抗氧化实验方法

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3种抗氧化活性测定方法

抗氧化活性测定是评估物质抗氧化能力的重要方法，常用于食品、药

物和化妆品等领域。下面将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法。

一、DPPH自由基清除法

DPPH(2,2-二苯基-1-苦味肼)是一种常用的抗氧化剂，它能采用紫色

的自由基形式存在，并且在反应中会转变为无色的稳定形式。DPPH自由

基清除法是一种简单而直观的测定方法。

该方法的基本原理是将待测物添加到预先溶解的DPPH中，反应一段

时间后，根据颜色变化程度来评估抗氧化活性。通过测量样品溶液吸光度

的降低来计算其清除率，清除率越高，抗氧化能力越强。

二、FRAP法

FRAP(铁还原能力)法是一种评估抗氧化物质电子给予能力的方法。抗

氧化物质能够通过给予电子来中和自由基的电子，从而保护细胞免受氧化

损伤。

FRAP法通过反应产生的铁（II）络合物的吸光度变化来评估样品的

抗氧化能力。具体操作中，将待测物加入到铁（III）试剂（通常为铁(III)氯化物）中，待反应一定时间后，读取吸光度。样品的抗氧化能力

可以通过吸光度的变化来计算。

三、TBARS法

TBARS(硫代巴比妥酸反应物)法是一种评估脂质过氧化的方法。脂质

过氧化是一种自由基引起的反应，会导致脂质的氧化和脂质分解产生不稳

定化合物。TBARS法主要用于评估食品和药物等样品中脂质过氧化的程度。

该方法通过将待测样品与反应试剂（如硫代巴比妥酸）反应生成稳定的色素产物，然后测量这种产物的吸光度来评估脂质过氧化的程度。吸光度越高，脂质过氧化程度越高。

综上所述，DPPH自由基清除法、FRAP法和TBARS法是常用的抗氧化活性测定方法。每种方法都有其独特的原理和应用范围，选择适合的方法可以准确评估样品的抗氧化能力。在实际应用中，可以根据实验需求选择合适的方法，或结合多种方法综合评估抗氧化活性。

抗氧化酶测定实验方法

抗氧化酶是一类酶系统，它能够抵御氧自由基的伤害，维持细胞内环

境的稳定。常见的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(Cat)

和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等。测定抗氧化酶活性能够评估抗氧化能力，进而为疾病的诊断和治疗提供参考。

以下是抗氧化酶测定的实验方法。

实验材料：

1.磷酸盐缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7-8)。

2.高速冰箱和离心机。

3. 0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液：将L-酪氨酸溶解于0.1 mol/L

的盐酸溶液中，并加入0.5% (w/v) 卵白饼干碎片。

4.超氧化物解毒酶(SOD)标准品：如肝脏SOD标准品。

5.乙醇、乙醚、碘仿、硝酸等有机试剂。

6.2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-（二苯嘧啶)-2H-四唑(INT)。

实验步骤：

1.组织预处理：取所需组织样品，酶解和离心得到提取液(组织块破

碎并添加合适的缓冲液)，离心清除杂质得到上清液。

2. 蛋白质含量检测：根据Bradford法或Lowry法，测定上清液中蛋

白质的含量。

3. 测定SOD活性：将上清液加入0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液，再加入0.5%的乙醇溶液，保护酪氨酸被SOD氧化，使其在酶作用下发生自动降解。离心，取上清液。在为反应液中加入INT（2.5 mmol/L），使之在SOD作用下发生氧化还原，反应生成紫色的一价酮衍生物。在滤紙上滴加提取液，通过比色计测定OD值。

4. 测定Cat活性：将提取液加入3%的过氧化氢溶液并充分混合。加入乙醚和碘仿的混合物，并离心。提取水相层和乙醚层。用硝酸溶液判断乙醚层中是否存在过氧化氢。通过测定乙醚层吸收光谱的变化来测定Cat 活性。

