生物大分子的分离纯化技术 PPT课件
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生物大分子的分离与制备(共89张PPT)
2022/9/24
2022/9/24 7
生物分子的结构与功能分析：
1. 蛋白质结构分析
2. 酶活力检测
3. 蛋白质组学分析
4. DNA序列分析
5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交
7. 基因克隆8. 基因组构建9. cDNA构建
10. 筛选11. 报告基因检测12. 基因芯片
13. 基因敲除
➢ 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋 白质的合成。
2022/9/24
生物化学分离方法与一般的化学分离方法相比，有下列
几个特点： • 生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化
合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢 变化，如蛋白质和核酸的水解。
有些化合物的含量极微，如激素等。 许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变 变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。
• 功能或分子生物化学阶段（1950 年至今）。研究生命的本质和奥秘： 运动、神经、内分泌、生长、发育、繁殖等的分子机理 。
2022/9/24
2022/9/24
3
生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究的方法：
– 观察：生命现象
– 分离：未知蛋白组分，新基因片段，新的次生代谢物。 （抽提、过 滤、离心、色谱）
立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之 间相互聚集并从溶液中析出。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。
脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热 （50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后 凝聚成油块而被除去。
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生物分子的结构与功能分析：
1. 蛋白质结构分析
2. 酶活力检测
3. 蛋白质组学分析
4. DNA序列分析
5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交
7. 基因克隆8. 基因组构建9. cDNA构建
10. 筛选11. 报告基因检测12. 基因芯片
13. 基因敲除
➢ 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋 白质的合成。
2022/9/24
生物化学分离方法与一般的化学分离方法相比，有下列
几个特点： • 生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化
合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢 变化，如蛋白质和核酸的水解。
有些化合物的含量极微，如激素等。 许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变 变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。
• 功能或分子生物化学阶段（1950 年至今）。研究生命的本质和奥秘： 运动、神经、内分泌、生长、发育、繁殖等的分子机理 。
2022/9/24
2022/9/24
3
生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究的方法：
– 观察：生命现象
– 分离：未知蛋白组分，新基因片段，新的次生代谢物。 （抽提、过 滤、离心、色谱）
立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之 间相互聚集并从溶液中析出。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。
脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热 （50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后 凝聚成油块而被除去。
生物大分子分离纯化技术(159页)
沉降a动力学的b等密度的流体动力流体动力流体动力流体动力机械作用静电引力静电引力静电引力静电引力静电引力电动力静电引力电动力渗透力流体动力温度梯度重力结晶格子能重力离心力离心力表面能范德瓦氏力位阻效应静电引力极化度分子筛效应扩散偶极作用缔合和解离效应渗透作用渗透缔合和解离效应分子摩擦力极化度动电作用分子摩擦力极化度动电作用表面能分子筛效应分子摩擦效应分子筛效应电动力分子筛效应分子筛效应表面能吸附分子摩擦效应扩散分子摩擦效应f2f2f2f2f2f1f1f1和和f2平衡作用f1f1和和f2f2f2f2f1f1平衡作用极性位阻因素离子性质分子大小极性因素分子大小极性因素离子性质离子性质离子性质分子大小离子性质离子性质分子大小离子性质分子大小分子大小分子大小分子大小形状分子大小分子大小介质密度细胞外液细胞内液发酵液预处理细胞分离细胞破碎碎片分离提取精制成品制作加热过滤匀浆法离心沉淀重结晶浓缩调ph离心研磨法双水相吸附离子交换干燥絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌过滤超滤膜分离成型结晶图11生物工业下游技术一般工艺过程三
亲和色谱法由于具有极高的生物特异性，分离目的物受到理 化性质相似的杂质干扰极少，能从比较复杂的组织抽提液或细菌 发酵液中一步提取分离出所需的物质，提纯倍数可达一百倍以上 。
