厌氧培养方法
厌氧菌的分离培养原则
厌氧菌的分离培养原则
厌氧菌的分离培养主要分初代培养和次代培养两个阶段，其中初代培养相对比较困难，关键的问题就是厌氧环境和培养基的选择。
初代培养的一般原则是：
（1）先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择。
（2）尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基。
（3）最好多选1～2种覆盖面不同的选择性培养基。
（4）尽量保证培养基新鲜。
（5）要考虑到微需氧菌存在的可能。
1.选用适当的培养基接种：应接种固体和液体两种培养基；
（1）培养基的使用，应注意下列各点：
1）尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完；
2）应使用预还原培养基，预还原24～48h更好；
3）可采用预还原灭菌法制作的培养基（用前于培养基中加入还原剂，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等，尽可能使预还原剂处于还原状态）；
4）液体培养基应煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种；
5）培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子（血清、维生素K、氯化血红素、聚山梨酯-80等）。
（2）培养基的选择：初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。
1）非选择培养基：本培养基使分离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出所有的厌氧菌。常使用心脑浸液琼脂（BHI）、布氏琼脂（BR）、胰豆胨肝粉琼脂（GAM）、胰胨酵母琼脂（EG）、CDC厌氧血琼脂等。
2）选择培养基：为有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。
2.每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10à2环境中培养，以便正确地培养出病原菌，从而判断其为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌或厌氧菌中的哪一类。
检验科厌氧培养的规范操作流程
检验科厌氧培养的规范操作流程
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厌氧菌的培养方法
2.1 Gas-pak法
精品课件
原理
气体发生袋：
柠檬酸和碳酸氢钠 ＋H2O
CO2
硼氢化钠11111 ＋H2O
H2
触媒 ： H2O 厌氧罐中的O2
钯粒
厌精品氧课件 指示剂
厌氧指示剂
亚甲基兰 指示剂 卢卡斯固体厌氧指示剂 布鲁氏指示剂
精品课件
亚甲基兰 指示剂
6％葡萄糖水溶液 0.1N氢氧化钠水溶液 0.05％亚甲基兰水溶液
厌氧菌的培养方法
祁红兵
精品课件
物理方法包括遮断空气法、煮沸法、真空法、空 气置换法、气体喷射法或转管法等
化学方法包括焦性没食子酸法、铁丝绒法、保险 粉法等
生物学方法包括与需氧菌共生好氧法、燕麦发芽 法等
混合法包括厌氧罐（袋）法、厌氧手套箱法或厌 氧室法、空气置换铁丝绒法、空气置换钯粒法等。
3 厌氧培养方法的选择
亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技 术、气体喷射培养法
厌氧手套箱培养法
用于要求严格的厌氧培养法的微生态学（正常菌群） 的研究工作
厌氧罐(袋)法结合其它厌氧培养方法
不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的检 验工作中，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。
精品课件
取5～6g钢丝绒/ L，于1～1.5升 酸性硫酸铜溶液浸泡30～60s，钢丝绒变成 红铜色，挤净液体置铝质或玻璃容器中， 放入厌氧罐内。随后将厌氧指示剂放入， 密封厌氧罐，1～4h后可达厌氧状态
生物制品无菌试验规程及厌氧菌的培养方法
厌氧菌的培养方法
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H 2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
厌氧菌的培养方法
不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的检验 工作中，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。
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4 厌氧菌的保存
4.1继代保存： 以GAM半固体流动培养基和TEP半固
