生物大分子的分离纯化技术 PPT课件
生物大分子的分离与制备(共89张PPT)
选择适宜的溶剂，使蛋白质等杂质形成沉淀而与核酸分离，这种方法称为选择性溶剂沉淀法 。 超声波破碎的有效能量利用率极低 采用快速加热（50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。 但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。
层析法
电泳法
超离心法
透析和超滤
→结晶
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破碎、 溶账和自溶、酶解、化学 处理）
2022/9/24
•盐析（硫酸铵盐析）
•等点电沉淀
•有机溶剂沉淀 •离心
依据原理
• 分子大小 • 溶解度
• 电荷性质 • 吸附性质
• 生物亲和力
胞内物质——破坏细胞壁或细胞膜后提取
细胞破碎的主要方法： 机械破碎 溶胀和自溶 化学处理：如丙酮、氯仿、甲苯、SDS等
生物酶降解
2022/9/24
细胞破碎技术
破碎方式
机械法
非机械法
固体剪切 作用
液体剪切 作用
干燥 处理
珠磨法 压榨 高
压
研磨
匀
2022/9/24
浆
超 酶溶法 声 破 碎
溶胞 作用
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
2. 透析
自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
生物样品中生物大分子的分离纯化
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（二）后期的精分级分离纯化 （精制分离方法）
• 一般样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分已被除去。 再根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小 等差异对粗制品进行进一步分离纯化。
性质
分子大小和形态
具体方法
差速离心、超滤法、分子筛、透析
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（三）生物材料的选择和预处理
1.从工业角度考虑
应选择含量高、来源丰富、易获
得且制备工艺简单、成本低廉的 动植物组织或微生物作为原料。
2.从科研角度考虑
只需考虑材料的选择符合实验预 定的目标要求即可。
11
生物材料的选择和预处理
3. 选植物材料时，注意植物的季节性、地理位置和生长 环境等；
4. 选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传 素质和生理状态等；
生物大分子的 分离纯化和鉴定
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子， 是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命 的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
什么是生物大分子？
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分 的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具 有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺 序和方式连接而形成的多聚体。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术
是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理
在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法
1. 柱层析法
柱层析法是中常用的重要方法之一。它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法
电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法
超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔
内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法
溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
生物大分子分离纯化技术(159页)
（5）生物大分子分离方法多采用温和的 “多阶式”方法进行。 一个生物分子的分离制备常常少则 几个，多至十几个步骤，并不断变换各 种分离方法，以达到纯化目的。
（6）对其均一性的评定常常是有条件的Leabharlann Baidu 与化学上纯度的概念并不完全相同。