早期分离提纯的方法，选择的原则一般是从低分辨能力到高分 辨能力，而且负荷量较大为合适。但随着许多新技术的建立，一 个特异性方法其分辨能力越高，便意味着提纯步骤的简化，提纯 步骤的减少，回收率越高，具有生理活性物质变性的危险性就越 少。
制备物均一性的鉴定
对一个新分离的物质是否纯，常用“均一性 ”表示，均一性即指所获得的制备物只具有一 种完全相同的成分。蛋白质均一性常用的几种 鉴定方法：
1.溶解度法： 2.电泳均一性的测定法： 3.高速离心沉淀法：
亲和色谱法由于具有极高的生物特异性，分离目的物受到理 化性质相似的杂质干扰极少，能从比较复杂的组织抽提液或细菌 发酵液中一步提取分离出所需的物质，提纯倍数可达一百倍以上 。
早期分离提纯的方法，选择的原则一般是从低分辨能力到高分 辨能力，而且负荷量较大为合适。但随着许多新技术的建立，一 个特异性方法其分辨能力越高，便意味着提纯步骤的简化，提纯 步骤的减少，回收率越高，具有生理活性物质变性的危险性就越 少。
制备物均一性的鉴定
对一个新分离的物质是否纯，常用“均一性 ”表示，均一性即指所获得的制备物只具有一 种完全相同的成分。蛋白质均一性常用的几种 鉴定方法：
1.溶解度法： 2.电泳均一性的测定法： 3.高速离心沉淀法：
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。
为了避免盲目，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。
常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
本章以介绍沉淀法为主。
1 沉淀法沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH 值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：⑴中盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
⑶选择沉淀（热变沉淀和酸碱变沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变的杂蛋白。
⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
⑸有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
1.1 中盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中盐使生物大分子沉淀析出的过程称为"盐析"。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。
《生物分离与纯化》课件
阻色谱等。
精细分离的效果取决于目标物质 的性质、分离方法和分离条件的 选择，需根据实际情况进行调整
。
纯化与鉴定
纯化与鉴定的目的是进一步去除杂质，提高目标物质的纯度和鉴定其性质 。
常用的纯化方法有超滤、结晶和电泳等。鉴定方法包括光谱分析、质谱分 析和免疫分析等。
纯化与鉴定的效果取决于目标物质的性质、纯化和鉴定方法的选择以及实 验条件，需根据实际情况进行调整。
离心法
离心法
利用不同物质在离心力场中的沉降速度不同 ，将悬浮液中的物质进行分离的方法。
速率区带离心法
利用不同颗粒在离心力场中的运动轨迹不同 ，将颗粒按大小和密度进行分离。
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将不同大小的颗粒分 离开。
密度梯度离心法
在离心管中加入密度梯度介质，使不同密度 的颗粒在离心力场中分离。
实验效率的提高
提高实验效率是生物分离与纯化的关 键，可以缩短实验时间并降低成本。
优化实验流程，如减少样品处理时间 、提高自动化程度等，也可以提高实 验效率。
选择高效的分离方法，如高效液相色 谱、快速色谱等，可以显著提高实验 效率。
06
生物分离与纯化的未来发展
新技术的应用
1 2
人工智能与机器学习
初步分离的目的是将破碎后的细胞混合物分离成 各个组分，如蛋白质、核酸和脂质等。
常用的初步分离方法有离心分离、过滤分离和沉 淀分离等。
初步分离的效果取决于分离方法和分离条件的选 择，需根据实际情况进行调整。
精细分离
精细分离的目的是从初步分离后 的组分中进一步分离出目标物质
，如蛋白质、酶和核酸等。
常用的精细分离方法有亲和色谱 、离子交换色谱、凝胶色谱和排
电泳法
精细分离的效果取决于目标物质 的性质、分离方法和分离条件的 选择，需根据实际情况进行调整
。
纯化与鉴定
纯化与鉴定的目的是进一步去除杂质，提高目标物质的纯度和鉴定其性质 。
常用的纯化方法有超滤、结晶和电泳等。鉴定方法包括光谱分析、质谱分 析和免疫分析等。
纯化与鉴定的效果取决于目标物质的性质、纯化和鉴定方法的选择以及实 验条件，需根据实际情况进行调整。
离心法
离心法
利用不同物质在离心力场中的沉降速度不同 ，将悬浮液中的物质进行分离的方法。
速率区带离心法
利用不同颗粒在离心力场中的运动轨迹不同 ，将颗粒按大小和密度进行分离。
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将不同大小的颗粒分 离开。
密度梯度离心法
在离心管中加入密度梯度介质，使不同密度 的颗粒在离心力场中分离。
实验效率的提高
提高实验效率是生物分离与纯化的关 键，可以缩短实验时间并降低成本。
优化实验流程，如减少样品处理时间 、提高自动化程度等，也可以提高实 验效率。
选择高效的分离方法，如高效液相色 谱、快速色谱等，可以显著提高实验 效率。
06
生物分离与纯化的未来发展
新技术的应用
1 2
人工智能与机器学习
初步分离的目的是将破碎后的细胞混合物分离成 各个组分，如蛋白质、核酸和脂质等。
常用的初步分离方法有离心分离、过滤分离和沉 淀分离等。
初步分离的效果取决于分离方法和分离条件的选 择，需根据实际情况进行调整。
精细分离
精细分离的目的是从初步分离后 的组分中进一步分离出目标物质
，如蛋白质、酶和核酸等。
常用的精细分离方法有亲和色谱 、离子交换色谱、凝胶色谱和排
电泳法
生物大分子的分离纯化技术(共34张PPT)
范围. 以1×10-13s 为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg) ，用S(大写)表示.