抗氧化物活性测定方法总结

抗氧化物活性测定方法是通过对样品中的抗氧化物质含量和抗氧化活性进行定量分析，评估其对自由基的清除能力和抗氧化能力。随着抗氧化研究的不断深入，测定方法也逐渐完善。以下是对常见的抗氧化物活性测定方法的总结。

1. ORAC法（氧化应激反应活性测定法）：该方法通过测定样品清除自由基的能力来评估其抗氧化活性。实验中，将样品与荧光试剂（如

2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)）共同作用，观察其清除自由基的能力，并通过建立标准曲线计算样品的ORAC值。

2.DPPH法（1,1-二苯基-2-苦味基-苦味酸磷）：该方法是一种常用的快速测定抗氧化活性的方法。实验中，将样品与DPPH稳定自由基共同作用，通过比色反应观察DPPH自由基被样品清除的程度，从而评估抗氧化活性。

3.ABTS法（2,2'-联氮双5-苯砜酸）：该方法通过ABTS离子自由基的生成和清除反应来测定样品的抗氧化活性。实验中，ABTS与过氧化氢反应生成ABTS离子自由基，通过观察样品对其的清除能力来评估抗氧化活性。

4.FRAP法（亚铁离子还原能力）：该方法基于样品对人造抗坏血酸（Fe3+）的还原能力，通过测量还原后的Fe2+离子的生成量来评估抗氧化活性。实验中，将样品与Fe3+离子反应生成Fe2+离子，通过比色反应来测定Fe2+的含量。

5. 碘标法（Iodine value）：该方法用于测定油脂、脂肪等样品的

抗氧化活性。实验中，将已知量的碘与样品中的不饱和化合物反应，在光

反应下观察反应终点的颜色变化，并根据标准曲线计算样品的抗氧化活性。

抗氧化实验方法

抗氧化实验⽅法

1还原⼒的测定

样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加⼊2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离⼼10min，取上清液2ml与2ml蒸馏⽔以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越⼤表明还原⼒越强。

注意：建议蛋⽩浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值⼤⼩⽽定。

0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。

铁氰化钾溶液应盛装在棕⾊瓶中。

⽐⾊⽫的⽤法：可见光(>400nm)⽤玻璃⽐⾊⽫（即没有标字母或者标G的⽐⾊⽫），紫外光时（<400nm）⽤⽯英⽐⾊⽫（即标Q字⽐⾊⽫）。

2 DPPH⾃由基清除活性的测定

将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％⼄醇中，混合，振荡，在

室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为：

空⽩为1.5 ml 95%的⼄醇加⼊1.5 ml蒸馏⽔调零。

式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏⽔在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的⼄醇在517nm处的吸光值；

Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值；

注意：建议酶解液蛋⽩浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率⽽定，最终结果应有清除率⼤于50%和⼩于50%的情况。

抗氧化功能评价方法

一、化学方法

1.自由基清除能力测定法：常见的方法有DPPH自由基清除法、ABTS 自由基清除法和超氧阴离子清除法。这些方法通过测定样品对自由基的清除能力，间接反映了其抗氧化能力。

2.过氧化氢清除能力测定法：该方法通过测定样品对过氧化氢的清除能力，评价其抗氧化能力。

3.金属螯合能力测定法：该方法测定样品与金属离子的结合能力，反映了样品的抗氧化能力。

4.过氧化物酶活性测定法：该方法测定样品中过氧化物酶的活性，评价其抗氧化能力。

二、生物学方法

1.细胞实验法：该方法通过将样品加入细胞培养基中，观察其对细胞的保护作用，评价其抗氧化能力。

2.动物模型实验法：将样品通过灌胃、注射等方式给予动物，观察其对动物体内氧化损伤的保护作用，评价其抗氧化能力。

3.人体试验法：将样品通过口服、注射等方式给予人体，观察其对人体内氧化损伤的保护作用，评价其抗氧化能力。

三、综合方法

1.多指标评价法：综合考虑样品在化学方法和生物学方法中的多个指标，给予综合评分，评价其抗氧化能力。

2.生物传感器法：利用生物传感器对样品进行检测，通过测定信号的变化来评价其抗氧化能力。

3.分子生物学方法：通过测定样品中相关基因的表达水平和蛋白质的表达水平，评价其抗氧化能力。

以上仅为抗氧化功能评价方法的一部分，不同方法的选择应根据具体的研究目的和样品类型来确定。在实际应用中，常常需要结合多个方法进行综合评价，以获得更准确的结果。

抗氧化实验方法

附录

抗衰老实验

实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：

超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl 缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：