（7）严格防止污染。 外界污染、 体系中重金属离子、 细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。
生物大分子分离纯化-原理与技术
原理与操作
上样 分离
装填有层析介 质的层析柱
分离组分流出
9 精品课件
2020/8/16
层析图
原理与操作
第一峰, 外水体积, Vo, 不与柱中填料相互作用直接从柱中流
出。这是样品中的未结合物质
Vo
Ve
蛋白质含量 (A280), 由UV检测器读出，y轴
洗脱峰，有些可以很好的分离， 有些分得不是很好，有部分交叉
• 2.脱盐
35精品课件
2020/8/16
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的特点：
1. 层析柱规模很大，实验室1.0-2.5×30-100cm，工艺10－20×200cm，从 而设备成本很高；
2. 上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果，如果 大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；
➢氟代羟基磷灰石介质（CFT） ➢疏水层析介质
Macro-Prep Methyl HIC Macro-Prep t-Butyl HIC Bio-Beads SM-2吸附剂
Affi-Gel硼胶
Affi-Gel配体固定化活化介质
18精品课件
2020/8/16
层析柱
分析柱
离子交换分析柱：Uno Q, S Aminex分析柱——分析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及肽和核酸有机小分
50.0 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.0 -0.010
生物大分子识别、分离和检测ppt课件
电喷雾质谱法 electron spray mass spectrometry ESMS
样品溶液经很细的进样管进入电喷雾室，在强电场的作 用下，样品溶液在出口处因电荷的分别和静电引力而破碎 成许多细小的带有电荷的液滴，当液滴蒸发到某一程度， 液滴外表的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续 此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发，就可获得自在彷徨 的质子化和去质子化的蛋白分子。
核磁共振技术方法处理了“看清〞生物大分子 “是什么样子〞的问题。
生物大分子的分别与检测
生物大分子通常来自天然产物或发酵液中，并以混合物、低浓度 的形状存在。
除了分子量大，还具有构造复杂〔具三级或四级构造〕，具有生 物活性，一旦条件不适宜就丧失活性，因此在分别技术上与普通的 小分子有机物的分别有差别。
激光解吸附电离质谱仪
核磁共振—— 一种提示生物大分子真面目的方法
在核磁共振技术出现以前，X射线晶体分析技术是独一可以研讨蛋 白质三维构造的方法。该法是根据蛋白质结晶对X射线的衍射作用实现 的。但该法不能对溶液进展分析。
核磁共振技术弥补了X射线晶体分析技术的缺乏，可以对溶液中的蛋白 质进展分析，即在蛋白质最自然的生存环境下对它们进展研讨，进而得 到“活〞蛋白质的构造。
1.物质分别技术论述 2.天然产物的分别提取原理及方法 3.天然产物粗提物的纯化原理及方法 4.天然产物定性、定量分析原理及方法 5.天然产物的构造分析原理及方法 6.物质定性、定量分析方法的顺应性
《生物分离与纯化》课件
将样品在离心机中进行高速旋转，根据不同密度和大小将组 分分离。
生物分离与纯化的实验操作 实验材料准备
过滤与萃取
使用滤膜或萃取剂将目标组分从其他 杂质中分离出来。
色谱分离
利用色谱技术，如凝胶电泳、高效液 相色谱等，将目标组分与其他杂质分 离。
生物分离与纯化的实验操作 实验材料准备
检测与鉴定
生物分离与纯化的基本原理
分子大小与形状
利用分子大小和形状差异进行 分离，如离心、过滤、凝胶电
泳等。
分子电荷
利用分子电荷差异进行分离， 如电泳、离子交换等。
分子亲和力
利用分子间的亲和力差异进行 分离，如亲和色谱、免疫沉淀 等。
物理性质
利用分子物理性质差异进行分 离，如萃取、蒸馏等。
02
生物分离与纯化的方法
利用两种不混溶的溶剂，将一种溶剂中的 溶质转移到另一种溶剂中，从而实现分离 的方法。
将待分离的物质从一种液相转移到另一种 液相中，再通过蒸馏等方法将溶剂回收。
固液萃取
反相微乳液萃取
利用固体吸附剂吸附溶液中的目标物质， 再通过洗脱等方法将目标物质回收。
利用反相微乳液作为萃取剂，将目标物质 从水相转移到油相中，再通过离心等方法 将油相和水相分离。
选择合适的分离方法，如离心 、过滤、萃取等，可以有效去 除杂质。
优化实验条件，如pH值、离子 强度、温度等，可以提高杂质 的去除效果。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。
1 沉淀法
