA来源可分为核基因组文库、线粒体基因组文库和
叶绿体基因文库
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、 免疫结合法）
基因组DNA文库应用
基因组物理图谱的构建 基因组序列分析 基因在染色体上的定位 克隆鉴定基因调控元件 基因组中基因的结构和组织形式分析
3、 cDNA文库和基因组文库的区别
时效性 cDNA 文库代表某一时期特定细胞或组织中mRAN， 是转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是 全部基因；而基因组文库包含该生物所有基因， 序列组成不同 cDNA 文库无间隔序列和调控区等非编码区； 基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA 片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能 是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因 外还包含着两侧的邻近DNA顺序。
cDNA文库的构建
主要内容
基因文库的概念及意义 cDNA基因文库的类型 几种cDNA文库的介绍 SMART技术构建全长cDNA文库
一、基因文库的概念及意义
文库（library）：指一种全体的集合。 基因文库（gene library ）:是某一生物类型全部基因 的集合，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。
在研究基因功能和表达调控时，建立减法文库是一个很好的 策略。它是通过野生行DNA和缺失型DNA，或不同时空、不同环 境条件下的两种CDNA样品反复杂交，去处杂交体后，将剩余的 DNA或CDNA片段进行克隆而构建的文库。
（二）根据文库的功能分：克隆文库和表达文库
（1）克隆文库 由克隆载体构建，载体具有复制子、多克隆位 点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。
★根据DNA来源可分为核基因组文库、线粒体基因组文库和
叶绿体基因文库
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、 免疫结合法）
基因组DNA文库应用
基因组物理图谱的构建 基因组序列分析 基因在染色体上的定位 克隆鉴定基因调控元件 基因组中基因的结构和组织形式分析
3、 cDNA文库和基因组文库的区别
时效性 cDNA 文库代表某一时期特定细胞或组织中mRAN， 是转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是 全部基因；而基因组文库包含该生物所有基因， 序列组成不同 cDNA 文库无间隔序列和调控区等非编码区； 基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA 片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能 是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因 外还包含着两侧的邻近DNA顺序。
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
• Biblioteka Baidu可用反转录酶或Klenow酶延伸引物来合 成第二链。
•
cDNA末端的处理
• 由于大片段的平末端连接效率非常低，因 此为了避免用平末端与载体连接，对双链 cDNA的末端进行加工是十分必要的
文库大小
• 以最大可能可获得某一特定序列的基因文库所必 须包含的重组体数的计算方式如下：
N＝ln(1-p)/ln(1-f )
P—给定的概率，f—插入片段大小占总基因组大 小的比例
• 如果给定概率为0.99，插入片段为20kb的情况下， 对人类基因组（3*109bp）来说，所需重组体的 数目为6.9 *105；而对于大肠杆菌而言，仅需要 1100个重组体。
基因组文库、cDNA文库的构 建和筛选
基因文库—是来自于某种生物的不同 DNA序列的集合
• 基因组文库—用于构建文库的DNA来源于 基因组DNA
• cDNA—用于构建文库的DNA是mRNA群 体的拷贝（cDNA），则该文库称之为 cDNA文库。 cDNA文库不包括不能转录的 核基因序列
• 具有代表性的基因文库应该在最大限度上 覆盖所有的原初序列。
• 如λ 置换载体（EMBL3等）
• EMBL3 ：载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和 填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。 从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段
•
cDNA末端的处理
• 由于大片段的平末端连接效率非常低，因 此为了避免用平末端与载体连接，对双链 cDNA的末端进行加工是十分必要的
