原位杂交原理及具体操作
原位杂交
原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。
但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
原位杂交的原理
原位杂交的原理
原位杂交是一种核酸杂交技术，通过将标记有荧光物质的探针与待测样品中的靶标序列进行杂交反应来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
原位杂交的原理基于两种核酸之间的互补配对原则。
DNA或RNA的互补链能够在一定条件下进行杂交，即互相结合形成
双链。
探针是一段由核酸组成的序列，它与待测样品中的目标序列具有互补的碱基序列。
在原位杂交实验中，首先需要制备探针。
探针可以是由DNA
或RNA构成的，其中至少一部分标记有荧光物质。
荧光物质
的标记使得通过显微镜或其他荧光成像设备能够检测到杂交的信号。
探针与待测样品中的目标序列发生互补配对后，形成探针与目标序列的杂交复合物，即探针与靶标序列互相结合。
为了确保探针与目标序列的特异性结合，一般会在杂交反应中使用一些特异性的条件，如控制杂交温度、盐浓度和pH值等。
此外，还可以使用一些核酸结合蛋白的抑制剂来降低非特异性结合。
通过显微镜观察荧光信号的出现位置和强度，可以确定目标序列在细胞或组织中的位置和数量。
常用的观察方式包括荧光显微镜、原位杂交图像分析系统等。
总的来说，原位杂交利用探针与目标序列的互补配对原理，通
过荧光信号的观察来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
这种方法在生物医学研究和分子诊断中具有广泛的应用价值。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。
了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。
同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。
非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。
cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
简述原位杂交的原理及应用
简述原位杂交的原理及应用1. 原位杂交的原理原位杂交是一种基因组杂交技术，它可以用来研究基因组的组成、结构和功能。
原位杂交的原理是通过将一组标记有探针的DNA片段与目标DNA样品进行杂交反应，然后使用适当的探针检测方法来识别和定位目标DNA序列。
原位杂交的基本原理包括以下几个步骤：1.DNA探针制备：3’-OH末端标记方法和末端标记方法是两种常用的DNA探针标记方法。
常用的标记有生物素、荧光物质等。
2.DNA杂交反应：将标记好的DNA探针与目标DNA样品进行杂交反应。
杂交反应的温度、时间以及混合物的浓度需要根据具体实验目的进行优化。
3.杂交后的探针检测：可以使用放射性同位素标记、荧光染料标记等方法对杂交后的DNA探针进行检测，以确定杂交反应是否成功。
4.观察和分析：通过显微镜等工具观察杂交结果，并对杂交位点进行定位和分析，获取目标DNA序列的位置和数量。
2. 原位杂交的应用2.1. 基因组结构研究原位杂交技术可以用来研究基因组的结构，包括基因的数量、排列、序列和重组等信息。
通过特定的探针标记和杂交反应，可以对基因组进行定位和分析，帮助了解基因组的组成和结构。
2.2. 染色体显带分析原位杂交被广泛应用于染色体显带分析领域。
通过核酸探针的杂交，可以识别和鉴定染色体上的特定DNA序列，从而确定染色体的结构和功能。
这对于检测染色体异常和疾病的相关基因有着重要意义。
2.3. 基因定位和图谱构建原位杂交可用于基因定位和构建基因图谱。
通过使用特定的探针标记和杂交方法，可以将目标基因定位到染色体上的特定区域，并确定其在染色体上的位置。
这为进一步研究基因的功能和相互作用提供了基础。
2.4. 个体识别和物种鉴定原位杂交技术可用于个体识别和物种鉴定。
通过探针的杂交反应，可以确定个体或物种特定基因的存在与否，从而进行个体识别和物种鉴定的工作。
2.5. 植物杂交育种原位杂交可以应用于植物杂交育种领域。
通过对目标植物基因组的杂交分析，可以鉴定合适的亲本植物并进行精确的杂交操作。
原位杂交的原理及应用
原位杂交的原理及应用
原位杂交是分子生物学领域中的一种技术，主要用于检测和定位特定DNA或RNA序列的存在和位置。
这种技术通常使用放射性或非放射性标记的探针来与特定的DNA或RNA序列进行杂交。
原理：原位杂交的基本原理是利用互补配对的原则，将标记探针与被检测的DNA 或RNA样本的靶分子进行杂交反应。
这种技术通常利用一些特定的标记，如放射性同位素或非放射性荧光染料，来标记探针，使其可以在杂交后被检测到。
应用：原位杂交广泛应用于分子生物学和医学领域。
以下是一些具体的应用：
1、检测基因突变。
原位杂交可以检测基因突变或缺失，从而确定某些病理状态的原因。
比如，原位杂交技术可以用于检测肿瘤细胞中激活的癌基因或缺失的肿瘤抑制基因，帮助医生诊断和治疗肿瘤。
2、检测病毒感染。
原位杂交技术可用于检测病毒感染。
例如，在临床诊断中，原位杂交技术可以用于检测人乳头瘤病毒（HPV）感染，从而帮助预防宫颈癌的发生。
3、研究分子发育和进化。
原位杂交也可用于研究分子进化和发育。
例如，在分子系统学领域，原位杂交技术可以用来确定不同物种之间的亲缘关系，并研究其进化历史。
4、研究基因表达模式。
原位杂交还可用于研究基因表达模式，了解基因在生物体中如何发挥作用。
例如，在神经科学领域，原位杂交技术可用于研究神经元中活性基因的表达模式。
总之，原位杂交技术是一种重要的检测和研究分子生物学的方法，具有广泛的应用前景。
原位杂交的原理和应用
原位杂交的原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用于检测和定位特定的DNA或RNA序列在细胞或组织中的存在和表达。
它通过将标记有特定标记物的探针与待检测的样品进行杂交反应，然后利用显微镜观察探针的位置和数量来确定目标序列的存在和表达水平。