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH 值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
⑴中盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
⑶选择沉淀（热变沉淀和酸碱变沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变的杂蛋白。
⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
生物大分子的分离纯化和鉴定
第六页，共15页
（二）根据分子大小不同的分离方法：
1、透析和超过滤：即利用蛋白质分子不能通过半 透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质（如无机盐、 单糖、水）等分开。
第七页，共15页
2、密度梯度（区带）离心：
盐析后必须脱盐。 脱盐最常见的方法是透析法，也可以用凝胶层析（葡聚糖凝
胶SephadexG25脱盐）、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点沉
淀法相结合使用。脱盐是否彻底，要经常进行检查。如除去
(NH4)2SO4可用10%BaCl2检查；除去NaCl可用10%AgNO3检查，直
到 透析液中检测不出BaSO4或AgCl为止，透析完成。
离方法.其性质包括: 。
（1）利用溶解度差别的分离方法
1、等电点沉淀：
蛋白质在等电点时溶解度最小。当蛋白质混合液的PH值被调到其 中某一种成分的PI时，该种成分蛋白质将会沉淀下来，这种沉淀出 来的蛋白质保持着天然构象（活性）能再溶解。高于或低于该PI的 蛋白质留在溶液。
如：Glu的生产也是利用此性质进行的， Glu PI 3.22。
第五页，共15页
3、有机溶剂分级法
有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介 电常数，水是高介电常数（20℃时，80），有机溶剂是低介 电常数物质（20℃时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4），因此 有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分 子表面的可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因 此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉 淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质争夺水化（膜） 水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化是指对生物大分子，如蛋白质、核酸、多肽以及其他生物高分
子的理化分离，以获得所需的高级别的纯度和净化标准的过程。此外，功能地也可以应用
于提取细胞和细胞组织特定的成分。
一般来说，分离纯化同表征大分子是以不同的方式实现的。对于蛋白质，离心分离是
一种常用的技术，这是一种使用立体速度分离不同物质的有效方法。因为蛋白质它们有不
同的表面电荷和大小，因此它们在加速度下受到不同的力，从而能够受到力，从而使不同
的类型的蛋白质分离开来，产生分离纯化的产物。
此外，层析技术也可以用于对蛋白质进行分离纯化。这个过程使用一种特定的介质，
该介质被用于环境或两种环境之间的运动原理，通过独特的该介质通道，根据不同的冶金
电荷，使得蛋白质分离到不同的有效产品中。
另外，还有其他许多特定技术可以用于生物大分子的分离纯化，比如电泳和柱层析技术。这两种技术都是基于维持生物大分子的不同状态（流变或电泳）的原理，这种状态可
以使不同的成分分离开来，从而获取高纯度的成分。这两种技术的精确度取决于集成柱的
大小和类型，以及实现特定的湿度和电荷的原理。
当讨论以上技术以外的技术时，分离和精制并不是只有蛋白质才有，尽管在蛋白质的
技术中可能是最常见的，但核酸、多肽和其他有机分子也可以用这些技术进行分离和精制。有几种不同的方法可以用于高级分离现象，其中一些是像柱层析、集成离子交换以及沉淀法，这些技术被广泛应用于生物大分子的分离和纯化。
总的来说，生物大分子的分离纯化是一种复杂的过程，需要仔细挑选一种或多种分离
纯化技术，以实现所需的纯度要求的目的。选择的技术必须适合特定的大分子和纯度要求，以实现最佳效果。
生物大分子的分离纯化和鉴定
03
生物大分子的鉴定
鉴定方法
化学分析法：通 过化学反应对生 物大分子的组成 和结构进行分析。
免疫分析法：利 用抗体与抗原的 特异性结合，对 生物大分子进行 检测和识别。
生物活性测定法： 通过检测生物大 分子对细胞或生 物体的活性影响， 确定其结构和功 能。
分子生物学方法： 利用分子杂交、 PCR等技术对生 物大分子进行基 因水平和蛋白质 水平的鉴定。
分离纯化的应用
生物制药：分离纯化技术用于制备高纯度药物，提高药物的疗效和安全性。