文库大小
• 以最大可能可获得某一特定序列的基因文库所必 须包含的重组体数的计算方式如下：
N＝ln(1-p)/ln(1-f )
P—给定的概率，f—插入片段大小占总基因组大 小的比例
• 如果给定概率为0.99，插入片段为20kb的情况下， 对人类基因组（3*109bp）来说，所需重组体的 数目为6.9 *105；而对于大肠杆菌而言，仅需要 1100个重组体。
基因组文库、cDNA文库的构 建和筛选
基因文库—是来自于某种生物的不同 DNA序列的集合
• 基因组文库—用于构建文库的DNA来源于 基因组DNA
• cDNA—用于构建文库的DNA是mRNA群 体的拷贝（cDNA），则该文库称之为 cDNA文库。 cDNA文库不包括不能转录的 核基因序列
• 具有代表性的基因文库应该在最大限度上 覆盖所有的原初序列。
• 如λ 置换载体（EMBL3等）
• EMBL3 ：载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和 填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。 从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段
第三章基因文库的构建
酶的及外侧引物a和d的作用下，形成其突变位点是位 于靶DNA序列中但远离两端的突变体。
22
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
四、引物延伸：单引物法（不依赖PCR反 应）
1、原理 利用一段人工合成的，与互补的序列有一个
碱基错配的寡核苷酸片段（7~20碱基）, 并由该寡核苷酸引导DNA的体外合成。
23
Single-stranded M13 recombinant
A、所需要的重组子少（即文库中包含的 克隆数目较少）。
B、目标基因相对比较完整。
9
第二节 亚克隆
概念：对已经获得的目的DNA片段进程重 新克隆，目的是对目的DNA进行进一步分 析，或进行重组改造等。
过程：1）目的DNA片段和载体制备；2） 目的DNA片段与载体相连；3）连接产物 的转化；4)重组子的筛选
三、定点诱变的PCR方法
根据靶DNA序列设计一对互补的内侧引物c和b’(c和b互 补)，他们在相同的位点具有同样的碱基突变；
分别以左侧引物ac和右侧引物bd进行两轮PCR扩增； 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，故经变性
和退火形成异源双链分子 其中只有具3’凹陷末端的双链分子可通过TaqDNA聚合
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
22
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
四、引物延伸：单引物法（不依赖PCR反 应）
1、原理 利用一段人工合成的，与互补的序列有一个
碱基错配的寡核苷酸片段（7~20碱基）, 并由该寡核苷酸引导DNA的体外合成。
23
Single-stranded M13 recombinant
A、所需要的重组子少（即文库中包含的 克隆数目较少）。
B、目标基因相对比较完整。
9
第二节 亚克隆
概念：对已经获得的目的DNA片段进程重 新克隆，目的是对目的DNA进行进一步分 析，或进行重组改造等。
过程：1）目的DNA片段和载体制备；2） 目的DNA片段与载体相连；3）连接产物 的转化；4)重组子的筛选
三、定点诱变的PCR方法
根据靶DNA序列设计一对互补的内侧引物c和b’(c和b互 补)，他们在相同的位点具有同样的碱基突变；
分别以左侧引物ac和右侧引物bd进行两轮PCR扩增； 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，故经变性
和退火形成异源双链分子 其中只有具3’凹陷末端的双链分子可通过TaqDNA聚合
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
宏基因组的构建及应用ppt课件
ppt课件 20
ppt课件
21
1 、在生态学方面的应用
宏基因组在生态学上的应用主要是土壤与水体。
目前其在土壤微生物研究中的应用主要包括两方面： 一、进行土壤微生物及其资源的挖掘。目前的研究工作已经 得到大批新基因，特别是在一些极端环境中的微生物宏基 因组的研究中得到了一些具有特殊应用价值的功能酶基因 二、揭示土壤微生物的多样性及其与环境之间的关系。
ppt课件
Leabharlann Baidu17
3 序列驱动的筛选
序列驱动的筛选(Sequence-driven screening)是根 据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物， 通过核酸杂交或PCR扩增来筛选具有目标序列 的克隆子。 优点：不依赖克隆基因在宿主菌株中的表达。 缺点：必须对相关基因序列有所了解，无法筛选 宏基因组文库中那些和现有基因序列完全不同 的新基因(即未知基因)。