离心(3)
最大速度方法：
移动界面（Moving Boundary)超 速离心法
移动区带(Moving Zone)超速离心法
等密度方法(Isodensity)：
样品的类型、采集与保存 酶样品的准备
亲和色谱
琼脂糖的溴化氰活化法
6-氨基己酸－琼脂糖和,1,6-己二胺－琼脂糖
层析柱短 配基－与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合
透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心
透析
透析膜:
材料: 火棉胶(Collodion), 玻璃纸(Cellophane), 纤维素 (Cellulose)
纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
透析液:
离心(2)
(Relative centrifugal force)：
F=mω2r;
Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r
F摩擦=fv
F净=(Mp-Ms)ω2r-fv
沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度 ）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的
紫外-可见吸收法 荧光检测法
电化学检测法
质谱法
高效毛细管电泳
电泳淌度 电渗流
淌度和迁移时间 分离效率 分离度
高效毛细管电泳分离模式
毛细管区带电泳
以1×10-13s 为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.
（Capillary Zone Electrophoresis, CZE) 纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
离心(3)
最大速度方法：
移动界面（Moving Boundary)超 速离心法
移动区带(Moving Zone)超速离心法
等密度方法(Isodensity)：
样品的类型、采集与保存 酶样品的准备
亲和色谱
琼脂糖的溴化氰活化法
6-氨基己酸－琼脂糖和,1,6-己二胺－琼脂糖
层析柱短 配基－与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合
透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心
透析
透析膜:
材料: 火棉胶(Collodion), 玻璃纸(Cellophane), 纤维素 (Cellulose)
纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
透析液:
离心(2)
(Relative centrifugal force)：
F=mω2r;
Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r
F摩擦=fv
F净=(Mp-Ms)ω2r-fv
沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度 ）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的
紫外-可见吸收法 荧光检测法
电化学检测法
质谱法
高效毛细管电泳
电泳淌度 电渗流
淌度和迁移时间 分离效率 分离度
高效毛细管电泳分离模式
毛细管区带电泳
以1×10-13s 为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.
（Capillary Zone Electrophoresis, CZE) 纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
生物大分子分离纯化-原理与技术
• 2.脱盐
35精品课件
2020/8/16
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的特点：
1. 层析柱规模很大，实验室1.0-2.5×30-100cm，工艺10－20×200cm，从 而设备成本很高；
2. 上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果，如果 大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；
2020/8/16
凝胶过滤层析
凝胶的选择
Bio-Gel P4(800-4,000) for separation digested products from IgG
27精品课件
2020/8/16
凝胶的选择
Bio-Gel P6(1000-6000)
凝胶过滤层析
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2020/8/16
凝胶的选择
largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorderofsizemoleculeslargerthanthematrixporespassstraightthroughdiffusionbufferdiffusionintotheporesdiffusionoutoftheporesbuffer凝胶过滤2320171128凝胶过滤层析分离纯化原理2420171128agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95water凝胶结构2520171128stericexclusionleadstoearlyelution?按照分子量大小洗脱?大分子首先洗脱最小的分子在最后面洗脱2620171128100100010000100000biogelp2biogelp4biogelp6biogelp10biogelp30biogelp60biogelp1001800800400010006000用于脱盐1500200002500400003000600005000100000100凝胶过滤层析凝胶的选择2720171128biogelp48004000forseparationdigestedproductsfromigg凝胶过滤层析凝胶的选择2820171128凝胶过滤层析biogelp610006000凝胶的选择2920171128凝胶过滤层析biogelp10150020000凝胶的选择3020171128凝胶过滤层析bioscaleminibiogelp6脱盐预装柱?操作方便可连接在duoflowlpprofinia和econo泵上3120171128biobeadssx介质多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体biobeadssx1biobeadssx3600biobeadssx81000biobeadssx12400高分辨率亲脂性分子排阻色谱200014000中草药和天然产物活性成分分离纯化高分辨率快速纯化酯类芳香族多环杂环化合物高分辨率快速纯化酯类芳香族多环杂环化合物介质可兼容苯甲苯二甲苯四氯化碳二甲基甲酰胺酮二氯甲烷二氯代苯全氯乙烯等有机溶剂介质可兼容苯甲苯二甲苯四氯化碳二甲基甲酰胺酮二氯甲烷二氯代苯全氯乙烯等有机溶剂凝胶过滤层析32201711281三硬脂酸甘油酯8912三肉豆蔻酸甘油酯7293三月桂酸甘油酯