体培养基作传代培养保存。用毛细吸管吸 菌进行继代培养，使用白金接种环移菌接 种，可以避免有的菌在操作中接触空气或 氧化物而死亡。数周作一次继代培养。新 分离的的菌种，在几个月内，每3～4星期 传代一次。被保存的菌种，放室温下暗处。 最好是不同菌用不同培养基保存。
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1 液体培养基的厌氧培养法
培养基煮沸：驱气后置流水中急速冷却 添加还原剂：
0.03～0.05％L-盐酸半胱氨酸 0.01～0.02％硫乙醇钠 0.5～1％葡萄糖 0.1％抗坏血酸 其它还原剂 添加琼脂
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2 固体培养基的厌氧培养法
厌氧罐法 简易厌氧罐和厌氧袋法 钢丝绒法 焦性没食子酸法 抽气换气厌氧培养法 生物好氧厌氧培养法 转管技术和气体喷射培养法 厌氧手套箱法 （又称厌氧室法）
厌氧菌的培养方法
祁红兵
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物理方法包括遮断空气法、煮沸法、真空法、空 气置换法、气体喷射法或转管法等
化学方法包括焦性没食子酸法、铁丝绒法、保险 粉法等
生物学方法包括与需氧菌共生好氧法、燕麦发芽 法等
混合法包括厌氧罐（袋）法、厌氧手套箱法或厌 氧室法、空气置换铁丝绒法、空气置换钯粒法等。
细菌培养方法
根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三种。
1、一般培养法：将已接种过的培养基,置37℃培养箱内18－24小时,需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3－7天直至一个月才能生长。
为使培养箱内保持一定湿度，可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固，以防培养基干裂。
2、二氧化碳培养法：某些细菌，如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等需要在含有10％二氧化碳的空气中才能生长，尤其是初代分离培养要求更为严格。将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即二氧化碳培养法。
3、厌氧培养法：常用的厌氧培养方法有厌氧罐法、气袋法及厌氧箱三种。
厌氧菌的培养方法
厌氧菌的培养方法
厌氧菌是一类不能在氧气存在下生长和繁殖的微生物。这些微生物在
许多领域都具有重要的应用价值，包括环境保护、生物能源生产等。因此，为了研究和应用这些厌氧菌，科学家们发展了多种厌氧菌的培养方法。本
文将详细介绍常用的三种厌氧菌的培养方法。
一、利用情境气氛培养厌氧菌
情境气氛培养是培养厌氧菌的一种常用方法，其原理是通过调节培养
基的气氛来控制氧气浓度。在培养厌氧菌时，一般会采用以下方法之一来
制备情境气氛。
1.预氧化法：将培养容器密封，置于28-37°C的恒温灭菌箱中。然
后通过注入一定比例的高纯度二氧化碳-氧气混合气体，使容器内的气氛
变为厌氧情境。这种方法适用于厌氧菌培养基中氧气浓度较低的情况。
2.双液低压法：将培养基分成两个相隔的容器，分别加入不同的培养液。然后将两个容器封口并贴膜，用胶带封好。经过一段时间后，在密封
的容器内会形成低压情境。这种方法适用于厌氧菌培养基中氧气浓度较高
的情况。
通过以上两种情境气氛培养方法，可以模拟出适合厌氧菌生长的条件。
二、利用厌氧培养器培养厌氧菌
厌氧培养器是一种专门用于培养厌氧菌的装置，其原理是通过封闭式
容器和气氛控制系统，实现在厌氧情境下的培养。常用的厌氧培养器有以
下两种类型：
1.商用厌氧培养器：通常有专门的培养室和压力控制系统，可以产生适合厌氧菌生长的气氛。在这种培养器中，可以根据菌株的特性进行相应的操作和调节。
2.自制厌氧培养器：由于商用的厌氧培养器设备较为昂贵，对于一些实验室来说并不实际。因此，一些实验室会开发自己的厌氧培养器。自制培养器的原理和商用培养器类似，只是在设计和制作上有所差异。
厌氧培养盒操作方法
厌氧培养盒操作方法
厌氧培养是一种微生物培养的方法，可以在无氧或低氧条件下培养厌氧生物。厌氧培养盒是用来创建无氧环境的装置。下面是厌氧培养盒的操作方法：
1. 准备培养基：选择适合目标微生物生长的培养基，并按照说明书的指导配制。
2. 准备厌氧培养盒：确保培养盒是干净且无菌的。关闭所有通风孔。
3. 装填培养基：将配制好的培养基注入培养盒中，通常注入量为容器体积的一半。
4. 添加无菌指示剂：将培养盒内的无菌指示剂加入培养基中，以便观察培养盒内是否已经形成无氧环境。指示剂的颜色会显示氧气的存在与否。
5. 拒氧剂处理：根据需要，可以向培养盒中加入一些拒氧剂，如抗氧化剂、还原剂等，以帮助维持无氧环境。
6. 密封培养盒：盖上培养盒的盖子，并用胶带或其他密封物将盖子与底部固定在一起，确保无氧环境不会受到外界氧气的污染。
7. 培养：将培养盒放入恒温培养箱或其他适当的培养设备中，并设置合适的温度和时间，以促进微生物的生长。
8. 观察和分析：根据需要，可以定期观察培养盒内的微生物生长情况，并进行相关分析和实验。
注意事项：
- 在进行厌氧培养之前，必须确保所有操作和材料都是无菌的，以避免外源性的氧气污染。