基因工程：通过分离纯化技术获得纯化的基因或蛋白质，用于基因治疗、药物研发和生物 医学研究等领域。
蛋白质组学：分离纯化技术用于蛋白质的分离、纯化和鉴定，促进蛋白质组学的研究和发 展。
生物燃料：分离纯化技术用于生产高纯度的生物燃料，如乙醇、生物柴油等，替代化石燃 料，减少环境污染。
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生物大分子的分离纯化和
鉴定
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生物大分子的分离纯化
生物大分子的鉴定
生物大分子分离纯化和鉴定的技术 发展
生物大分子分离纯化和鉴定的应用 领域
01
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02
生物大分子的分离纯化
分离纯化的方法
离心法：利用离心机的高速旋转产生的离心力使生物大分子沉降或悬浮，达到分离纯化 的目的。
第七章 生物大分子的色谱分离和纯化
固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。 气液色谱的固定相: 由 担体和固定液所组成。
固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。 气固色谱的分离机理:
吸附与脱附的不断重复过程； 气液色谱的分离机理：
气液两相间的反复多次分配过程。
气相色谱分离过程
当 试 样 由 载 气 携 带 进 入 色 谱 柱与固定相接触时，被固定相 溶解或吸附。 随 着 载 气 的 不 断 通 入 ， 被 溶 解或吸附的组分又从固定相中 挥发或脱附， 挥 发 或 脱 附 下 的 组 分 随 着 载 气向前移动时又再次被固定相 溶解或吸附。 随 着 载 气 的 流 动 ， 溶 解 、 挥 发，或吸附、脱附的过程反复 地进行。
2.色谱法分类:气相色谱和液相色谱
生物工程下游技术中以液相柱色谱为主
2.色谱法分类:气相色谱和液相色谱
气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱
液相色谱
液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 例如离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂 为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。
生物大分子的分离和纯化技术
生物大分子的分离和纯化技术生物大分子是指具有较大分子量的生物分子，如蛋白质、核酸、多糖等。要研究这些生物大分子的结构和功能，需要对它们进行
分离和纯化。生物大分子的分离和纯化技术是生物学和生物工程
学中的重要内容，它们的发展和应用使得我们能够更深入地了解
生命的奥秘，同时也推动了医药、农业、工业等领域的发展。
生物大分子的分离和纯化需要经过多个步骤，这些步骤通常包
括细胞破碎、分子分离、分子鉴定等。其中，分子分离是最基本、最关键的步骤之一，它可以使得目标分子从复杂混合物中被分离
出来，并得到相对纯度较高的产物。目前，生物大分子的分离和
纯化技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、尺寸排
除层析、逆向相色谱层析和高效液相色谱层析等方法。
凝胶过滤层析是一种基于分子尺寸差异的分离方法。在这种方
法中，样品被加入到一列凝胶柱中，较大的分子无法穿过凝胶孔隙，而较小的分子则可以顺着凝胶孔隙通过。因此，随着溶液通
过凝胶柱，不同大小的分子会被分离出来。这种方法适用于大小
分子差异较大的生物大分子的分离。
离子交换层析是基于分子电荷的分离方法。在这种方法中，一
种带有正电荷或负电荷的树脂被用来吸附目标分子，通过控制溶
液的pH和离子强度等参数，可以使得目标分子从树脂上逐渐被洗下来。这种方法适用于分子之间的电荷差异较大的生物大分子的
分离，如蛋白质。
亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。在这种方法中，
一种特殊的树脂被用来吸附具有特定结构或性质的目标分子。例如，可以将某种亲合剂固定在树脂上，然后用于吸附与该亲合剂
有特异结合关系的目标分子。这种方法适用于具有高度特异性活
生物大分子分离纯化技术ppt课件
生物大分子分离纯化技术
1
2.4. 生物大分子的色谱分离纯化技术
2
2.4.1 高效毛细管电泳
高效毛细管电泳 (High-performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是荷电粒子在直流高压的 作用下，在毛细管中迁移，从而进行高效、快速 分离的一种电泳新技术。其分离是基于带电离子 在电场中的不同的电泳淌度。它的基本原理与常 规凝胶电泳或自由电泳并无本质的差别。所以， HPCE可以看成是一种仪器化程度比较高的电泳方 式。
也被称之为凝胶过滤色谱是20世纪60年代发展起来 的一种特别适合于生物大分子分离和纯化的技术。