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1. 层析柱规模很大，实验室1.0-2.5×30-100cm，工艺10－20×200cm，从 而设备成本很高；
2. 上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果，如果 大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；
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生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）1. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
从生物样品中分离纯化生物大分子ppt课件
10
4.生物材料的处理：生物大分子来源通常为生物组织 或微生物菌落，首先需要破碎组织。
4.1机械法： 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加
入少量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，
通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用 10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速 分散器)将组织的细胞打碎。(植物微生物）
（2） 防止核酸生物降解 DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂 RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素；
复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物
14
5.1.2 分离纯化的步骤： (1)去除杂质：生物样品内常含有大量多糖，脂质，蛋
白质等杂志，利用物理或化学方法将其除去。 (2)浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的溶
5.3.2 多糖的分离纯化：
(一）从生物样品中分离纯化生物 大分子方法
1.提取对象选择
2.制5.生物大分子提取方法
9
1.提取对象选择：确定细胞内目标分子的种类， 和目标分子的位置。
2.制定提取方案：确定一套能够确定完善分离 高纯度目标分子的方法。
3.文献查阅和前期预备性实验：通过文献资料 掌握四种分子理化性质，完善计划，确定分离 途径、
对该酶的特性结果及分子量不 明确，无法利用分子量差异分 离，但可以利用其等电点完成 分离。鉴定过程中利用SDSPAGE电泳技术可以鉴定亚基情 况是否是符合要求。
7
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线 4.仪器及试剂 5.前期研究基础或预实验结果
8
4.生物材料的处理：生物大分子来源通常为生物组织 或微生物菌落，首先需要破碎组织。
4.1机械法： 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加
入少量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，
通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用 10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速 分散器)将组织的细胞打碎。(植物微生物）
（2） 防止核酸生物降解 DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂 RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素；
复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物
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5.1.2 分离纯化的步骤： (1)去除杂质：生物样品内常含有大量多糖，脂质，蛋
白质等杂志，利用物理或化学方法将其除去。 (2)浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的溶
5.3.2 多糖的分离纯化：
(一）从生物样品中分离纯化生物 大分子方法
1.提取对象选择
2.制5.生物大分子提取方法
9
1.提取对象选择：确定细胞内目标分子的种类， 和目标分子的位置。
2.制定提取方案：确定一套能够确定完善分离 高纯度目标分子的方法。
3.文献查阅和前期预备性实验：通过文献资料 掌握四种分子理化性质，完善计划，确定分离 途径、
对该酶的特性结果及分子量不 明确，无法利用分子量差异分 离，但可以利用其等电点完成 分离。鉴定过程中利用SDSPAGE电泳技术可以鉴定亚基情 况是否是符合要求。
7
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线 4.仪器及试剂 5.前期研究基础或预实验结果
8
第09章 生物大分子的分离与纯化技术
结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟； 结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋 白质就容易被洗脱。 白质就容易被洗脱。
9.2.2 色谱条件
链烃作为配基（键合在固体基质上） ①固定相：常用C4 ～ C8链烃作为配基（键合在固体基质上） 固定相：常用 为填料。孔径25～ 为填料。孔径 ～50nm。 。 流动相： ②流动相： 水溶性有机溶剂（ 液 甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 水溶性有机溶剂（B液） （甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 洗脱能力增大 ＋水（A液） 液 强酸（三氟醋酸、甲酸、 ＋强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸 ） 加酸作用： 加酸作用： ∵－SiOH == －SiO- ＋ H+ • 蛋白质易与 蛋白质易与—SiO- 结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右 结合很难洗脱， 离解。 离解。 • 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。 ③温度：常温 温度：
