灰霉病菌抗药位点及其分子检测方法研究进展 2014

生物技术进展２０１４年㊀第４卷㊀第４期㊀２５１ ２５７ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５⁃２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期：２０１４⁃０６⁃２６；接受日期：２０１４⁃０７⁃０７㊀基金项目：公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３０２３）资助㊂㊀作者简介：张鑫，博士研究生，研究方向为植物真菌抗药性分子生物学㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｉｎ．６４１６８５３８８＠１６３．ｃｏｍ㊂∗通信作者：马雪梅，研究员，博士生导师，主要从事分子医学和分子诊断研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｍｍａ＠ｂｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ灰霉病菌抗药位点及其分子检测方法研究进展张㊀鑫，㊀马雪梅∗北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京１００１２４摘㊀要：灰霉病由灰葡萄孢侵染所致，化学防治是目前最常用的治理方法，而随着杀菌剂的广泛使用，抗药菌株频繁出现㊂本文就近年来已研究报道的灰葡萄孢菌的抗药分子位点进行了系统总结，包括六大类杀菌剂，涉及５个基因；对灰霉病菌抗药位点的分子检测方法进行了综述，包括测序法㊁ＣＡＰＳ㊁ＡＲＭＳ㊁ＴｅｔｒａｐｒｉｍｅｒＡＲＭＳ⁃ＰＣＲ㊁ＡＳｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ㊁ＡＳＰＰＡＡＰＣＲ和双杂交探针法，通过对不同检测方法进行比较分析，指出现有技术存在的问题并展望未来高通量的检测方法的发展方向㊂关键词：灰葡萄孢；抗药性；分子检测方法ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５⁃２３４１．２０１４．０４．０４ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆＭｕｔａｔｉｏｎＳｉｔｅｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＦｕｎｇｉｃｉｄｅＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａａｎｄｉｔｓＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓＺＨＡＮＧＸｉｎ，ＭＡＸｕｅ⁃ｍｅｉ∗ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１２４，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ：ＧｒｅｙｍｏｕｌｄｉｓｃａｕｓｅｄｂｙＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｉｓｕｓｕａｌｌｙｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｌｏｎｇｗｉｔｈｗｉｄｅｕｓａｇｅｏｆｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｏｃｃｕｒｅｄｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙａｍｏｎｇＢ．ｃｉｎｅｒｅａ．ＴｈｉｓｐａｐｅｒｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｆｕｎｇｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＢ．ｃｉｎｅｒｅａ，ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ６ｋｉｎｄｓｏｆｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓａｎｄ５ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒａｌｓｏｒｅｖｉｅｗｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｔｈｏｄｓｔｏｄｅｔｅｃｔｆｕｎｇｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｉｔｅｓ，ｓｕｃｈａｓｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍｅｔｈｏｄ，ＣＡＰＳ，ＡＲＭＳ，ＴｅｔｒａｐｒｉｍｅｒＡＲＭＳ⁃ＰＣＲ，ＡＳｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ，ＡＳＰＰＡＡＰＣＲａｎｄＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｔｃ．．Ｔｈｒｏｕｇｈａｎａｌｙｚｉｎｇａｎｄｃｏｍｐａｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｋｉｎｄｓｏｆｍｅｔｈｏｄｓ，ｐｒｏｂｌｅｍｓｉｎｕｓｉｎｇｔｈｅｓｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｗｅｒｅｐｏｉｎｔｅｄｏｕｔａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｔｐｕｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｐｒｏｓｐｅｃｔｅｄｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ；ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ㊀㊀灰霉病（ｇｒｅｙｍｏｕｌｄ）是一种重要的世界性植物真菌病害，由灰葡萄孢（ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａＰｅｒｓ．）