在水体中的应用： 海洋蕴涵着非常丰富的微生物资源，目前已应用宏基因组 技术研究了多种海洋次生代谢产物合成途径，其中最为经 典的是研究海洋聚酮类和非核糖体肽类的生物合成基因簇。
ppt课件 22
2 、在新型生物催化剂中的应用
新型催化剂主要是酶。传统的新型酶的筛选方法限 制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学则克服了 这一限制，有效地提高了新酶的筛选效率。 现已发现了抗生素及维生素生物合成相关基因簇的 克隆，以及水解酶类和氧化还原酶类编码的基因。 宏基因组技术通过对环境的直接克隆，为研究和利 用占微生物99％以上的非培养微生物提供了新的途 径，为微生物的研究和发展提供了全新的策略。
ppt课件
21
1 、在生态学方面的应用
宏基因组在生态学上的应用主要是土壤与水体。
目前其在土壤微生物研究中的应用主要包括两方面： 一、进行土壤微生物及其资源的挖掘。目前的研究工作已经 得到大批新基因，特别是在一些极端环境中的微生物宏基 因组的研究中得到了一些具有特殊应用价值的功能酶基因 二、揭示土壤微生物的多样性及其与环境之间的关系。
ppt课件
Leabharlann Baidu17
3 序列驱动的筛选
序列驱动的筛选(Sequence-driven screening)是根 据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物， 通过核酸杂交或PCR扩增来筛选具有目标序列 的克隆子。 优点：不依赖克隆基因在宿主菌株中的表达。 缺点：必须对相关基因序列有所了解，无法筛选 宏基因组文库中那些和现有基因序列完全不同 的新基因(即未知基因)。
在水体中的应用： 海洋蕴涵着非常丰富的微生物资源，目前已应用宏基因组 技术研究了多种海洋次生代谢产物合成途径，其中最为经 典的是研究海洋聚酮类和非核糖体肽类的生物合成基因簇。
ppt课件 22
2 、在新型生物催化剂中的应用
新型催化剂主要是酶。传统的新型酶的筛选方法限 制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学则克服了 这一限制，有效地提高了新酶的筛选效率。 现已发现了抗生素及维生素生物合成相关基因簇的 克隆，以及水解酶类和氧化还原酶类编码的基因。 宏基因组技术通过对环境的直接克隆，为研究和利 用占微生物99％以上的非培养微生物提供了新的途 径，为微生物的研究和发展提供了全新的策略。
文库的建立与筛选ppt课件
文库的建立与筛选
contents
1
2 3
DNA文库与cDNA文库 DNA文库的构建 cDNA文库的构建步骤 cDNA文库的构建要点 常用的cDNA文库筛选方法
4
5
基因组文库（DNA文库）
• 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片 段的重组DNA克隆群体。 • 构建基因组文库时，先将原核或真核细胞染色体 DNA提纯，通过机械剪切或酶切使之成为一定大 小的片段，将其与适当的载体（λ 噬菌体或质粒） 相连接，经体外包装，转染细菌，得到一组含有 不同DNA片段的重组噬菌体颗粒（或转化子菌 落）。这个文库中将含有基因组内全部基因片段， 它象一个贮存有基因全部序列的信息库，故称为 基因组文库。 • 含有目的基因片段的重组子，可以通过标记探针 与基因组文库中的重组子杂交等方法筛选出来。
总RNA的提取及mRNA的分离
• 成功地构建一个cDNA文库，mRNA的获得 及其质量是一个至关重要的因素。 • 各类材料的总RNA提取，采用 Trizol Reagent（Qiagen），具体步骤详见下一 张幻灯片。 • 从总RNA中回收mRNA，建议采用 Oligotex mRNA Mini Kit（Qiagen），具 体步骤参见产品说明书。
cDNA文库
• cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶 的作用下形成的互补DNA （Complementary DNA，简称cDNA）。 • cDNA文库是指一群含有目标菌全部cDNA 片段的重组DNA的细菌或噬菌体克隆。由 于cDNA是由mRNA反转录而来，因此足够 数目的克隆总和则包含细胞的全部mRNA 的信息。
contents
1
2 3
DNA文库与cDNA文库 DNA文库的构建 cDNA文库的构建步骤 cDNA文库的构建要点 常用的cDNA文库筛选方法
4
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基因组文库（DNA文库）
• 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片 段的重组DNA克隆群体。 • 构建基因组文库时，先将原核或真核细胞染色体 DNA提纯，通过机械剪切或酶切使之成为一定大 小的片段，将其与适当的载体（λ 噬菌体或质粒） 相连接，经体外包装，转染细菌，得到一组含有 不同DNA片段的重组噬菌体颗粒（或转化子菌 落）。这个文库中将含有基因组内全部基因片段， 它象一个贮存有基因全部序列的信息库，故称为 基因组文库。 • 含有目的基因片段的重组子，可以通过标记探针 与基因组文库中的重组子杂交等方法筛选出来。