9.1.1 生物大分子分离纯化的特殊性
1、要求产品保持其生物活性，也就是说要避免不可逆结构 、要求产品保持其生物活性， 变化发 生。 2、多孔填料必须使用大 孔径基质。 、 孔径基质。 3、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。所以在选 、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。 条件。 择色谱条件时不能随便套用小分子的 条件。
OH OCH2CH3
蛋 白 质
CH3
Ph
NH2 Ph COOH
OH 蛋白质疏水基团分布示意图
配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗脱机理 （即：溶质在色谱中的保留行为）： 溶质在色谱中的保留行为）： • 用“疏溶剂化理论”：蛋白质与配基的结合是由于溶质分 疏溶剂化理论” 子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向， 子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐 水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。 水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。 溶质和疏水配基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水 中的面积的多少而进行的。（即蛋白质在盐水体系中，有 中的面积的多少而进行的。 即蛋白质在盐水体系中， 一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。 一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。∵生物物质界 面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力） 面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力） 讨论
2生物大分子分离纯化技术2PPT教案
离心(Centrifugation)是蛋白质、酶、核酸及细胞 亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验 室中常用的分离、纯化或澄清的方法。尤其是超 速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的 常用技术方法。
基本原理 将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱
动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是 就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质 量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一 固定大小的离心场中沉降的速度也就不相同，由 此便可以得到相互间的分离。
5．蛋白质浓度 在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易发生沉淀， 但浓度过高时容易使其它杂蛋白共沉淀。因此．必须根 据具体情况选择蛋白质溶液的浓度。
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8
脱盐 用盐祈法分离纯化蛋白质后，常需要脱盐才
能获得纯品，脱盐常用透析法或凝胶过滤法。
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9
冷冻干燥
冷冻干燥(Lyophilization Freeze-drying)又 称升华干燥，是在低温、负压下进行干燥的方 法。主要用于除去冷冻样品中的水分或其它溶 剂，这是浓缩和干燥热敏性样品(如抗体)的有 效方法之一。将溶液样品通过冷冻干燥变成固 体样品不仅可以使样品稳定而有利于长期保存 ，也有利于样品的运输。
6
盐析法
随着盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不断 降低而沉淀析出，这称之为盐析(Salting Out)。
盐析作用是盐类使蛋白质脱去水化膜，同时 压缩蛋白质分子周围的双电层，致使蛋白质分 子相互聚集而沉淀。由于在合适的盐浓度下不 同蛋白质的溶解度不同，所以分离几种蛋白质 的混合溶液时，盐的饱和度由低向高逐渐增大 。
1. 深层滤器(Depth Filter)： 由纸、棉花或玻璃纤维制成。过滤时将颗粒保
基本原理 将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱
动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是 就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质 量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一 固定大小的离心场中沉降的速度也就不相同，由 此便可以得到相互间的分离。
5．蛋白质浓度 在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易发生沉淀， 但浓度过高时容易使其它杂蛋白共沉淀。因此．必须根 据具体情况选择蛋白质溶液的浓度。
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脱盐 用盐祈法分离纯化蛋白质后，常需要脱盐才
能获得纯品，脱盐常用透析法或凝胶过滤法。
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冷冻干燥
冷冻干燥(Lyophilization Freeze-drying)又 称升华干燥，是在低温、负压下进行干燥的方 法。主要用于除去冷冻样品中的水分或其它溶 剂，这是浓缩和干燥热敏性样品(如抗体)的有 效方法之一。将溶液样品通过冷冻干燥变成固 体样品不仅可以使样品稳定而有利于长期保存 ，也有利于样品的运输。
6
盐析法
随着盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不断 降低而沉淀析出，这称之为盐析(Salting Out)。