原位杂交技术主要利用探针与目标序列间的互补配对来实现检测和定位，具有高灵敏度、高特异性和显微分辨率较高的优点，因此在生命科学研究和临床诊断中得到了广泛应用。
1.制备探针：探针是一段具有目标序列的DNA或RNA，通常通过聚合酶链式反应（PCR）或转录反应合成。
探针可以标记上荧光染料、放射性同位素或酶等标记物，用于在杂交反应后的检测。
2.样品制备：待检测的细胞或组织样品需要进行预处理，包括固定、脱水、解冻等步骤。
固定样品有利于保持细胞和组织的形态结构，使得探针能够与目标序列发生杂交。
3.杂交反应：将探针与样品进行杂交反应。
反应条件和时间需要根据探针的特性和样品的要求进行优化，包括温度、盐浓度等因素。
4.洗涤：在反应后，需要对样品进行洗涤来去除未杂交的或杂交不牢固的探针，以减少背景信号。
洗涤的条件需要严格控制，以保证背景信号的最小化。
5.检测和观察：使用适当的检测方法，如荧光显微镜、原子力显微镜等，来观察和记录探针的位置和数量。
原位杂交技术的应用广泛，主要包括以下几个方面：1.基因表达：原位杂交可以定位和观察特定基因的表达模式和水平。
通过检测RNA在组织或细胞中的存在和定位，可以研究基因的表达调控机制，揭示转录因子机制、信号通路等重要过程。
2.染色体定位：原位杂交可以在染色体水平上定位特定序列。
通过探针与染色体特定区域的杂交，可以确定染色体的结构和功能，并研究染色体异常与疾病的关系。
3.突变检测：原位杂交可以检测和定位基因突变或基因缺失。
通过使用特异性探针，可以检测DNA序列的缺失、插入或突变，从而提供有关遗传疾病的诊断和研究。
原位杂交的原理和应用
原位杂交的原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用于在细胞或组织中检测特定的核酸序列。
它的原理是通过标记的探针与待检测样品中的靶序列发生互补配对，然后通过适当的方法进行可视化。
原位杂交技术广泛应用于基因表达定位、染色体结构与功能研究、细胞分化和发育过程等领域。
1. 探针的选择：根据待检测的靶序列，可以设计相应的DNA或RNA 探针。
DNA探针一般选择长度为100-1000bp的片段，而RNA探针则通常为全长或部分序列。
探针可通过放射性标记或非放射性标记进行标记。
2.可视化标记：常用的标记技术有放射性标记（如32P或35S）和非放射性标记（如荧光染料、酶标记或生物素-亲和素标记）。
不同的标记方式适用于不同的应用领域。
3.杂交条件：为了使探针与靶序列完全匹配，必须优化杂交条件，包括温度、盐浓度、杂交液成分和时间等。
适当的杂交条件可以提高探针与靶序列的互补配对效率。
4.可视化和检测：杂交后，可以根据探针的标记方式选择不同的可视化方法。
放射性标记的探针可以通过暗室放射自显影或闪烁计数等方法进行检测，而非放射性标记的探针则需要使用适当的染色剂或显微镜观察。
1.基因表达定位：通过原位杂交技术，可以在组织或细胞水平上确定特定基因的表达位置。
这对于研究细胞分化、发育和疾病机理等方面具有重要意义。
例如，在肿瘤组织中，可以使用特定的探针定位癌基因的表达位置，从而帮助了解癌症的发生和发展过程。
2.核型分析：原位杂交可以用于染色体结构与功能的研究。
通过将特定探针与染色体的特定区域进行杂交，可以准确地确定染色体的位置和结构，进而了解染色体的功能和相关疾病。
3.细胞分化与发育研究：原位杂交可以用于研究细胞分化和发育过程中的基因表达变化。
通过将探针与分化或发育相关的基因进行杂交，可以确定这些基因在特定阶段的表达模式，从而揭示细胞分化和发育的机制。
4.检测病毒或微生物感染：原位杂交可以被用来检测病毒或其他微生物在细胞或组织中的感染。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作 Prepared on 24 November 2020原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。
了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。
同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。
非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。
cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交技术的具体步骤原位杂交技术是一种用于研究基因组结构和功能的重要方法。
它可以帮助我们了解基因在细胞中的定位和表达情况，进而揭示基因调控的机制。
本文将详细介绍原位杂交技术的具体步骤。
一、制备探针在进行原位杂交实验之前，首先需要制备合适的DNA或RNA探针。
探针是一段标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA序列，用于与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。
制备探针的方法有多种，常见的包括随机引物标记法、PCR标记法和转录标记法等。
二、取样和固定在进行原位杂交实验时，需要采集待检测样品，并将其固定在载玻片上。
固定的目的是保持样品的形态结构和细胞核的完整性，以便后续的杂交反应能够准确地进行。
常用的固定方法有冷冻固定、乙醛固定和细胞固定等。
三、脱水和处理在固定完样品后，需要对其进行脱水处理。
脱水的目的是去除样品中的水分，使探针能够更好地与靶标DNA或RNA结合。
脱水处理通常采用浓度递增的乙醇溶液进行，如70%、85%和95%乙醇溶液。
四、杂交反应杂交反应是原位杂交技术的核心步骤。
在杂交反应中，将制备好的探针与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。
杂交反应的条件包括温度、时间和缓冲液的选择等。
一般来说，杂交温度较高可以提高探针与靶标的互补配对效率，但也可能导致非特异性杂交的发生。
五、洗涤和检测在杂交反应完成后，需要对样品进行洗涤，以去除非特异性杂交的探针。
洗涤的条件通常是选择适当的盐溶液和洗涤时间，以确保只有与靶标DNA或RNA互补配对的探针能够保留在样品中。
洗涤完成后，可以使用适当的检测方法来检测样品中的探针信号，如荧光显微镜、放射自显影等。
六、结果分析根据样品中的探针信号，可以进行结果的分析和解读。