总RNA的提取及mRNA的分离
• 成功地构建一个cDNA文库，mRNA的获得 及其质量是一个至关重要的因素。 • 各类材料的总RNA提取，采用 Trizol Reagent（Qiagen），具体步骤详见下一 张幻灯片。 • 从总RNA中回收mRNA，建议采用 Oligotex mRNA Mini Kit（Qiagen），具 体步骤参见产品说明书。
cDNA文库
• cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶 的作用下形成的互补DNA （Complementary DNA，简称cDNA）。 • cDNA文库是指一群含有目标菌全部cDNA 片段的重组DNA的细菌或噬菌体克隆。由 于cDNA是由mRNA反转录而来，因此足够 数目的克隆总和则包含细胞的全部mRNA 的信息。
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第三章 基因文库的构建和筛选
来自单个基因组的DNA片段克隆的集合体称为基因 文库（gene library或gene bank）。它包括基因组 文库（genomic library）和cDNA文库（cDNA library）。
DNA文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的 重组DNA克隆群体。
cDNA文库是克隆的重组cDNA的总和，通常是建 立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物 种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。
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限制性酶消解用来构建克隆DNA的物理图谱
用酶（KpnⅠ和 Hind Ⅲ）来剪切载体，构建一个 SalⅠ插入片段的不完全酶切图谱。
ppt课件.
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M1 2 3 4 5 6 7 8 M
M：标记泳道，
是含有已知不同长度 的DNA，用来衡量 样本DNA的分子大 小。
1：SalⅠ-KpnⅠ； 2：HindⅢ； 3：SalⅠ-HindⅢ； 4：KpnⅠ-HindⅢ； 5：EcoRⅠ； 6：SalⅠ- EcoRⅠ； 7： KpnⅠEcoRⅠ； 8：HindⅢ- EcoRⅠ
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克隆数的确定
建库的关键是如何产生足够数量的重组 DNA，即基因库要建多大才能保证基因 组文库的完整性和代表性。1975 年由 L.Clarke 和 J.Carbon 建立了ClarkeCarbon公式，用来估计一个完整的基因 文库所需的克隆数，对于构建基因组文 库有重要的指导意义。
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典型的基因组文库应能“代表”整套的DNA片 段，这些序列和原来样本中存在的所有DNA序 列相一致，并保持原有的相关丰度。
当需要时，人们能从DNA文库中分离任何特定
的基因片段。
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3
噬菌体克隆文库的构建。
(a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载体中 来构建基因组文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不 同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌 体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
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细胞 基因组 用限制性 酶剪切
用连接酶 连接
λ噬菌体 提取DNA 用限制性酶剪切
尼龙膜 与放射性探针 进行分子杂交
膜
重组噬菌体
重组体DNA
细菌 感染
裂解
释放噬菌体
菌苔 噬菌体克隆文库
噬菌斑中的 噬菌体克隆
用放射自显影 定位阳性克隆 膜
阳性克隆 感染新鲜 的宿主菌
扩增外 源基因
(b) 噬菌斑被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶 解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此 膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交， 可以杂交的便是目的基因。
带有此DNA的克隆可通过放射自显影而显现出来。
这样阳性克隆可从培养基中分离出来，再转接到新
鲜的宿主菌中，使目的因得到扩增。
ppt课件.