21
基本原理 排阻色谱是依据分离样品物质分子大小而进行分
离的一种方法，其固定相由一种惰性的凝胶颗粒构 成，颗粒内部有许多网孔。颗粒和网孔的大小都可 以人为地去控制和选择。在分离过程中，比网孔大 的分子不能进入网孔的内部，它们只限于在凝胶颗 粒之间的流动相空间里向下流动，其流程短．流动 速度快，而比网孔小的分子能扩散到网孔的内部， 因而向下移动时所经历的流程长，下行速度慢。最 终所产生的结果是：分子越大移动的越快，从而达 到大小不同分子间的分离。
22
23
凝胶色谱的物理特性
1．凝胶颗粒的大小和形状 层析用凝胶的形状均为球形，内部具有高密度
网孔，并能形成均一的柱床。
生物大分子的分离纯化
去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙脂) 抑制内源性RNase的活性
RＮase阻抑蛋白（RＮasin，非竞争性抑制剂） 氧铜核糖核苷复合物硅藻土
RNA的抽提与纯化
总RNA的制备
真核生物mRNA的纯化
寡聚(dT)
亲和层析柱分离mRNA。
Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分离多 聚(A)mRNA。
◆
离心，染色体DNA、RNA、蛋白质-SDS复 合物等沉淀下来而被除去。
（1）原理
变性 强碱 DNA双链 中性 复性 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快； DNA单链
染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。
2、影响电泳迁移速率的因素
1 ）分子筛效应 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取 决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。 2）相对分子质量
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值 成反比关系。
3）构型 超螺旋型>线状分子>开环状分子
3、DNA的琼脂糖凝胶电泳
1）DNA的显示原理： 溴化乙锭 琼脂糖凝胶 紫外光照射下能发射荧光。 指示剂，
不同构像质粒
分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度
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溶液的澄清 微量沉淀物的收集 细菌细胞的收集
盐析
基本原理：
在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增 加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不 断降低而沉淀析出，即盐析。
盐析实验应注意的问题：
盐类的选择：硫酸铵 （767g/l, 25℃) 盐的饱和度： 温度：室温或4℃ pH：等电点 蛋白质的浓度：
冷冻干燥
基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下
进行干燥的方法。
冷冻干燥的条件：温度，-10~-40℃；真空度， 13~40 Pa。
离心
基本原理 种类：
普通离心机（6000rpm)， 高速离心机(25000 rpm)， 超速离心机
转子：固定角度式，
悬挂吊桶式
离心(2)
离心力和相对离心力(Relative centrifugal force)：
样品的采集 血样：
全血：肝素抗凝（0.02~0.2mg/ml) 血浆：2000g离心10min 血细胞： 血清：5~30 min自凝分离
尿样：酸式采集（HCl或硼酸，pH<2.5)，
碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌）
唾液： 组织样品：液氮等冷冻
酶样品的准备
酶活性的保持
控制纯化过程中的pH、温度及有机试剂 加入载体蛋白防止酶的吸附，如: BSA 加入辅助因子保护活性部位, 如: EDTA,巯基乙醇，谷胱甘肽 抑制蛋白酶的水解作用，如: 氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）
F=mω2r; Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r
沉淀速度与沉降系数：
F摩擦=fv
F净=(Mp-Ms)ω2r-fv
沉降系数：沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒
的沉降速度）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于 1×10-13到200×10-13秒的范围. 以1×10-13s 为一个单位, 称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.