- 在打开培养盒之前，应先将其放置在氧气含量低的环境中，以避免无氧环境受到污染。
- 厌氧培养需要一定的技术和经验，以确保微生物在无氧环境下的正常生长。所以最好在专门的实验室或设施中进行这种培养。
厌氧菌
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
厌氧菌的采集、送检、培养、分离鉴定及注意事项
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个
环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育（较为推荐）。
3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保
持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
厌氧培养罐操作方法
厌氧培养罐操作方法
厌氧培养罐是一种用于在无氧条件下培养微生物的装置。以下是厌氧培养罐的操作方法：
1. 准备培养基：根据需要培养的微生物选择适当的培养基，并根据制造商提供的说明书正确配制和消毒培养基。
2. 细菌接种：将待培养的细菌用无菌的接种环或接种针接种到培养基中。
3. 检查厌氧条件：确保培养罐的密封性良好，无明显的漏气现象。可以通过涂抹一层明胶或石蜡油在罐口周围，以确保密封性。
4. 建立厌氧环境：将培养基和细菌接种物一起放入厌氧培养罐中。如果需要，可以在罐内添加一些可溶性还原剂（如硫酸亚铁）以创建还原环境。
5. 罐内气氛控制：通过使用气体生成器或用于厌氧条件的特殊气体气瓶（如氮气或二氧化碳）将气体注入培养罐中，以排除氧气。
6. 厌氧培养罐密封：将培养罐的盖子或塞子封好，确保罐内不再有外界气体进入。
7. 培养：将培养罐放入恒温培养箱中，根据细菌的生长条件设置适当的温度和
培养时间。
8. 检查培养结果：根据需要，可以在一定时间间隔内取样检查培养结果，例如通过显微镜观察细菌的生长情况或进行生化测试。
需要注意的是，在进行厌氧培养时，应注意保持无菌操作，并确保培养罐和所有用具的无菌。此外，厌氧培养罐中的厌氧条件应在操作过程中保持稳定，以确保微生物在无氧环境中正常生长。
厌氧细菌培养技术
厌氧细菌培养技术
一、厌氧菌的培养方式厌氧菌的培养过程中，最重要的就是为其提供厌氧生长环境，厌氧环境的提供可以从以下两方面着手。
一方面可以提供厌氧装置如厌氧手套箱，厌氧产气罐或者厌氧产气袋。另一方面可以提供含有还原剂的特殊培养基，如含少量琼脂，L-半胱氨酸，硫乙醇酸钠，巯基乙醇等的液体培养基。
要注意的是，如果没有厌氧手套箱，我们在对厌氧菌活化或者是转接操作的时候，动作要快，防止厌氧菌在空气中暴露的时间过长。
二、我们正常的大气环境中是有氧环境，这类厌氧菌通常生活在哪里呢我们研究这类菌有什么意义呢我们的大气环境确实是一个有氧环境。但是，地球上还存在很多厌氧环境比如深海和淤泥中，厌氧菌在我们人体中也普遍存在。
我们研究厌氧菌，一方面是因为厌氧菌是临床上一类重要的病原菌；另一方面，哺乳动物肠道菌群中99%是厌氧菌，其中许多是促进消化吸收的有益菌，不管是从致病机理，还是开展疾病治疗来说对厌氧菌的研究意义都很重大。
三、为什么好氧菌在生长繁殖过程中必须有氧气存在，而厌氧菌在生长过程中氧气却对对其产生毒害作用呢微生物虽然可以利用氧，通过有氧呼吸来产生更多的能量，满足机体的需要，但是氧对一切生物都会产生有毒害的代谢产物，比如会产生超氧阴离子，过氧化氢和羟自由基。超氧阴离子和羟自由基是强氧化剂，能氧化细胞内的大分子物质和有机化合物，对细胞造成损伤，过氧化氢也会损害一些细胞组分。
但是，微生物细胞可以通过产生过氧化氢酶，超氧化物歧化酶和超氧化物
还原酶等等这些酶类来清除细胞内的毒性氧。对于好氧菌来说，细胞内往往会产生超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，所以氧气对这类微生物不会产生毒害。
厌氧菌的采集、送检、培养、分离鉴定及注意事项
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个
环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育（较为推荐）。
3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保
持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
污水处理培养菌种方法
污水处理培养菌种方法
一、引言
污水处理是保护环境和人类健康的重要工作。在污水处理过程中，菌种的选择
和培养是关键步骤之一。本文将介绍污水处理中常用的菌种培养方法，以及相应的操作步骤和注意事项。
二、菌种选择
在污水处理过程中，常用的菌种有好氧菌、厌氧菌和硝化菌等。好氧菌主要用
于有机物的降解和氧化，厌氧菌用于无氧条件下的有机物降解，而硝化菌则用于氨氮的氧化。根据实际情况，选择合适的菌种进行培养。
三、菌种培养方法
1. 好氧菌培养方法：
a. 准备培养基：将适量的蛋白胨、葡萄糖和盐溶解于蒸馏水中，并加热煮沸，然后倒入培养瓶中。
b. 接种菌种：取一定量的菌液，均匀地接种在培养基上。