在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。抑制率可根据下式计算：

式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率

二实验仪器和试剂：

1 主要仪器：

紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。

2 主要试剂：

待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。三试剂配制：

1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris

碱溶液。

2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL

水中。

3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris

碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。

4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三

酚定容于10mL水中。现配现用，4h内有效。

四实验方法：

1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于

(完整版)抗氧化试验方法

一、试验方法

1、DPPH自由基清除率的测定

本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。

1.1实验原理

1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。

1.2溶液的配制

0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。

1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%

公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值

A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值

A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值

将实验重复三次，求得清除率的平均值。

抗氧化活性测定方法

抗氧化活性测定方法在食品、药物、化妆品以及生物学研究中具有重要的应用价值。抗氧化活性是指物质对自由基的清除能力，其测定方法可以评估物质的抗氧化性能和保护细胞免受氧化损伤的能力。本文将介绍一些常用的抗氧化活性测定方法。

一、DPPH自由基清除法

DPPH自由基清除法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、该方法基于DPPH自由基的紫色溶液，在受到氧化损伤时会褪色。通过测定样品对DPPH自由基的清除能力，可以评估其抗氧化活性。

实验步骤：

1.准备0.1mM的DPPH溶液。

2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。

3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的DPPH溶液。

4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。

二、还原能力测定法

还原能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。该方法基于物质对氧化剂的还原能力，通过测定还原剂浓度与吸光度之间的关系，评估样品的抗氧化活性。

实验步骤：

1.准备一系列不同浓度的还原剂溶液。

2.取一定量的还原剂溶液，加入适量的氧化剂溶液。

3.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出还原剂的浓度与吸光度之间的关系。

4.根据吸光度与还原剂浓度的关系，评估样品的抗氧化活性。

三、总抗氧化能力测定法

总抗氧化能力测定法是一种综合评估样品抗氧化活性的方法。该方法基于样品的抗氧化剂含量和抗氧化活性，通过测定样品对氧自由基的清除能力，评估其总抗氧化能力。

实验步骤：

1.准备一定浓度的氧自由基溶液。

2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。

抗氧化活性研究方法

引言：

氧化反应是指分子或原子失去电子，而还原反应是指分子或原子获得电子。由于氧化反应产生的自由基具有高度活性，能够对细胞结构和功能造成损害，导致多种疾病的发生。因此，研究抗氧化活性及其机制对于预防和治疗这些疾病具有重要意义。本文将介绍几种常用的抗氧化活性研究方法。

一、DPPH自由基清除能力测定法

DPPH自由基清除能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色自由基，其颜色随着氧化程度的增加而减弱。在该方法中，将待测样品与DPPH溶液混合，通过测定混合液的吸光度变化来评估样品的抗氧化活性。抗氧化活性强的样品能够清除DPPH自由基，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降。

二、还原能力测定法

还原能力测定法是通过测定待测样品对还原剂的还原能力来评估其抗氧化活性。常用的还原剂包括铁离子、铜离子等。在该方法中，将待测样品与还原剂混合，通过测定混合液的吸光度变化或还原剂浓度的变化来评估样品的抗氧化活性。抗氧化活性强的样品能够还原还原剂，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降或还原剂浓度的降低。