侵染所致㊂Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ属半知菌亚门，有性态为富氏葡萄孢盘菌（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａｆｕｃｋｅｌｉａｎａ（ｄｅＢａｒｙ）Ｗｈｅｔｚ．），该病菌寄主范围广泛，危害多种蔬菜㊁经济作物㊁粮食作物以及观赏性植物㊂据统计，灰葡萄孢已被列为世界十大真菌病害之一［１］㊂目前对灰霉病主要以化学防治为主，包括苯并咪唑类（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ）㊁Ｎ⁃苯氨基甲酸酯类（ｐｈｅｌｌｙｌｃａｒ⁃ｂａｌｉａｔｅｓ）㊁二甲酰亚胺类（ｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅｓ）㊁甾醇生物合成抑制剂类（ｓｔｅｒｏｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＳＢＩｓ）㊁醌氧化抑制剂类（ｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉ⁃ｔｏｒｓ，ＱｏＩｓ）㊁琥珀酸脱氢酶抑制剂类（ｓｕｃｃｉｎａｔｅｄｅ⁃ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＳＤＨＩｓ）㊁苯氨基嘧啶类（ａｎｉｌｉｎｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ）和吡咯类（ｐｙｒｒｏｌｅｓ）等，但自从使用杀菌剂以来，关于灰葡萄孢对不同作用机制的杀菌剂产生抗药性的报道不断出现，且具有新作用机制的杀菌剂开发缓慢，使化学类杀菌剂的药效面临挑战，导致无法有效控制灰霉病的发生㊂因此，利用分子生物学方法及早发现并检测抗药菌株的出现，对于灰霉病的防治工作具有重要意义，本文就近年来已研究报道的灰霉病菌抗药位点进行了总结，并对其分子检测方法进行简要综述㊂１㊀抗药位点概述灰霉病菌（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）被杀菌剂抗性行动委员会（ＦｕｎｇｉｃｉｄｅＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＡｃｔｉｏｎＣｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＦＲＡＣ）认定为具有高风险的病原真菌［２］，其抗药菌株的出现频率也很高，近年来已报道的与灰葡萄孢杀菌剂抗性相关的主要突变位点如表１所示㊂表１㊀灰葡萄孢抗药位点Ｔａｂｌｅ１㊀ＲｅｓｉｓｔａｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｔｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｉｎＢ．ｃｉｎｅｒｅａ．杀菌剂种类突变基因突变位点氨基酸改变ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ和Ｎ⁃ｐｈｅｌｌｙｌｃａｒｂａｌｉａｔｅｓ［３ ５］β⁃微管蛋白（ＢｅｎＡ）Ｅ１９８ＡＧｌｕңＡｌａＥ１９８ＶＧｌｕңＶａｌＥ１９８ＫＧｌｕңＬｙｓＦ２００ＹＰｈｅңＴｙｒｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅｓ［３，６，７］组氨酸激酶（ＢｃＯＳ１）Ｉ３６５ＳＩｌｅңＳｅｒＩ３６５ＲＩｌｅңＡｒｇＩ３６５ＮＩｌｅңＡｓｎＱ３６９ＰＧｌｎңＰｒｏＶ３６８Ｆ＋Ｑ３６９ＨＶａｌңＰｈｅ＋ＧｌｎңＨｉｓＱ３６９Ｐ＋Ｎ３７３ＳＧｌｎңＰｒｏ＋ＡｓｎңＳｅｒＮ３７３ＳＡｓｎңＳｅｒＳＢＩｓ［８］３⁃酮基还原酶（ｅｒｇ２７）Ｆ４１２ＳＰｈｅңＳｅｒＦ４１２ＩＰｈｅңＩｌｅＦ４１２ＶＰｈｅңＶａｌＳＤＨＩｓ［９，１０］琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白（ｓｄｈＢ）Ｈ２７２ＹＨｉｓңＴｙｒＨ２７２ＲＨｉｓңＡｒｇＨ２７２ＬＨｉｓңＬｅｕＰ２２５ＴＰｒｏңＴｈｒＰ２２５ＦＰｒｏңＰｈｅＰ２２５ＬＰｒｏңＬｅｕＮ２３０ＩＡｓｎңＩｌｅＱｏＩｓ［１１，１２］细胞色素ｂ（ｃｙｔｂ）Ｇ１４３ＡＧｌｙңＡｌａ２㊀分子检测方法传统真菌杀菌剂抗药性检测方法（菌丝生长法和孢子萌发法）检测周期长，耗时耗力，检出率低，对于抗性频率小于１％的抗药菌很难检出，且对一些离体培养困难的病原菌检测很难㊂此时，分子检测方法就显示出了很大的优越性，其简单㊁迅速㊁准确㊁灵敏的优点越来越受到广大科研工作者的青睐，如下是目前灰霉病菌抗药位点的主要分子检测方法㊂２．１㊀测序法随着ＤＮＡ测序的自动化及成本的不断降低，测序法越来越多的被应用于杀菌剂抗药突变位点的研究［１３ １６］，是确定抗药位点及类型的金标准㊂该方法主要是通过对不同个体菌株的同一个基因或者基因片段进行ＰＣＲ扩增，测序后比对基因序列，从而找出变异的碱基㊂灰霉病菌对ＳＢＩｓ类杀菌剂环酰菌胺（ｆｅｎｈｅｘａｍｉｄ）㊁ＳＤＨＩｓ类杀菌剂啶酰菌胺（ｂｏｓｃａｌｉｄ）［１７］㊁二甲酰亚胺类杀菌剂异菌脲（ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ）［１８，１９］等的抗药分子机制的研究中均采用过测序法㊂测序法直观准确，可检测未知的突变位点并做到精确定位，国内外学者经常采用直接测序法或者结合其他方法检测基因变异㊂但该方法工作量大，耗时耗力，对于大批量抗药菌株的研究则不太适合㊂２５２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２．