(a)用从原有的克隆DNA片段制备的放射性探针能从 典型的基因组文库中分离各种基因片段。用探针1 可用来筛选文库，从文库中分离重组DNA片段。用 探针2和3来获得与上述片段部分重叠的DNA序列。
罕见的酶切位点和重复DNA序列(如Alu分散元件)可 作为界标，用来排列分离的基因组DNA克隆。
(b)从文库中分离的单个的克隆片段含有最小的重叠 DNA片段的复合位点。在图中表示已克隆的50kb的 基因组DNA中含有三个转录的基因。
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用噬菌体置换型载体构建基因文库。
用限制性酶消解噬菌体载体，切除了中央的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将约 15kb的酶切片段随机地和噬菌体载体的两臂连接， 形成线性的重组的串联体。
用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分 别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌 体颗粒。
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
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6
限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
(b) mRNA
mRNA
mRNA 5kb
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7Hale Waihona Puke Baidu
一个典型的基因组文库含带有重叠基因片段的多拷 贝克隆。
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将数据代入上式
N ln(1 0.99) ln(1 20kb/ 3Gb)
= 7×105
N的含义是克隆大小为20kb的人类DNA时，所构建的 基因文库数必须在7×105 个以上克隆时，才能以99 ％的概率得到此克隆。
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二、构建基因文库的克隆载体 和筛选策略
构建基因组文库的第一步是将基因组 DNA用限制性酶切成小片段，但酶的选 择和酶切反应条件的选择是取决于克隆 载体的类型
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三、亚克隆
所谓亚克隆（sub-clone）就是对已经克隆的目 的DNA片段经限制性酶消解后再次重新克隆， 其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或进 行“重编程”。
亚克隆的基本过程：
①制备目的DNA片段和载体；
②连接目的DNA片段和载体；
③重组载体转化到宿主中；
④筛选重组子。
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噬菌体克隆文库的构建。 (a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载 体中来构建基因组DNA文库。菌苔上的噬菌斑 中含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑 来自单个感染噬菌体的一个克隆。
(b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬菌体 的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附 到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的 探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。
9
Clarke-Carbon公式
任一DNA序列在文库中出现的概率：
N ln(1 p ) ln(1 I / G )
N：该序列需要克隆的总数； P：待克隆DNA序列在文库中设定的出现概
率，一般为99％； I ：待克隆DNA片段的长度，假定为20kb; G : 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp
无论是建立基因组文库还是cDNA文库，其目的是：
①从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；
②是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀
有的cDNA克隆。
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第一节 基因文库的构建
一、基因组文库和cDNA文库
基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机 片断的重组DNA克隆群。其中可能含有基因外 显子、内含子、基因5'端调控区、3'端的尾随 序列以及基因间的间隔区。
来自单个基因组的DNA片段克隆的集合体称为基因 文库（gene library或gene bank）。它包括基因组 文库（genomic library）和cDNA文库（cDNA library）。
DNA文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的 重组DNA克隆群体。
cDNA文库是克隆的重组cDNA的总和，通常是建 立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物 种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。
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限制性酶消解用来构建克隆DNA的物理图谱
用酶（KpnⅠ和 Hind Ⅲ）来剪切载体，构建一个 SalⅠ插入片段的不完全酶切图谱。
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M1 2 3 4 5 6 7 8 M
M：标记泳道，
是含有已知不同长度 的DNA，用来衡量 样本DNA的分子大 小。
1：SalⅠ-KpnⅠ； 2：HindⅢ； 3：SalⅠ-HindⅢ； 4：KpnⅠ-HindⅢ； 5：EcoRⅠ； 6：SalⅠ- EcoRⅠ； 7： KpnⅠEcoRⅠ； 8：HindⅢ- EcoRⅠ
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克隆数的确定
建库的关键是如何产生足够数量的重组 DNA，即基因库要建多大才能保证基因 组文库的完整性和代表性。1975 年由 L.Clarke 和 J.Carbon 建立了ClarkeCarbon公式，用来估计一个完整的基因 文库所需的克隆数，对于构建基因组文 库有重要的指导意义。
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典型的基因组文库应能“代表”整套的DNA片 段，这些序列和原来样本中存在的所有DNA序 列相一致，并保持原有的相关丰度。