通过观察探针的分布和强度，可以确定靶标DNA或RNA在细胞中的定位和表达情况。
此外，还可以通过对多个样品的比较分析，揭示基因的差异表达和调控机制。
原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以帮助我们研究基因组的结构和功能。
原 位 杂 交 原理
60 ℃烘箱 60 ℃烘箱的准备： 3% HCl + 95%乙醇泡30min以上，擦干备用。 硅化载玻片： 2% APES于丙酮中 2min 丙酮 1min dH2O 1min 37℃ 烘干备用 ②切4μm厚，42℃展片。
杂
① 烘片： ② 脱蜡与水化：
（1）载玻片的处理：清洁无核酸酶污染（洗衣粉泡过夜，水冲，酸泡48小时，双蒸水冲2-3次，干燥，160℃烤2-4小时或15磅高压灭菌20分 钟），用新鲜配制的 1mg/ml 多聚赖氨酸（ Mr300000 以上）作为组织 细胞粘附剂。也可用明胶液。 （2）湿盒： （3）探针的标记：放射性标记与非放射性标记；探针长度50-300 bp， 小分子探针穿透力强，大分子探针可在组织细胞中形成网络而增加杂 交信号，同时也使本底增高。 （ 4 ）杂交条件：杂交的特异性依赖于探针的结构、杂交温度（高温严 谨）、pH及杂交液中甲酰胺（高浓度）和盐离子的浓度（低盐）；硫 酸葡聚糖提高探针相对浓度
5min×2 5min×2 5min×2 5min×2 5min 5min 30～45min 5min×2 5min 2 h～过夜
终止显色、复染与封片
BufferIV停止显色
室温
15min
dH2O
中性红或Bismark棕Y复染 dH2O洗 封片、观察及拍照
2～3min
1min 3次
参考文献
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原位杂交介绍与步骤
原位杂交介绍与步骤原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。
2. 固定目的是：（1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
原位杂交实验流程
原位杂交实验流程
原位杂交实验是一种将核酸探针与细胞或组织切片上的DNA或RNA进行杂交，从而对特定核酸进行定位和定量分析的方法。
以下是原位杂交实验的一般流程：
1. 样品制备：获得待检测的样品，可以是细胞、组织、细胞核或染色体等。
样品需要进行处理，包括固定、脱水和烘干等步骤，以便于后续的处理。
2. 探针制备：探针是一段具有特定序列的DNA或RNA，用于检测样品中的特定序列。
可以通过化学合成或PCR扩增等方法制备探针。
探针需要标记一定的标记物，如荧光素或辐射性核素等，以便于检测。
3. 杂交反应：将制备好的探针与处理好的样品进行杂交反应。
反应条件包括温度、盐浓度、pH值等，需要根据探针和样品的特性进行调整。
杂交后，探针会与样品中的特定DNA序列结合，并形成探针-目标DNA复合物。
4. 洗涤：杂交后，需要用洗涤液将未结合的探针洗去，以减少背景信号。
洗涤条件需要根据探针和样品的特性进行选择。
5. 检测：在洗涤后，通过特定的检测方法对探针-目标DNA复合物进行检测。
常用的检测方法包括荧光显微镜观察、放射自显影、免疫组织化学染色等。
6. 结果分析：根据检测结果，对杂交信号进行分析和解释。
通常需要比较杂交信号与已知标准品的信号，以确定样品中是否存在目标核酸序列。
7. 实验重复：为了确保结果的可靠性和准确性，通常需要进行重复实验，并对不同实验条件下的结果进行比较和分析。
总之，原位杂交实验需要精心设计和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
原位杂交原理
原位杂交原理原位杂交是一种重要的分子生物学技术，它可以用来检测细胞或组织中特定的DNA序列的存在和位置。
原位杂交的原理是利用DNA的亲和性，使标记了特定DNA序列的探针与待检测的DNA序列结合，然后通过染色或放射自显影等方法来检测探针的位置和数量，从而实现对目标DNA序列的定位和分析。
首先，进行原位杂交实验需要准备探针。
探针是一段标记了荧光物质或放射性同位素的DNA或RNA序列，它能与待检测的DNA序列特异性结合。
一般来说，探针的选择要根据待检测的DNA序列的特点来确定，可以是全基因组DNA、特定基因的DNA序列或者RNA序列。
其次，待检测的细胞或组织样本需要进行前处理，包括固定、脱水、变性等步骤，以使细胞或组织中的DNA得以裸露并保持在固定的位置。
然后，将标记了探针的DNA序列加入到前处理好的样本中，通过温度控制和亲和作用，使探针与待检测的DNA序列结合。
这一步是原位杂交实验的关键，探针的选择、标记的方式、杂交条件的优化都会影响实验的结果。
最后，通过染色、显微镜观察或放射自显影等方法来检测探针的位置和数量。
染色方法可以使用荧光染料或酶标记进行标记，通过显微镜观察标记物的位置和强度来判断待检测的DNA序列的存在和数量；而放射自显影则是利用放射性同位素标记的探针在放射底片上自显影的特性来检测探针的位置和数量。
总的来说，原位杂交原理是基于DNA的亲和性和特异性结合的原理，通过标记的探针与待检测的DNA序列结合，再通过染色或放射自显影等方法来检测探针的位置和数量，从而实现对目标DNA序列的定位和分析。
这一技术在细胞生物学、遗传学、病理学等领域有着广泛的应用，为科学研究和临床诊断提供了重要的技术支持。
原位杂交原理和应用
原位杂交原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种用于研究生物体（如细胞或组织）中特定核酸序列的定位和检测的技术。
它利用了DNA和RNA分子的互补性，使我们能够确定这些分子在细胞中的位置和表达情况。
原位杂交在遗传学、分子生物学和医学研究中有着广泛的应用。
原位杂交的原理可以简要概括为以下几个步骤：1. 表征目标序列：首先，需要确定要检测的目标DNA或RNA序列的特定片段。
这一步可以通过已知序列的引物（probe）引导进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，或通过分子克隆等技术获得目标序列的标记。
2.杂交：目标序列的标记探针与待检测的样本的DNA或RNA进行杂交。