２㊀切割扩增多态性标记法（ＣＡＰＳ）切割扩增多态性（ｃｌｅａｖｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＣＡＰＳ）又称限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃ⁃ｔｉｏｎ⁃ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＰＣＲ⁃ＲＦＬＰ），是检测点突变的常用方法［２０，２１］㊂ＣＡＰＳ的检测原理是基于单碱基突变导致的抗药性菌株获得或丧失某些限制性酶切位点，与敏感菌株相比，用限制性内切酶酶切得到的目的片段大小不一，以此来区分敏感性和抗药性菌株㊂灰霉病菌线粒体细胞色素ｂ基因（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂ，ｃｙｔｂ）Ｇ１４３Ａ位点的突变是病原菌对ＱｏＩｓ类杀菌剂产生抗药性的根本原因［１７］㊂２０１２年，ＤｅＭｉｃｃｏｌｉｓ等［２］在对抗ＱｏＩｓ类杀菌剂肟菌酯（ｔｒｉ⁃ｆｌｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ）的分子机制的研究中，采用ＣＡＰＳ方法对细胞色素ｂ基因（ｃｙｔｂ）进行分子检测㊂由于ｃｙｔｂ第１４３位密码子ＧＧＴ到ＧＣＴ的改变导致核酸序列产生了一个ＡｌｕＩ（５ᶄ⁃ＡＧˌＣＴ⁃３ᶄ）的酶切位点，设计特异性引物扩增包含变异位点在内ｃｙｔｂ基因片段，然后选用限制性内切酶ＡｌｕＩ对ＰＣＲ产物进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳即可将３９株灰霉病菌野生型㊁６９株抗药突变体完全区分开㊂另外，在柑橘和草莓灰霉病菌对ＱｏＩｓ类杀菌剂醚菌酯（ｋｒｅｓｏｘｉｍ⁃ｍｅｔｈｙｌ）和嘧菌酯（ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ）的抗药性分子机制的研究中也采用了ＣＡＰＳ的方法［２２］㊂该方法的优点是操作简单，无需昂贵仪器，但只能做到定性检测，无法定量，且并不是所有突变位点处都有限制酶酶切位点的变化，因此该方法具有一定的局限性㊂如果酶切反应不完全会影响结果的判断，故经常与测序法同时使用㊂２．３㊀扩增阻滞突变系统（ＡＲＭＳ）扩增阻滞突变系统（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｍｕｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ＡＲＭＳ）别名很多，又称ＡＳ⁃ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）［２３，２４］㊁ＡＳＡ（ａｌｌｅｌｅ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）㊁ＰＡＳＡ（ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｅｌｅｓ）和ＭＡＭＡ（ｍｉｓｍａｔｃｈａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｕｔａｔｉｏｎａｓｓａｙ）㊂其基本原理为：ＴａｑＤＮＡ聚合酶由于缺少３ᶄң５ᶄ外切酶活性，引物３ᶄ末端碱基错配会导致ＰＣＲ产物急剧减少，以此针对野生型和突变型基因设计３条引物，其中２条引物的３ᶄ末端分别与正常碱基或者突变碱基匹配，第３条引物为另一侧通用引物，含正常碱基的引物对只能扩增获得野生型菌株的基因片段，而抗药菌株的基因片段无法获得，同理，含突变碱基的引物对只能对抗药菌株进行扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳技术即可区分突变型与野生型基因㊂灰霉病菌琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚基（ｓｕｃｃｉ⁃ｎａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｒｏｎ⁃ｓｕｌｆｕｒｐｒｏｔｅｉｎｓｕｂｕｎｉｔ，ＳｄｈＢ）Ｈ２７２Ｙ或Ｈ２７２Ｒ处突变是抗ＳＤＨＩｓ类杀菌剂的主要原因㊂２０１１年，Ｙｉｎ等［２５］在针对抗ＳＤＨＩｓ类杀菌剂啶酰菌胺（ｂｏｓｃａｌｉｄ）的苹果灰霉病菌ＳｄｈＢ基因的Ｈ２７２Ｙ和Ｈ２７２Ｒ突变位点进行检测时，设计了一条通用上游引物２７２Ｙ／Ｒ⁃Ｆ，两条等位基因特异性下游引物㊂针对Ｈ２７２Ｙ突变类型，第２７２位密码子由ＣＡＣ（ＢｏｓＳ）变为ＴＡＣ（ＢｏｓＲ），其中一条下游引物２７２Ｙ⁃Ｒ的３ᶄ末端碱基为Ａ，与突变碱基Ｔ互补；同理，针对Ｈ２７２Ｒ突变类型（ＣＡＣңＣＧＣ），另一条等位基因特异引物２７２Ｒ⁃Ｒ的３ᶄ末端碱基为Ｃ，与突变碱基Ｇ互补㊂采用２７２Ｙ／Ｒ⁃Ｆ＋２７２Ｙ⁃Ｒ，２７２Ｙ／Ｒ⁃Ｆ＋２７２Ｒ⁃Ｒ引物对分别检测６６株ｂｏｓｃａｌｉｄ抗性菌株（ＢｏｓＲ）和１０６株ｂｏｓｃａｌｉｄ敏感菌株（ＢｏｓＳ），其中６５株抗药菌扩增得到了２３２ｂｐ的目的片段，而１０６株敏感菌株和１株抗药菌株未获得相应条带，后经测序表明这１株抗药菌株属于另外一种突变类型（Ｐ２２５Ｆ）㊂由此可见，采用ＡＳ⁃ＰＣＲ的方法可准确检测包含Ｈ２７２Ｙ或者Ｈ２７２Ｒ突变位点的灰霉病菌抗药菌株㊂此外，作者在１个ＰＣＲ反应中加入了３条引物（２７２Ｙ／Ｒ⁃Ｆ，２７２Ｙ⁃Ｒ和２７２Ｒ⁃Ｒ），此多重ＡＳ⁃ＰＣＲ的方法可同时检测Ｈ２７２Ｙ型和Ｈ２７２Ｒ型突变㊂采用ＡＳ⁃ＰＣＲ的方法，Ｂａｒｄａｓ等［２４］以及Ｙｉｎ等［２６］在对抗ＱｏＩｓ类杀菌剂唑菌胺酯（ｐｙｒａ⁃ｃｌｏｓｔｒｏｂｉｎ）的奇异果灰霉病菌㊁苹果灰霉病菌ｃｙｔｂ基因进行分子检测时，成功检测出Ｇ１４３Ａ型突变㊂该方法的缺点是容易出现非特异性扩增导致假阳性或假阴性结果㊂２．４㊀四引物扩增阻滞突变系统（ＴｅｔｒａｐｒｉｍｅｒＡＲＭＳ⁃ＰＣＲ）四引物扩增阻滞突变系统是在ＡＲＭＳ⁃ＰＣＲ方法的基础上衍生而来㊂其特点是在突变碱基两侧设计两条外引物及两条等位基因特异性内引物，将４条引物同时加入一个反应体系中，ＰＣＲ结束后可得到不同长度的特异性扩增片段，经凝胶电泳分析片段有无及大小即可直接区分野生型３５２张鑫，等：灰霉病菌抗药位点及其分子检测方法研究进展及突变型［２７］㊂外引物兼具反应阳性对照及与两条内引物分别配对选择性扩增突变型与野生型的作用㊂２００９年，Ｍｕｎｏｚ等［２８］采用该方法对抗苯并咪唑类灰葡萄孢Ｅ１９８Ａ位点进行检测㊂ＴｅｔｒａｐｒｉｍｅｒＡＲＭＳ⁃ＰＣＲ对单核苷酸突变检测具有简便㊁快速㊁价格低廉等优点，但需要对引物浓度㊁内外引物比例㊁退火温度㊁Ｔａｑ酶浓度等各种ＰＣＲ反应条件进行优化，才能保证该方法的准确性和灵敏性，优化步骤费时费力㊂２．