三、氧化脂质抑制能力测定法

氧化脂质抑制能力测定法是通过测定待测样品对氧化脂质的抑制能力来评估其抗氧化活性。常用的氧化脂质包括脂肪酸、脂肪油等。在该方法

中，将待测样品与氧化脂质混合，通过测定混合液中脂质的氧化程度来评

估样品的抗氧化活性。抗氧化活性强的样品能够有效抑制氧化脂质的形成。

四、超氧阴离子清除能力测定法

超氧阴离子是一种常见的自由基，具有较高的活性。超氧阴离子清除

抗氧化实验方法

附录

抗衰老实验

实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：

超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl

缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：

在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制

超氧阴离子积累的作用能力。抑制率可根据下式计算：

式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率

二实验仪器和试剂：

1 主要仪器：

紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。

2 主要试剂：

待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。三试剂配制：

1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris

碱溶液。

2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL

水中。

3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris

碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。

4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三

酚定容于10mL水中。现配现用，4h内有效。

四实验方法：

1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于

抗氧化能力的测定的实验报告

实验报告：抗氧化能力的测定

引言：

抗氧化能力是指物质对抗氧化剂的抵抗能力，其重要性在于帮助人体抵御自由基的损害。本实验旨在通过测定不同样品的抗氧化能力，评估其对人体健康的潜在益处。

材料与方法：

1. 样品准备：从市场购买五种常见的食材作为实验样品，包括苹果、橙子、胡萝卜、菠菜和绿茶。

2. 样品提取：将每种食材分别切碎，并用乙醇提取其抗氧化物质。将每种样品放入研钵中，加入适量的乙醇，搅拌均匀，然后用滤纸过滤提取液。

3. 抗氧化能力测定：采用DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）自由基清除法测定样品的抗氧化能力。将每种样品提取液和已知浓度的抗氧化剂（例如维生素C）混合，反应一段时间后，测定混合溶液的吸光度。

4. 对照组设置：同时设置维生素C的对照组，以验证实验方法的准确性。

5. 数据处理：计算每种样品的抗氧化能力，以吸光度测定值的降低程度表示。使用统计学方法进行数据分析。

结果：

根据实验数据统计与分析，不同样品的抗氧化能力有所差异。其

中，绿茶和菠菜表现出较高的抗氧化能力，吸光度的降低程度较大，显示出较强的自由基清除能力。苹果、橙子和胡萝卜的抗氧化能力较低，吸光度的降低程度较小。

讨论：

本实验结果表明，绿茶和菠菜具有较强的抗氧化能力，可能对人体健康具有积极的影响。然而，需要进一步研究以验证这些食材中的具体抗氧化成分，并了解其作用机制。此外，实验中使用的DPPH自由基清除法仅是众多测定方法之一，其他方法也可以用于评估样品的抗氧化能力。

结论：

本实验通过测定不同样品的抗氧化能力，发现绿茶和菠菜具有较强的抗氧化能力，苹果、橙子和胡萝卜的抗氧化能力较低。这些结果为人们选择健康食材提供了一定的参考依据，但仍需进一步研究来确认这些食材对人体健康的确切益处。

常见体外抗氧化实验方法-抗氧化试验-抗氧化活性实验方法-抗氧化测定法-李熙灿Xican Li

常见体外抗氧化实验方法

(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3

①DPPH·自由基清除法 2 Array

②ABTS·+自由基清除法 5

③ FRAP法(铁还原法) 8

④过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自

氧化法)

⑤羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法) 14

⑥PTIO·自由基清除法(水溶液中) 16

⑦ CUPRAC法(铜还原法) 18

⑧铁络合能力(Ferrozin法) 20

⑨脂质过氧化清除法(亚油酸为底物) 23

⑩抗氧化产物的预测26

①DPPH·自由基清除法/DPPH法

原理：

DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。

当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。

实验操作[1]:

1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）

取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。该DPPH溶液避光保存，4h内用完。

（注意：如果是用分光光度计

．．．．．，则A＝0.6±0.02比较合适）

1.2 样品液的配置

样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。

怎么测量抗氧化能力的方法

测量抗氧化能力涉及许多不同的方法，以下是一些常用的方法：

1. 自由基清除能力测量：通过测量样品对自由基的清除能力来评估其抗氧化能力。常用的自由基包括DPPH (2,2-二苯基-1-苦味肼)、ABTS (2,2'-联氮二（3-乙基苯并噻唑啉酸琥珀酸盐）二阳离子)和超氧阴离子自由基。