盐析作用是盐类使蛋白质脱去水化膜，同时 压缩蛋白质分子周围的双电层，致使蛋白质分 子相互聚集而沉淀。由于在合适的盐浓度下不 同蛋白质的溶解度不同，所以分离几种蛋白质 的混合溶液时，盐的饱和度由低向高逐渐增大 。
1. 深层滤器(Depth Filter)： 由纸、棉花或玻璃纤维制成。过滤时将颗粒保
2019年生物大分子的分离纯化及其应用.ppt
它们广泛存在于各种生物体内，与各种生命活动 息息相关。除了天然存在的外，还有生物工程培养 和发酵的。 生物大分子具有十分重要的生理功能和应用价值。 研究生物大分子的结构、功能及应用已成为生命科 学的一个关键问题。 不论从动植物和微生物体内提取或用生物工程 制 备的生物大分子产品，都是组成十分复杂的混合物， 在使用前都要分离和纯化。
7.1.2丙烯酰胺凝胶电泳的优点
①具有很高的分辨率。大小不同的分子在通过网状结构的凝 胶的空隙泳动时受到的阻力不同，大分子物质受到的阻力比 小分子的大。这样就使聚丙烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电 泳的双重功能，提高了分辨力。 ②凝胶空隙的大小可以人为地调节，以适应不同分子量的样 品。 ③聚丙烯酰胺凝胶电泳中电渗现象很小。 ④凝胶机械强度较好，弹性大，易保存。 ⑤丙烯酰胺可以提得很纯，不会污染 样品。
这种技术已经成功地应用于分离大多数的水 溶性蛋白质，还广泛用于大豆多肽的分离纯化。 由于大豆多肽在一定pH和离子强度条件下带电有 微弱的差异，和离子交换剂靠静电力结合在一起 时，进入介质表面的可交换离子与带相同电荷的
蛋白质分子就会发生交换的差异而分离。
离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换 剂两大类：
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样， 主要是利用它们之间理化性质的差异。
根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型： （1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、 盐析法、分配层析法、分级沉淀法等； （2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等； （3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等； （4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、 电泳、等电聚焦法等。 （5）根据配体特异性，如亲和层析。
变性的靶蛋白，使靶蛋白的产量达到最高值。
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纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
透析液: 水, 缓冲液, 高分子的浓溶液
Donnan效应: pH变化
(勤换透析液,使用大量的透析液)
Donnan效应:
微过滤
微过滤的类型:
深层滤器(Depth Filter) : 滤膜滤器(Screen Filter):纤维素醋酸酯(硝酸酯)
毛细管凝胶电泳
（Capillary Gel Electrophoresis, CGE)
毛细管等电聚焦
（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF)
CGE的应用
DNA序列分析 蛋白质分析 物理胶CZE
生物大分子的色谱分离纯化技术
排阻色谱 亲和色谱 离子交换色谱 反相及疏水作用色谱 液－液分配色谱
样品的采集 血样：
全血：肝素抗凝（0.02~0.2mg/ml) 血浆：2000g离心10min 血细胞： 血清：5~30 min自凝分离
尿样：酸式采集（HCl或硼酸，pH<2.5)，
碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌）
唾液： 组织样品：液氮等冷冻
酶样品的准备
酶活性的保持
控制纯化过程中的pH、温度及有机试剂 加入载体蛋白防止酶的吸附，如: BSA 加入辅助因子保护活性部位, 如: EDTA,巯基乙醇，谷胱甘肽 抑制蛋白酶的水解作用，如: 氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）
冷冻干燥
基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下
进行干燥的方法。
冷冻干燥的条件：温度，-10~-40℃；真空度， 13~40 Pa。
离心
基本原理 种类：
普通离心机（6000rpm)， 高速离心机(25000 rpm)， 超速离心机
转子：固定角度式，
悬挂吊桶式
离心(2)
离心力和相对离心力(Relative centrifugal force)：
离心(3)
离心技术的类型：
最大速度方法：
移动界面（Moving Boundary)超速离心法
移动区带(Moving Zone)超速 离心法
等密度方法(Isodensity)：
临床及生化分析样品的预处理
样品的类型、采集与保存 酶样品的准备
样品的类型、采集与保存
样品的类型：
样品的类型、采集与保存
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
1% SDS+ 0.1 M 巯基乙醇 分子量1.0×104~2.0×105
蛋白质的等电聚焦(Isoelectric Focusing, IEF) 原理 pH梯度的形成与保持
琼脂糖凝胶电泳
特点：
适合分子量大的分子；无毒；分辨率高；重复性好
胶浓度：0.5%~3%；分离1~9.0×107DNA片段 0.5~1.0% 胶分离0.5~30 kb DNA, 1.0~1.5% 胶分离小片段
琼脂糖凝胶电泳的应用
限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段的分析 DNA超螺旋结构的鉴定 DNA分子量的测定 脉冲场凝胶电泳
DNA分子量的测定
仪器
高效毛细管电泳
毛细管: I.D,25~100μm;O.D.,100~400μm; L, 0.1~1 m 进样系统: nL~pL, 流体力学方法和电动进样 高压直流电源：30kV, 1~300μA 检测
生物大分子的分离纯化技术
生物样品的特点: 生物活性 复杂性
内容: 生物样品的常规分离纯化方法 临床及生化分析样品的预处理 生物大分子的电泳分离纯化技术 生物大分子的色谱分离纯化技术生物样品的常规分离纯化方法
透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心
透析
基本原理
透析膜:
材料: 火棉胶(Collodion), 玻璃纸(Cellophane), 纤维素 (Cellulose)
(μe 为电泳迁移率,即电场强度为1 V/cm 时的迁移速率.)