５㊀Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＡＳ⁃ＰＣＲＲｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ是在常规ＰＣＲ基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料，不用进行ＰＣＲ后处理或电泳检测，可通过荧光强度变化直接进行定性和定量分析㊂具有操作简便㊁快速㊁高效㊁高敏感性等特点㊂Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ已广泛应用于点突变检测［２９］㊂Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＡＳ⁃ＰＣＲ是在ＡＳ⁃ＰＣＲ的基础上在ＰＣＲ体系中加入ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料，利用荧光信号积累实时监测整个ＰＣＲ反应的进程㊂在对ＱｏＩｓ类杀菌剂肟菌酯的抗性分子机制的研究中，Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＡＳ⁃ＰＣＲ表现出很高的特异性，能够在少至０．１ｎｇ的ＤＮＡ中检测到Ｇ１４３Ａ突变，且检测结果和ＣＡＰＳ及测序法得到的结果一致［２］㊂但该方法的一个限制因素是可能会出现非特异性扩增，虽然这种限制因素不会影响多态性的检测，但会影响定量的准确性，尤其是对一些低丰度突变基因的检测㊂２．６㊀等位基因特异性探针及引物扩增甾醇是生物细胞膜的重要组分，ＳＢＩｓ类杀菌剂环酰菌胺抑制甾醇生物合成过程中的３⁃酮基还原酶的活性，从而影响细胞膜的功能，干扰细胞正常新陈代谢，影响菌体生长，甚至导致细胞死亡［３０］㊂２０１２年，Ｂｉｌｌａｒｄ等［３１］采用了一种精确㊁高效且可准确定量的等位基因特异性探针及引物扩增（ａｌｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｂｅａｎｄｐｒｉｍｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙ，ＡＳＰＰＡＡ）方法检测灰霉病菌３⁃酮基还原酶基因（３⁃ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ｅｒｇ２７）Ｆ４１２Ｓ㊁Ｆ４１２Ｖ和Ｆ４１２Ｉ三种类型的突变，并对突变型与野生型混合基因组中ｅｒｇ２７基因的不同ＤＮＡ多态性进行了成功检测，灵敏度达１％㊂ＡＳＰＰＡＡＰＣＲ的原理是：利用Ｔａｑ酶５ᶄң３ᶄ外切酶活性，将探针酶切降解，使５ᶄ报告基团（ＦＡＭ）和３ᶄ淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号㊂其特点是针对突变位点设计一条与ＤＮＡ一条链结合的等位基因特异性引物以及与另外一条ＤＮＡ链结合的等位基因特异性ＴａｑＭａｎ⁃ＭＧＢ探针，ＴａｑＭａｎ⁃ＭＧＢ探针的５ᶄ端连接Ｒｅｐｏｒｔ基团ＦＡＭ，３ᶄ端连接Ｑｕｅｎｃｈｅｒ基团ＭＧＢ⁃ＮＦＱ（ｍｉｎｏｒｇｒｏｏｖｅｂｉｎｄｅｒ⁃ｎｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕｅｎｃｈｅｒ）㊂为减少非特异性杂交，引物和探针之间最多只能有３个核苷酸的重叠（见图１）㊂为了区别ｅｒｇ２７四种类型的等位基因，研究人员共设计了４对引物和探针，每一对组合特异针对一种类型的基因㊂为了提高特异性，分别在特异性引物的３ᶄ末端的３或５个碱基处人为引入一个突变，并以干扰极限值（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｌｉｍｉｔ，ＩＬ）对此方法的非特异性扩增情况进行了分析，结果表明该方法的非特异扩增现象基本可以忽略不计㊂相对于常用的ＡＳｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ方法而言，ＡＳＰＰＡＡＰＣＲ由于包括引物和探针两种特异筛选，其非特异扩增的几率降低至少４倍，这种新的方法可用来鉴定混合ＤＮＡ中复杂的ＳＮＰ位点，且错误率小于１％㊂另一优点是ＭＧＢ的存在可图１㊀ＡＳＰＰＡＡＰＣＲ原理示意图［３１］Ｆｉｇ．１㊀ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅＡＳＰＰＡＡＰＣＲ［３１］．注：虚线表示等位基因特异性碱基的位置㊂４５２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ提高探针Ｔｍ值，使高Ｔｍ值的探针的长度缩短，便于设计，尤其对富含ＡＴ序列的探针设计有很大帮助，且ＴａｑＭａｎ⁃ＭＧＢ探针３ᶄ端的Ｑｕｅｎｃｈｅｒ基团为非荧光淬灭基团（ＮＦＱ），可大大降低荧光本底㊂此外，ＴａｑＭａｎ⁃ＭＧＢ探针可以增大配对与非配对模板间的Ｔｍ值差异，故ＴａｑＭａｎ⁃ＭＧＢ探针杂交的稳定性大大提高，实验结果更精确，分辨率更高㊂但此方法前期需要进行引物及探针的优化，耗费时间较长，成本较高㊂２．７㊀双杂交探针法（又称ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ技术）灰霉病菌抗苯并咪唑类杀菌剂的主要分子机制是由于１９８位或２００位氨基酸发生改变㊂２００８年，Ｂａｎｎｏ等［３］通过荧光杂交探针和熔解曲线分析，建立了一种快速检测抗药突变位点的Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ法㊂针对苯并咪唑类抗药菌的突变位点Ｅ１９８Ａ㊁Ｅ１９８Ｋ㊁Ｅ１９８Ｖ和Ｆ２００Ｙ设计了一对引物ＴＵＢ⁃ＨＰＦ１和ＴＵＢ⁃ＨＰＲ１，其２２４ｂｐ的扩增产物中包含１９８位及２００位密码子㊂另外设计两个探针，其中ｓｅｎｓｏｒｐｒｏｂｅ（ＴＵＢ⁃Ｕ２７１９８⁃Ｓｎ）可以和包含突变位点的区域杂交，其３ᶄ末端标记有供体荧光基团荧光黄（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ），另一个ａｎｃｈｏｒｐｒｏｂｅ（ＴＵＢ⁃Ｕ２７１９８⁃Ａｎ）的５ᶄ末端标记有受体荧光基团ＬＣ⁃Ｒｅｄ６４０，当两个探针和ＰＣＲ产物中的目的序列杂交时，两个基团相互靠近发生荧光共振能量传递，在ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ仪器上进行实时ＰＣＲ和熔解曲线分析，熔解峰对应的温度与ｓｅｎｓｏｒｐｒｏｂｅ和ＰＣＲ产物间的同源性相关，且不同位置的碱基突变或同一位置的不同碱基的变化都会影响杂交的稳定性㊂结果显示，携带有Ｅ１９８Ａ（ＧＡＧңＧＣＧ）㊁野生型㊁Ｅ１９８Ｋ（ＧＡＧңＡＡＧ）㊁Ｆ２００Ｙ（ＴＴＣңＴＡＣ）的ＢｅｎＡ基因的不同变化，导致ｓｅｎｓｏｒｐｒｏｂｅ分别在６８．７ħ㊁６２．０ħ㊁５９．４ħ和５７．