亲和色谱
固定相
葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺 －琼脂糖混合凝胶， （与凝胶色谱相似）
配基：
分离抗体用抗原，半抗原 分离酶用底物， 抑制剂，辅助因子等 通用型配基， 巯基丙基－琼脂糖
含巯基配体亲和色谱分离原理
亲和色谱
配基与载体的结合
琼脂糖的溴化氰活化法
6-氨基己酸－琼脂糖和,1,6-己二胺－琼脂糖
酰-亮-亮-精三肽等
亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等
样品制备
从组织或器官制备样品 从组织或器官培养液中制备样品 从生物体液中制备样品 （5000 rpm,15 min) 从细胞培养液制备样品
电泳分离纯化技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 高效毛细管电泳
电泳分离纯化技术
基本原理
V=μe E
亲和层析的特点：
层析柱短 配基－与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合
聚丙烯酰胺凝胶电泳(2)
凝胶电泳的装置 柱型(Column Gel):
10cm×6cm
板型(Slab Gel):
12cm×12cm或14cm×16cm; 玻璃板间距1.75或1.5 cm.
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (盘状电泳) 电荷效应 浓缩效应 分子筛效应
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用
(μe 为电泳迁移率,即电场强度为1 V/cm 时的迁移速率.)
影响电泳分离的因素:
物质本身的结构和性质: 荷电性质, 形状 支持介质: 吸附作用,电渗作用 溶液介质: pH, 离子强度 电场强度: 常压 500 V
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶的结 构和性质
凝胶的机械强度、弹性、 透明度和黏度等取决于凝 胶的总浓度:
毛细管凝胶电泳
（Capillary Gel Electrophoresis, CGE)
毛细管等电聚焦
（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF)
CGE的应用
DNA序列分析 蛋白质分析 物理胶CZE
生物大分子的色谱分离纯化技术
排阻色谱 亲和色谱 离子交换色谱 反相及疏水作用色谱 液－液分配色谱
琼脂糖凝胶电泳的应用
限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段的分析 DNA超螺旋结构的鉴定 DNA分子量的测定 脉冲场凝胶电泳
DNA分子量的测定
仪器
高效毛细管电泳
毛细管: I.D,25~100μm;O.D.,100~400μm; L, 0.1~1 m 进样系统: nL~pL, 流体力学方法和电动进样 高压直流电源：30kV, 1~300μA 检测
纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
透析液: 水, 缓冲液, 高分子的浓溶液
Donnan效应: pH变化
(勤换透析液,使用大量的透析液)
Donnan效应:
微过滤
微过滤的类型:
深层滤器(Depth Filter) : 滤膜滤器(Screen Filter):纤维素醋酸酯(硝酸酯)
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
1% SDS+ 0.1 M 巯基乙醇 分子量1.0×104~2.0×105
蛋白质的等电聚焦(Isoelectric Focusing, IEF) 原理 pH梯度的形成与保持
琼脂糖凝胶电泳
特点：
适合分子量大的分子；无毒；分辨率高；重复性好
胶浓度：0.5%~3%；分离1~9.0×107DNA片段 0.5~1.0% 胶分离0.5~30 kb DNA, 1.0~1.5% 胶分离小片段
离心(3)
离心技术的类型：
最大速度方法：
移动界面（Moving Boundary)超速离心法
移动区带(Moving Zone)超速 离心法
等密度方法(Isodensity)：
临床及生化分析样品的预处理
样品的类型、采集与保存 酶样品的准备
样品的类型、采集与保存
样品的类型：
样品的类型、Biblioteka Baidu集与保存
生物大分子的分离纯化技术
生物样品的特点: 生物活性 复杂性
内容: 生物样品的常规分离纯化方法 临床及生化分析样品的预处理 生物大分子的电泳分离纯化技术 生物大分子的色谱分离纯化技术
生物样品的常规分离纯化方法
透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心
透析
基本原理
透析膜:
材料: 火棉胶(Collodion), 玻璃纸(Cellophane), 纤维素 (Cellulose)
紫外-可见吸收法 荧光检测法 电化学检测法 质谱法
高效毛细管电泳
基本概念： 电泳淌度 电渗流
分析参数： 淌度和迁移时间 分离效率 分离度
高效毛细管电泳分离模式
毛细管区带电泳
（Capillary Zone Electrophoresis, CZE)
毛细管胶束电泳
（Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography, CEKC)