当需要时，人们能从DNA文库中分离任何特定
的基因片段。
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噬菌体克隆文库的构建。
(a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载体中 来构建基因组文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不 同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌 体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
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细胞 基因组 用限制性 酶剪切
用连接酶 连接
λ噬菌体 提取DNA 用限制性酶剪切
尼龙膜 与放射性探针 进行分子杂交
膜
重组噬菌体
重组体DNA
细菌 感染
裂解
释放噬菌体
菌苔 噬菌体克隆文库
噬菌斑中的 噬菌体克隆
用放射自显影 定位阳性克隆 膜
阳性克隆 感染新鲜 的宿主菌
扩增外 源基因
(b) 噬菌斑被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶 解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此 膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交， 可以杂交的便是目的基因。
带有此DNA的克隆可通过放射自显影而显现出来。
这样阳性克隆可从培养基中分离出来，再转接到新
鲜的宿主菌中，使目的因得到扩增。
ppt课件.
(a)用从原有的克隆DNA片段制备的放射性探针能从 典型的基因组文库中分离各种基因片段。用探针1 可用来筛选文库，从文库中分离重组DNA片段。用 探针2和3来获得与上述片段部分重叠的DNA序列。
罕见的酶切位点和重复DNA序列(如Alu分散元件)可 作为界标，用来排列分离的基因组DNA克隆。
(b)从文库中分离的单个的克隆片段含有最小的重叠 DNA片段的复合位点。在图中表示已克隆的50kb的 基因组DNA中含有三个转录的基因。
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用噬菌体置换型载体构建基因文库。
用限制性酶消解噬菌体载体，切除了中央的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将约 15kb的酶切片段随机地和噬菌体载体的两臂连接， 形成线性的重组的串联体。
用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分 别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌 体颗粒。
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
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限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
(b) mRNA
mRNA
mRNA 5kb
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7Hale Waihona Puke Baidu
一个典型的基因组文库含带有重叠基因片段的多拷 贝克隆。
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将数据代入上式
N ln(1 0.99) ln(1 20kb/ 3Gb)
= 7×105
N的含义是克隆大小为20kb的人类DNA时，所构建的 基因文库数必须在7×105 个以上克隆时，才能以99 ％的概率得到此克隆。
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二、构建基因文库的克隆载体 和筛选策略
构建基因组文库的第一步是将基因组 DNA用限制性酶切成小片段，但酶的选 择和酶切反应条件的选择是取决于克隆 载体的类型
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三、亚克隆
所谓亚克隆（sub-clone）就是对已经克隆的目 的DNA片段经限制性酶消解后再次重新克隆， 其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或进 行“重编程”。
亚克隆的基本过程：
①制备目的DNA片段和载体；
②连接目的DNA片段和载体；
③重组载体转化到宿主中；
④筛选重组子。
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噬菌体克隆文库的构建。 (a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载 体中来构建基因组DNA文库。菌苔上的噬菌斑 中含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑 来自单个感染噬菌体的一个克隆。
(b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬菌体 的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附 到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的 探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。
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Clarke-Carbon公式
任一DNA序列在文库中出现的概率：
N ln(1 p ) ln(1 I / G )
N：该序列需要克隆的总数； P：待克隆DNA序列在文库中设定的出现概
率，一般为99％； I ：待克隆DNA片段的长度，假定为20kb; G : 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp
无论是建立基因组文库还是cDNA文库，其目的是：
①从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；
②是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀
有的cDNA克隆。
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第一节 基因文库的构建
一、基因组文库和cDNA文库
基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机 片断的重组DNA克隆群。其中可能含有基因外 显子、内含子、基因5'端调控区、3'端的尾随 序列以及基因间的间隔区。