２ħ产生可辨的熔解峰，由此即可判断突变类型㊂在ＢｅｎＡ基因的检测过程中，在６３．４ħ出现了一个未知的熔解峰，经测序分析，发现了一个新的突变类型Ｅ１９８Ｖ（ＧＡＧңＧＴＧ）；编码组氨酸激酶的ＢｃＯＳ１基因突变导致灰葡萄孢对二甲酰亚胺类杀菌剂产生抗药性［６，３２］㊂Ｂａｎｎｏ等［３］采用该方法对ＢｃＯＳ１基因的三种突变类型也进行了成功检测，包括Ｉ３６５Ｓ（ＡＴＣңＡＧＣ）㊁Ｖ３６８Ｆ（ＧＴＣңＴＴＣ）＋Ｑ３６９Ｈ（ＣＡＧңＣＡＣ）和Ｑ３６９Ｐ（ＣＡＧңＣＣＧ）㊂这些数据显示，基于Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ的杂交探针技术，只要探针设计合适，仅利用一对探针和一对引物即可对苯并咪唑类杀菌剂的多种突变位点进行检测，且同样适用于对二甲酰亚胺类杀菌剂抗药位点的研究㊂另外，在研究抗ＱｏＩｓ类杀菌剂灰葡萄孢菌株的Ｇ１４３Ａ位点中同样采用了该方法［３３］㊂相比ＰＣＲ⁃ＲＦＬＰ和ＡＳ⁃ＰＣＲ，双杂交探针法可在一个反应内对多种突变类型进行检测，无需后续任何操作，如限制酶酶切和凝胶电泳，且可检测未知的突变类型㊂但该方法需要昂贵的仪器及两个探针的合成，成本较高，且如果探针设计不合适，对检测结果的影响会非常明显，Ｂａｎｎｏ设计的ｓｅｎｓｏｒｐｒｏｂｅ与ＢｅｎＡＥ１９８Ａ基因完全匹配，产生了可辨的熔解峰，而采用与野生型序列完全匹配的ｓｅｎｓｏｒｐｒｏｂｅ则未得到可辨的熔解曲线［３］，由此可见，探针设计至关重要，直接影响结果的判读，由此也为试验设计带来较大困难㊂３㊀展望灰霉病菌针对六大类杀菌剂的抗药性分子机制已被报道，包括：苯并咪唑类㊁Ｎ⁃苯氨基甲酸酯类㊁二甲酰亚胺类㊁ＳＢＩｓ㊁ＳＤＨＩｓ和ＱｏＩｓ，本文总结了与抗药性相关的主要突变位点，共涉及５个基因㊂随着将来研究的深入，并不排除与抗药性有关的其他突变位点的存在㊂目前，有多种分子检测方法应用于灰霉病菌抗药位点检测的研究中，每个方法各有利弊㊂对于已知靶基因中的未知突变类型的检测只有测序法及双杂交探针法㊂除了Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＡＳＰＣＲ㊁ＡＳ⁃ＰＰＡＡ以及双杂交探针法外，其他方法只能做到定性研究㊂并且目前的方法只能对每个突变位点进行分别检测或者对同一靶基因不同变异碱基进行检测，不能同时分析对多个靶基因的不同变异位点㊂当前迫切需要一种快速㊁简便㊁高通量的检测方法，如果能找到一种同时检测多种类型杀菌剂抗药菌株方法，对于灰霉病菌抗药性的早期监测将具有重大意义㊂参㊀考㊀文㊀献［１］㊀ＤｅａｎＲ，ＶａｎＫａｎＪＡ，ＰｒｅｔｏｒｉｕｓＺＡ，ｅｔａｌ．．ＴｈｅＴｏｐ１０ｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｌａｎｔｐａｔｈｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ５５２张鑫，等：灰霉病菌抗药位点及其分子检测方法研究进展Ｐａｔｈｏｌ．，２０１２，１３（４）：４１４－４３０．［２］㊀ＤｅＭｉｃｃｏｌｉｓＡＲ，ＲｏｔｏｌｏＣ，ＭａｓｉｅｌｌｏＭ，ｅｔａｌ．．ＧｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄｆｉｅｌｄｍｕｔａｎｔｓｏｆＢｏｔｒｙｏｔｉｎｉａｆｕｃｋｅｌｉａｎａ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）ｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏＱｏＩｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇ．Ｓｃｉ．，２０１２，６８（９）：１２３１－１２４０．［３］㊀ＢａｎｎｏＳ，ＦｕｋｕｍｏｒｉＦ，ＩｃｈｉｉｓｈｉＡ，ｅｔａｌ．．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｎｄｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａｕｓｉｎｇｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｓｓａｙｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００８，９８（４）：３９７－４０４．［４］㊀ＦａｒｅｔｒａＦ，ＰｏｌｌａｓｔｒｏＳ．ＧｅｎｅｔｉｃｂａｓｉｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅａｎｄｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｉｎＢｏｔｒｙｏｔｉｎｉａｆｕｃｋｅｌｉａｎａ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．，１９９１，９５（８）：９４３－９５１．［５］㊀ＭａｌａｎｄｒａｋｉｓＡ，ＭａｒｋｏｇｌｏｕＡ，ＺｉｏｇａｓＢ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔＢ．ｃｉｎｅｒｅａｆｉｅｌｄｉｓｏｌａｔｅｓｗｉｔｈｒｅｄｕｃｅｄｏｒｅｎｈａｎｃｅｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｚｏｘａｍｉｄｅａｎｄｄｉｅｔｈｏｆｅｎｃａｒｂ［Ｊ］．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０１１，９９（１）：１１８－１２４．［６］㊀ＭａＺ，ＹａｎＬ，ＬｕｏＹ，ｅｔａｌ．．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｔｗｏ⁃ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｈｉｓｔｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００７，８８（３）：３００－３０６．［７］㊀ＣｕｉＷ，ＢｅｅｖｅｒＲＥ，ＰａｒｋｅｓＳＬ，ｅｔａｌ．．ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｎｏｓｍｏｓｅｎｓｉｎｇｈｉｓｔｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｎｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓｏｆＢｏｔｒｙｏｔｉｎｉａｆｕｃｋｅｌｉａｎａ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅｆｕｎｇｉｃｉｄｅｕｓａｇｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００４，９４（１０）：１１２９－１１３５．［８］㊀ＢｉｌｌａｒｄＡ，ＦｉｌｌｉｎｇｅｒＳ，ＬｅｒｏｕｘＰ，ｅｔａｌ．．ＳｔｒｏｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔｈｅｆｕｎｇｉｃｉｄｅｆｅｎｈｅｘａｍｉｄｅｎｔａｉｌｓａｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔｉｎＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ，ａｓｓｈｏｗｎｂｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｏｆｉｓｏｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇ．Ｓｃｉ．，２０１２，６８（５）：６８４－６９１．［９］㊀ＤｅＭｉｃｃｏｌｉｓＡｎｇｅｌｉｎｉＲ，ＨａｂｉｂＷ，ＲｏｔｏｌｏＣ，ｅｔａｌ．．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍｕｔａｎｔｓｏｆＢｏｔｒｙｏｔｉｎｉａｆｕｃｋｅｌｉａｎａ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）ｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｔｈｅｆｕｎｇｉｃｉｄｅｂｏｓｃａｌｉｄ［Ｊ］．Ｅｕｒ．Ｊ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．，２０１０，１２８（２）：１８５－１９９．［１０］㊀ＬａｌｅｖｅＡ，ＧａｍｅｔＳ，ＷａｌｋｅｒＡＳ，ｅｔａｌ．．Ｓｉｔｅ⁃ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅＰ２２５，Ｎ２３０ａｎｄＨ２７２ｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆｓｕｃｃｉｎａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓｕｂｕｎｉｔＢｆｒｏｍＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｏｌｅｓｉｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１３，ｄｏｉ：１０．１１１１／１４６２－２９２０，１２２８２．［１１］㊀ＶｅｌｏｕｋａｓＴ，ＫａｌｏｇｅｒｏｐｏｕｌｏｕＰ，ＭａｒｋｏｇｌｏｕＡＮ，ｅｔａｌ．．ＦｉｔｎｅｓｓａｎｄｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａｆｉｅｌｄｉｓｏｌａｔｅｓｗｉｔｈｄｕａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＳＤＨＩａｎｄＱｏＩｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ，ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｅｖｅｒａｌｓｄｈＢａｎｄｔｈｅｃｙｔｂＧ１４３Ａｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４，１０４（４）：３４７－３５６．［１２］㊀ＳａｍｕｅｌＳ，ＰａｐａｙｉａｎｎｉｓＬＣ，ＬｅｒｏｃｈＭ，ｅｔａｌ．．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｔｈｅＧ１４３Ａｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｃｙｔｂｉｎｔｒｏｎｐｒｅｓｅｎｃｅｉｎｔｈｅｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂｃ⁃１ｇｅｎｅｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇＱｏＩｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｓｅｖｅｒａｌｈｏｓｔｓ［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇ．Ｓｃｉ．，２０１１，６７（８）：１０２９－１０３６．［１３］㊀ＣａｒｔｅｒＨＥ，ＣｏｏｌｓＨＪ，ＷｅｓｔＪＳ，ｅｔａｌ．．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆＰｙｒｅｎｏｐｅｚｉｚａｂｒａｓｓｉｃａｅｉｓｏｌａｔｅｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｃａｒｂａｍａｔｅｓ［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇ．Ｓｃｉ．，２０１３，６９（９）：１０４０－１０４８．［１４］㊀ＢｌｕｍＭ，ＷａｌｄｎｅｒＭ，ＧｉｓｉＵ．ＡｓｉｎｇｌｅｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｎｏｖｅｌＰｖＣｅｓＡ３ｇｅｎｅｃｏｎｆｅｒｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔｈｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄａｍｉｄｅｆｕｎｇｉｃｉｄｅｍａｎｄｉｐｒｏｐａｍｉｄｉｎＰｌａｓｍｏｐａｒａｖｉｔｉｃｏｌａ［Ｊ］．ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，２０１０，４７（６）：４９９－５１０．［１５］㊀ＨｗａｎｇＴＪ，ＫｉｍＮ，ＫｉｍＨＢ，ｅｔａｌ．．ＣｈａｎｇｅｉｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓｔｒａｉｎｓａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＡ２１４３Ｇｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｏｆ２３ＳｒＲＮＡｏｎｔｈｅｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎｏｆＨ．ｐｙｌｏｒｉｉｎａｓｉｎｇｌｅｃｅｎｔｅｒｏｆＫｏｒｅａ［Ｊ］．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２０１０，４４（８）：５３６－５４３．［１６］㊀ＭａｌｌｉｋＩ，ＡｒａｂｉａｔＳ，ＰａｓｃｈｅＪＳ，ｅｔａｌ．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｓｕｃｃｉｎａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ⁃ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｉｎＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１４，１０４（１）：４０－４９．［１７］㊀ＬｅｒｏｕｘＰ，ＧｒｅｄｔＭ，ＬｅｒｏｃｈＭ，ｅｔａｌ．．ＥｘｐｌｏｒｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ，ｔｈｅｃａｕｓａｌａｇｅｎｔｏｆｇｒａｙｍｏｌｄ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１０，７６（１９）：６６１５－６６３０．［１８］㊀ＯｓｈｉｍａＭ，ＦｕｊｉｍｕｒａＭ，ＢａｎｎｏＳ，ｅｔａｌ．．ＡＰｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｔｗｏ⁃ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｈｉｓｔｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅＢｃＯＳ⁃１ｇｅｎｅｃｏｎｆｅｒｓｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｆｉｅｌｄｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００２，９２（１）：７５－８０．［１９］㊀ＦｉｌｌｉｎｇｅｒＳ，ＡｊｏｕｚＳ，ＮｉｃｏｔＰＣ，ｅｔａｌ．．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎ⁃ａｎｄｉｐｒｏｄｉｏｎｅ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｃｌａｓｓＩＩＩｈｉｓｔｉｄｉｎｅ⁃ｋｉｎａｓｅＢｏｓ１ｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ．，２０１２，７（８）：ｅ４２５２０．［２０］㊀ＫｌｅｓｉｅｗｉｃｚＫ，ＮｏｗａｋＰ，ＫａｒｃｚｅｗｓｋａＥ，ｅｔａｌ．．ＰＣＲ⁃ＲＦＬＰｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓＡ２１４３ＧａｎｄＡ２１４２Ｇｉｎ２３ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎｉｎＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．，２０１４，６１（２）：３１１－３１５．［２１］㊀ＶａｎｄｅｒＨｅｙｄｅｎＨ，ＤｕｔｉｌｌｅｕｌＰ，ＢｒｏｄｅｕｒＬ，ｅｔａｌ．．Ｓｐａｔｉａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅ⁃ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｓａｍｐｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４，１０４（６）：６０４－６１３．［２２］㊀ＩｓｈｉｉＨ，ＦｏｕｎｔａｉｎｅＪ，ＣｈｕｎｇＷＨ，ｅｔａｌ．．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆＱｏＩ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔｆｉｅｌｄｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａｆｒｏｍｃｉｔｒｕｓａｎｄｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇ．Ｓｃｉ．，２００９，６５（８）：９１６－９２２．［２３］㊀ＤｅＭｉｃｃｏｌｉｓＡＲ，ＭａｓｉｅｌｌｏＭ，ＲｏｔｏｌｏＣ，ｅｔａｌ．．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｓｕｃｃｉｎａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｉｎＢｏｔｒｙｏｔｉｎｉａｆｕｃｋｅｌｉａｎａ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇＳｃｉ．，２０１４，ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｓ．３７４８．［２４］㊀ＢａｒｄａｓＧＡ，ＶｅｌｏｕｋａｓＴ，ＫｏｕｔｉｔａＯ，ｅｔａｌ．．ＭｕｌｔｉｐｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａｆｒｏｍｋｉｗｉｆｒｕｉｔｔｏＳＤＨＩｓ，ＱｏＩｓａｎｄｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｏｆｏｔｈｅｒｃｈｅｍｉｃａｌｇｒｏｕｐｓ［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇ．Ｓｃｉ．，２０１０，６６（９）：９６７－９７３．［２５］㊀ＹｉｎＹＮ，ＫｉｍＹＫ，ＸｉａｏＣＬ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｏｓｃａｌｉｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｆｉｅｌｄｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａｆｒｏｍａｐｐｌｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１１，１０１（８）：９８６－９９５．［２６］㊀ＹｉｎＹＮ，ＫｉｍＹＫ，ＸｉａｏＣＬ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｙｒａｃｌｏｓｔｒｏｂｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂｇｅｎｅｉｎＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａｆｒｏｍａｐｐｌｅ［Ｊ］．６５２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１２，１０２（３）：３１５－３２２．［２７］㊀ＭｅｄｒａｎｏＲＦ，ｄｅＯｌｉｖｅｉｒａＣＡ．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅｔｅｔｒａ⁃ｐｒｉｍｅｒＡＲＭＳ⁃ＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１４，５６（７）：５９９－６０８．［２８］㊀ＭｕｎｏｚＣ，ＧｏｍｅｚＴＳ，ＶｏｌｐｅＭＬ．ＴｅｔｒａｐｒｉｍｅｒＡＲＭＳ⁃ＰＣＲｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳＮＰｉｎｂｅｔａ⁃ｔｕｂｕｌｉｎｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ，ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ［Ｊ］．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，７８（２）：２４５－２４６．［２９］㊀ＯｌｅａｓｔｒｏＭ，ＭｅｎａｒｄＡ，ＳａｎｔｏｓＡ，ｅｔａｌ．．Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎｉｎＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ［Ｊ］．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００３，４１（１）：３９７－４０２．［３０］㊀ＤｅｂｉｅｕＤ，ＢａｃｈＪ，ＭｏｎｔｅｓｉｎｏｓＥ，ｅｔａｌ．．Ｒｏｌｅｏｆｓｔｅｒｏｌ３⁃ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｉｎｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｏｔｈｅｆｕｎｇｉｃｉｄｅｆｅｎｈｅｘａｍｉｄｉｎＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａａｎｄｏｔｈｅｒｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇ．Ｓｃｉ．，２０１３，６９（５）：６４２－６５１．［３１］㊀ＢｉｌｌａｒｄＡ，ＬａｖａｌＶ，ＦｉｌｌｉｎｇｅｒＳ，ｅｔａｌ．．Ｔｈｅａｌｌｅｌｅ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｂｅａｎｄｐｒｉｍｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙ，ａｎｅｗｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｆｉｎｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅ⁃ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎｐｏｏｌｅｄＤＮＡ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１２，７８（４）：１０６３－１０６８．［３２］㊀ＬｅｒｏｕｘＰ，ＦｒｉｔｚＲ，ＤｅｂｉｅｕＤ，ｅｔａｌ．．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｉｎｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇ．Ｓｃｉ．，２００２，５８（９）：８７６－８８８．［３３］㊀ＢａｎｎｏＳ，ＹａｍａｓｈｉｔａＫ，ＦｕｋｕｍｏｒｉＦ，ｅｔａｌ．．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＱｏＩｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｔｙｐｅｓｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂｇｅｎｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．，２００９，５８（１）：１２０－１２９．７５２张鑫，等：灰霉病菌抗药位点及其分子检测方法研究进展灰霉病菌抗药位点及其分子检测方法研究进展作者：张鑫， 马雪梅， ZHANG Xin， MA Xue-mei作者单位：北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京,100124刊名：生物技术进展英文刊名：CURRENT BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2014(4)引用本文格式：张鑫.马雪梅.ZHANG Xin.MA Xue-mei灰霉病菌抗药位点及其分子检测方法研究进展[期刊论文]-生物技术进展2014(4)。