影响电泳分离的因素:
物质本身的结构和性质: 荷电性质, 形状 支持介质: 吸附作用,电渗作用 溶液介质: pH, 离子强度 电场强度: 常压 500 V
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶的结 构和性质
凝胶的机械强度、弹性、 透明度和黏度等取决于凝 胶的总浓度:
酰-亮-亮-精三肽等
亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等
样品制备
从组织或器官制备样品 从组织或器官培养液中制备样品 从生物体液中制备样品 （5000 rpm,15 min) 从细胞培养液制备样品
电泳分离纯化技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 高效毛细管电泳
电泳分离纯化技术
基本原理
V=μe E
微过滤技术的应用:
溶液的澄清 微量沉淀物的收集 细菌细胞的收集
盐析
基本原理：
在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增 加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不 断降低而沉淀析出，即盐析。
盐析实验应注意的问题：
盐类的选择：硫酸铵 （767g/l, 25℃) 盐的饱和度： 温度：室温或4℃ pH：等电点 蛋白质的浓度：
聚丙烯酰胺凝胶电泳(2)
凝胶电泳的装置 柱型(Column Gel):
10cm×6cm
板型(Slab Gel):
12cm×12cm或14cm×16cm; 玻璃板间距1.75或1.5 cm.
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (盘状电泳) 电荷效应 浓缩效应 分子筛效应
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用
亲和层析的特点：
层析柱短 配基－与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合
F=mω2r; Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r
沉淀速度与沉降系数：
F摩擦=fv
F净=(Mp-Ms)ω2r-fv
沉降系数：沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒
的沉降速度）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于 1×10-13到200×10-13秒的范围. 以1×10-13s 为一个单位, 称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.
紫外-可见吸收法 荧光检测法 电化学检测法 质谱法
高效毛细管电泳
基本概念： 电泳淌度 电渗流
分析参数： 淌度和迁移时间 分离效率 分离度
高效毛细管电泳分离模式
毛细管区带电泳
（Capillary Zone Electrophoresis, CZE)
毛细管胶束电泳
（Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography, CEKC)
亲和色谱
固定相
葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺 －琼脂糖混合凝胶， （与凝胶色谱相似）
配基：
分离抗体用抗原，半抗原 分离酶用底物， 抑制剂，辅助因子等 通用型配基， 巯基丙基－琼脂糖
含巯基配体亲和色谱分离原理
亲和色谱
配基与载体的结合
琼脂糖的溴化氰活化法
6-氨基己酸－琼脂糖和,1,6-己二胺－琼脂糖
透析液: 水, 缓冲液, 高分子的浓溶液
Donnan效应: pH变化
(勤换透析液,使用大量的透析液)
Donnan效应:
微过滤
微过滤的类型:
深层滤器(Depth Filter) : 滤膜滤器(Screen Filter):纤维素醋酸酯(硝酸酯)
毛细管凝胶电泳
（Capillary Gel Electrophoresis, CGE)
毛细管等电聚焦
（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF)
CGE的应用
DNA序列分析 蛋白质分析 物理胶CZE
生物大分子的色谱分离纯化技术
排阻色谱 亲和色谱 离子交换色谱 反相及疏水作用色谱 液－液分配色谱
样品的采集 血样：
全血：肝素抗凝（0.02~0.2mg/ml) 血浆：2000g离心10min 血细胞： 血清：5~30 min自凝分离
尿样：酸式采集（HCl或硼酸，pH<2.5)，
碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌）
唾液： 组织样品：液氮等冷冻
酶样品的准备
酶活性的保持
控制纯化过程中的pH、温度及有机试剂 加入载体蛋白防止酶的吸附，如: BSA 加入辅助因子保护活性部位, 如: EDTA,巯基乙醇，谷胱甘肽 抑制蛋白酶的水解作用，如: 氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）
冷冻干燥
基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下
进行干燥的方法。
冷冻干燥的条件：温度，-10~-40℃；真空度， 13~40 Pa。
离心
基本原理 种类：
普通离心机（6000rpm)， 高速离心机(25000 rpm)， 超速离心机
转子：固定角度式，
悬挂吊桶式
离心(2)
离心力和相对离心力(Relative centrifugal force)：
离心(3)
离心技术的类型：