2. 过氧化氢清除能力测量：过氧化氢清除能力（或称过氧化氢酶样本）测量了样品对过氧化氢的清除能力，过氧化氢是由超氧阴离子自由基生成的。

3. 铁还原能力测量：铁还原能力指样品还原Fe3+离子为Fe2+离子的能力。常用的铁还原能力测量方法包括FRAP (铁还原能力)和CUPRAC (铜还原能力)。

4. 水解抗氧化能力测量：通过测量样品对脂质氧化的抑制能力来评估其抗氧化能力。常用的方法包括TBARS (酸性的硫代巴比妥酸反应物)、比色法和荧光法。

5. 抗氧化酶活性测量：通过测量样品中抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽-S-转移酶）的活性来评估其抗氧化能力。

需要注意的是，测量抗氧化能力的方法多种多样，选择适合的方法应根据研究目的和样品特性进行。建议在进行实验之前进行充分的文献调研和试验验证，并在

专业人士的指导下进行实验操作。

抗氧化活性实验方法

抗氧化活性【1】实验方法（体外实验）

1、清除DPPH自由基能力的测定

称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对照。样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：

DPPH

()

1100%

A A

=-⨯

清除率

A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；

A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；

A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。

2、总还原能力的测定

在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL 蒸馏水和0.5mL FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。Vc作为阳性对照。

3、对Fe2+离子螯合能力的测定

分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。EDTA为阳性对照。样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：

体外抗氧化实验操作步骤

实验前准备：

1.准备所需试剂和设备，包括各种化学试剂、实验室常规设备和仪器。

2.清洗实验器具，保持实验环境干净。

3.为各个试验条件设置对照组，以进行对比分析。

实验步骤：

1.提取样品：根据实验要求，选择需要评估抗氧化作用的样品。将样

品加入适当的溶剂（如甲醇、乙醇等），用摇床搅拌混合，待溶解半小时

左右，然后离心离心管，离心后取上层液体。

2.总抗氧化能力的评估（TAC）：

2.1. 准备1.0mol/L的硫酸和5mmol/L的FeSO4溶液。

2.2. 将150μl的提取液加入试管中，加入1ml的硫酸和1ml的

FeSO4溶液。

2.3.在37℃恒温水浴中孵育30分钟，形成有色沉淀。

2.4.将试管放入离心机中，离心5分钟，弃去上清液。

2.5. 加入5ml去离子水彻底洗涤沉淀，重复离心和弃去上清液。

2.6. 加入2ml去离子水悬浮沉淀，加入2ml的硫酸和0.2ml的蒸馏水。

2.7.读取吸光度，计算出抗氧化能力。

3.单电子转移能力的评估（SET）：

3.1. 准备0.1mol/L的DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）溶液。

3.2. 向试管中加入100μl的提取液和2ml的DPPH溶液。

3.3.避光孵育30分钟，观察颜色变化。

3.4.分光光度计读取吸收值，计算样品的单电子转移能力。

4.过氧化氢清除能力的评估（CAT）：

4.1. 准备0.1mol/L过氧化氢溶液。

4.2. 加入100μl的提取液和2ml的过氧化氢溶液。

4.3.在室温下孵育10分钟，读取吸光度。

4.4.通过对照组计算样品的过氧化氢清除能力。

抗氧化测定方法（三种）

实验一超氧阴离子自由基清除能力的测定

——抗氧化实验之一

一、目的要求

通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。

二、实验原理

超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。

邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣∙，02﹣∙能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s 与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm 有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣∙的浓度，清除02﹣∙就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。

三、器材及试剂

（一）器材

恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。

（二）试剂

邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、BHT等。

（1）pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。