c. 培养条件：将培养瓶放入恒温培养箱中，温度保持在30-35摄氏度，培养
时间为24-48小时。
d. 菌液收获：培养时间结束后，将培养瓶取出，用离心机离心，将上清液采
集到离心管中，即可得到好氧菌液。
2. 厌氧菌培养方法：
a. 准备培养基：将适量的蛋白胨、葡萄糖和盐溶解于蒸馏水中，并加热煮沸，然后倒入培养瓶中。
b. 接种菌种：取一定量的菌液，均匀地接种在培养基上。
c. 培养条件：将培养瓶密封，放入恒温培养箱中，温度保持在35-40摄氏度，培养时间为24-72小时。
d. 菌液收获：培养时间结束后，将培养瓶取出，用离心机离心，将上清液采
集到离心管中，即可得到厌氧菌液。
3. 硝化菌培养方法：
a. 准备培养基：将适量的硝酸盐、磷酸盐和盐溶解于蒸馏水中，并加热煮沸，然后倒入培养瓶中。
b. 接种菌种：取一定量的菌液，均匀地接种在培养基上。
厌氧培养箱的使用方法及使用注意事项
厌氧培养箱的使用方法及使用注意事项
厌氧菌培养方法
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加
入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫
基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美
兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）即厌氧培养箱，是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个
手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是
利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或
厌氧微生物常用的培养方法
厌氧微生物常用的培养方法
厌氧菌的培养方法
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基Z酸钠培养基,牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多,可根据实际情况选用。
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厌氧性细菌的分离培养法
厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低
至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌
氧菌的生长。为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。
1．生物学方法
培养基中含有植物组织 (如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或
加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧
气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这
个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使
厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌 )，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
2．化学方法
利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。
此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如
下：
Na2S204 十Na2C03十O2 一→ Na2SO4十Na2SO3 十C02
取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则
直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每
1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使
混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。
（２）焦性没食子酸法
焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大重氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙(Purpurgallin) 。每 l00cm3 空间用焦性没食子酸1g 及 10％氢氧化纳或氢氧化钾l0ml ，其具体方法主要有下列几种：
1）单个培养皿法：
将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在
其上放焦性没食子酸 0.2g 及 10％ NaOH 溶液 0.5mL 。迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围