最大速度方法：
移动界面（Moving Boundary)超速离心法
移动区带(Moving Zone)超速 离心法
等密度方法(Isodensity)：
临床及生化分析样品的预处理
样品的类型、采集与保存 酶样品的准备
样品的类型、采集与保存
样品的类型：
样品的类型、采集与保存
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
1% SDS+ 0.1 M 巯基乙醇 分子量1.0×104~2.0×105
蛋白质的等电聚焦(Isoelectric Focusing, IEF) 原理 pH梯度的形成与保持
琼脂糖凝胶电泳
特点：
适合分子量大的分子；无毒；分辨率高；重复性好
胶浓度：0.5%~3%；分离1~9.0×107DNA片段 0.5~1.0% 胶分离0.5~30 kb DNA, 1.0~1.5% 胶分离小片段
琼脂糖凝胶电泳的应用
限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段的分析 DNA超螺旋结构的鉴定 DNA分子量的测定 脉冲场凝胶电泳
DNA分子量的测定
仪器
高效毛细管电泳
毛细管: I.D,25~100μm;O.D.,100~400μm; L, 0.1~1 m 进样系统: nL~pL, 流体力学方法和电动进样 高压直流电源：30kV, 1~300μA 检测
生物大分子的分离纯化技术
生物样品的特点: 生物活性 复杂性
内容: 生物样品的常规分离纯化方法 临床及生化分析样品的预处理 生物大分子的电泳分离纯化技术 生物大分子的色谱分离纯化技术生物样品的常规分离纯化方法
透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心
透析
基本原理
透析膜:
材料: 火棉胶(Collodion), 玻璃纸(Cellophane), 纤维素 (Cellulose)
(μe 为电泳迁移率,即电场强度为1 V/cm 时的迁移速率.)
影响电泳分离的因素:
物质本身的结构和性质: 荷电性质, 形状 支持介质: 吸附作用,电渗作用 溶液介质: pH, 离子强度 电场强度: 常压 500 V
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶的结 构和性质
凝胶的机械强度、弹性、 透明度和黏度等取决于凝 胶的总浓度:
酰-亮-亮-精三肽等
亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等
样品制备
从组织或器官制备样品 从组织或器官培养液中制备样品 从生物体液中制备样品 （5000 rpm,15 min) 从细胞培养液制备样品
电泳分离纯化技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 高效毛细管电泳
电泳分离纯化技术
基本原理
V=μe E
微过滤技术的应用:
溶液的澄清 微量沉淀物的收集 细菌细胞的收集
盐析
基本原理：
在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增 加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不 断降低而沉淀析出，即盐析。
盐析实验应注意的问题：
盐类的选择：硫酸铵 （767g/l, 25℃) 盐的饱和度： 温度：室温或4℃ pH：等电点 蛋白质的浓度：
聚丙烯酰胺凝胶电泳(2)
凝胶电泳的装置 柱型(Column Gel):
10cm×6cm
板型(Slab Gel):
12cm×12cm或14cm×16cm; 玻璃板间距1.75或1.5 cm.
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (盘状电泳) 电荷效应 浓缩效应 分子筛效应
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用
亲和层析的特点：
层析柱短 配基－与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合
F=mω2r; Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r
沉淀速度与沉降系数：
F摩擦=fv
F净=(Mp-Ms)ω2r-fv
沉降系数：沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒
的沉降速度）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于 1×10-13到200×10-13秒的范围. 以1×10-13s 为一个单位, 称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.
紫外-可见吸收法 荧光检测法 电化学检测法 质谱法
高效毛细管电泳
基本概念： 电泳淌度 电渗流
分析参数： 淌度和迁移时间 分离效率 分离度
高效毛细管电泳分离模式
毛细管区带电泳
（Capillary Zone Electrophoresis, CZE)
毛细管胶束电泳
（Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography, CEKC)
亲和色谱
固定相
葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺 －琼脂糖混合凝胶， （与凝胶色谱相似）
配基：
分离抗体用抗原，半抗原 分离酶用底物， 抑制剂，辅助因子等 通用型配基， 巯基丙基－琼脂糖
含巯基配体亲和色谱分离原理
亲和色谱
配基与载体的结合
琼脂糖的溴化氰活化法
6-氨基己酸－琼脂糖和,1,6-己二胺－琼脂糖