标记探针通常通过标记物（如荧光染料或放射性同位素）标记，以便于检测。
3.条件选择：杂交后，需要通过选择性条件，将未杂交的探针从样本中去除。
这个步骤可以通过洗涤样本，以去除杂交失败的探针。
4.可视化：通过适当的检测方法，可以观察到成功杂交的探针。
这可以通过显微镜观察样本，或通过特定仪器检测标记物的信号来实现。
原位杂交技术有着广泛的应用，在遗传学、分子生物学和医学研究中发挥着重要的作用。
以下是一些原位杂交技术的应用：1.基因定位和映射：原位杂交可以帮助研究人员定位和映射特定的基因序列。
通过将标记探针与目标基因的DNA序列杂交，可以确定该基因在染色体上的具体位置。
2.基因表达分析：原位杂交可以用于研究基因在细胞或组织中的表达情况。
通过将标记探针与目标基因的RNA序列杂交，可以观察到基因在细胞中的表达水平和模式。
3.癌症诊断：原位杂交技术在癌症诊断中有着重要的应用。
通过检测癌细胞中特定基因的表达情况，可以确定肿瘤的类型和严重程度，并帮助制定相应的治疗方案。
4.病毒检测：原位杂交也可以用于病毒的检测和诊断。
通过检测感染细胞中病毒基因组的特定序列，可以确定病毒是否存在以及感染的程度。
5.基因组分析：原位杂交可以帮助研究人员对整个基因组进行分析。
原位杂交原理
种类：双链cDNA ,单链cDNA，合成寡合苷酸、 单链cRNA及 PCR产物。
长度：50---300个碱基（bp）。 探针制备 探针标识
地高辛精是一种仅存于洋地黄类植物旳花和叶子中旳类固醇半抗原 。 * 探针检测
用碱性磷酸酶标识旳抗地高辛抗体及免疫组织化学技术检测
注 意 事 项：
（1）载玻片旳处理：清洁无核酸酶污染（洗衣粉泡过夜，水冲，酸泡48小时，双蒸水冲2-3次，干燥，160℃烤2-4小时或15磅高压灭菌20分 钟），用新鲜配制旳1mg/ml多聚赖氨酸（Mr300000以上）作为组织 细胞粘附剂。也可用明胶液。
（2）湿盒： （3）探针旳标识：放射性标识与非放射性标识；探针长度50-300 bp，
37℃
0.5×SSC
37℃
0.1×SSC
37℃
1×BufferI
室温
BufferII 200μl/片
室温
Ap(用BufferII 稀释5000倍）100μl/片 37℃
BffeurI
室温
BufferIII
室温
NBT/BCIP(200μl溶于10ml BufferIII中)，
200μl/片，避光勿动 室温
60 ℃烘箱 60 ℃烘箱 60 ℃烘箱 60 ℃烘箱
切
片
① 载玻片和盖玻片旳准备：
3% HCl + 95%乙醇泡30min以上，擦干备用。
硅化载玻片：
2% APES于丙酮中
2min
丙酮
1min
dH2O 37℃ 烘干备用
1min
②切4μm厚，42℃展片。
杂
交I
① 烘片： ② 脱蜡与水化：
60℃ 二甲苯 1/2无水乙醇 + 1/2二甲苯 无水乙醇 95%乙醇 80%乙醇 70%乙醇 50%乙醇
原位杂交技术
原位杂交技术
原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。
RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。
该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。
其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA 分子。
RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。
尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。
原位杂交技术
荧光原位杂交：首先对寡核苷酸做特殊的 修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色 体或DNA 上特定的序列结合，通过与荧光 素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序 列在染色体的位置。
常用于已知基因或序列的染色体定位和未 克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。
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发展简史
1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的， 他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交， 确认该基因位于卵母细胞的核仁中。
对溶液和耐高温塑料器具作高温蒸汽消毒 化学方法：
焦磷酸二乙酯（DEPC） 作用机制：通过与组氨酸结合使蛋白质变性
（二）取材
组织要求新鲜，迅速投入到固定液中 标本置于低温环境下可抑制RNA酶作用
（三）固定
4％多聚甲醛培养2-6小时（培养细胞30分钟）
（四）包埋和切片
常规方法
（五）电镜杂交技术
超薄切片：
将镍网的切片面朝下浮于杂交液液滴上，置于湿 盒内杂交
（五）杂交后漂洗
用浓度递减的SSC溶液，在一定温度和震荡 下漂洗切片。（这一步骤可以调节严格度）
如果杂交信号太弱或没有，可以降低漂洗的严格度
如果背景太强、信号不特异，可提高漂洗严格度
原位杂交实验基本过程
探针标记→纯化→变性
↓
放免
当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞， 探针均采用同位素标记。
发展简史
1981，Bauman等首先应用荧光素标记cRNA探针 做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功——荧光杂交技术。
1982，Shroyer报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP） 标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后 用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后 经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针
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原位杂交原理及具体操作原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。
了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。
同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。
非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。
cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。
菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。
而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。
（一）探针的选择根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。
在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。
但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。
例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA 获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。
长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。
在这种情况下，寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。
在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。
如在建立DNA文库时，手头没有筛选特定基因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。
但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定6个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。
如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。
对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时，可采用PCR方法扩增某段基因序列，并克隆人合适的质粒载体中，即可得到自己的探针。
这种方法十分简便，无论基因组DNA探针还是cDNA探针都可以容易地获得，而且，可以建立PCR的基因检测方法，与探针杂交方法可作对比，可谓一举两得。
（二）探针的标记方法在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。
探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。
但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。
一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。
放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。
在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。
在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。
（三）探针的浓度总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。
另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。
依我们的经验，要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。
探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。
（四）杂交率在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。
（五）杂交最适温度杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。
若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。
若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。
如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。
通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。
温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。
最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃苛刻复性温度：Ts = Tm –（10或15℃）非苛刻复性温度：Tns =Tm –（30或35℃）（六）杂交的严格性影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。
一般认为在低于杂交体?（七）杂交反应时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。
时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。
一般杂交反应要进行20h左右。
1966年Britten和Kohne 推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。
Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间（t）的乘积。
实验表明Cot =100时，杂交反应基本完成。
Cot=0，基本上没有杂交。
例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml（按单股DNA每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21 =100.8, 杂交完成了。
对标记DN A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。
Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm 值。
由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
（八）杂交促进剂惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。
对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。
而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。
硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。
这是一种多聚胺，平均分子量为500 000。
另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。
在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。
因此，使用促进剂时有必要优化条件。
另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。
与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90 000）。
小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。
酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。
而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。
此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。
总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。
（七）杂交反应时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。
时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。
一般杂交反应要进行20h左右。
1966年Britten和Kohne 推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。
Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间（t）的乘积。
实验表明Cot =100时，杂交反应基本完成。
Cot=0，基本上没有杂交。
例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml（按单股DNA 每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21 =100.8, 杂交完成了。
对标记DN A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot 值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。
Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm 值。
由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
（八）杂交促进剂惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。
对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。
而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。
硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。
这是一种多聚胺，平均分子量为500 000。
另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。
在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG 则可产生很高的本底。
因此，使用促进剂时有必要优化条件。
另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。
与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90 000）。
小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。
酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。
而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。
此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。
总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。