以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放人 37C 温箱培养 24~48h 后，取出观察。
2） Buchner 氏试管法：
取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g 及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管
放人大试管中，迅速加入 20％ NaOH 溶液 0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石
蜡， 37 培养 24~48h 后观察 (图１－６ )。
３）玻罐或干燥器法：
置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻
罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，
用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待一切准备好后．将线放下，使焦性没食子酸落人氢
氧化纳溶液中，立即将盖盖好；封紧，置温箱中培养。
４）瑞 (Wright) 氏法：
将已接种细菌的培养管的脱脂棉塞在火焰中烧灼灭菌后，塞人管中离培养基1~1．5cm 处，置适量焦性没食子酸于其上，加入 10％ NaOH 溶液 2ml ，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养(图１－７ )。
５）史 (Spray) 氏法：
用图１－８所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置氢氧化钠溶液，将
已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封完全，然后摇动底部，使氢氧化钠溶液
与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。
６）平皿法：
置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食
子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封固后，置温箱中培养（图１－９）。
７）硫乙醇酸钠法
硫乙醇酸钠 (HSCH2COONa) 是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原性物质，
促使厌氧菌生长。其他可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C、半胱氨酸等。
A．液体培养基法：
将细菌种人含0.1％的硫乙醇酸钠液体培养基中，37℃培养 24~48h 后观察，本培养基中加
美蓝液作为氧化还原的指示剂，在无氧条件下，美蓝被还原成无色。
Ｂ．固体培养基法：
常采用特殊构造的Brewer 培养皿，可使厌氧菌在培养基表面生长而形成孤立的菌落；操作过程是先将Brewer 氏皿干热灭菌，将溶化且冷却至50℃左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾人
皿内。待琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖，使皿盖内缘与
培养基外围部分相互紧密接触（图１－10)。此时皿盖与培养基中央部分留在空隙间的少量
氧气可被培养基中的硫乙醇酸钠还原，故美蓝应逐渐褪色，而外缘部分，因与大气相通，故
仍呈蓝色。将Brewer 氏培养皿置于37℃恒温箱内，经过24~48h 后观察。
3．物理学方法
利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌
氧状态，有利于厌氧菌的生长发育。
（１）厌氧罐法
常用的厌氧罐有Brewer 氏罐， Broen 种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，
中残存的氧与氢经铂或钯的催化而化合成水，箱培养。本法适用大量的厌氧菌培养。（２）真空干燥器法
氏罐和 Mclntosh-Fildes 二氏罐（图１－11）。将接先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放人孵育
将欲培养的平皿或试管放人真空干燥器中，开动抽气机，抽至高度真空后，替代以氢、氮
或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱培养。
（３）高层琼脂法
加热融化高层琼脂，冷至 45℃左右接种厌氧菌，迅速混合均匀。冷凝后 37℃培养，厌氧菌在
近管底处生长。
（４）加热密封法
将液体培养基放在阿诺氏蒸锅内加热l0min ，驱除溶解于液体中的空气，取出，迅速置
于冷水中冷却。接种厌氧菌后，在培养基液面覆盖一层约 0.5cm 的无菌凡士林石蜡，置 37℃培养。此外，尚有摇振培养法，此处从略。
（５）二氧化碳培养法