酶制剂发酵生产

❖ (2)在诱导酶合成时加入诱导物以利诱导酶的 合成 食品工业应用的酶包括淀粉酶、蛋白 酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β- 半乳糖苷 酶等，它们均属于诱导酶，根据上述原理， 在合成时最好的诱导物为该酶的作用底物或 其结构类似物。
二、酶合成的反馈阻遏 Repression
❖ 反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产 生阻遏作用
第二章 酶的发酵生产
一、酶生物合成的基本理论
❖ 一、RNA的生物合成——转录 ❖ 二、蛋白质的生物合成——翻译 ❖ 三、酶生物合成的调节
1、RNA的生物合成——转录
❖转录是以DNA为模板，以核苷三磷 酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶） 的作用下，生成RNA的过程。
2、蛋白质的生物合成——翻译
翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为 底
（1）相近菌种产生的酶在性质上一般相近或 相似。
Exp.地衣芽胞杆菌与淀粉液化芽胞杆菌是近缘 菌，它们产生的蛋白酶性质很相近；
（2）胞外酶的稳定性和最适反应条件一般与 菌产酶的最适生长条件一致。
exp.嗜碱芽胞杆菌来源的蛋白酶作用的最适 pH比嗜中性地衣芽胞杆菌来源的蛋白么高出 几个单位。
从耐热凝结芽胞杆菌得到的α-淀粉酶比常温淀 粉液化芽孢杆菌来源者高出10℃。
常用诱变剂
第三节 发酵条件及控制
工艺流程
培养
灭
基制备 菌
冷接 却种
发酵
控制 t、 pH、
DO
保
活
藏
化
菌
菌
种
种
液体 菌种 扩大 培养
通气、 搅拌
• 提高酶产量的方法
1、通过条件控制提高酶产量： 添加诱导物、降低阻遏物浓度 优化发酵条件 2、通过基因突变提高酶产量： 使诱导型变为组成型、使阻遏型变为去阻遏型 3、其它提高酶产量的方法： 添加表面活性剂、添加产酶促进剂
R
启 动 操纵 子 基因
PO
LacZ
乳糖结构基因 LacY Laca
乳糖
阻遏蛋白 （有活性）
阻遏蛋白 （无活性）
mRNAZ mRNAY mRNAa 基 因
表 达
乳糖操纵子假说对指导酶生产的意义
(1)现代诱变育种技术 调节基因发生突变 不能产生阻遏蛋白 诱导酶变成组成酶
RNA聚合酶便能起作用，操纵子便能持久地 “开”，并连续产生β-半乳糖苷酶
调节基因
操纵基因
结构基因
mRNA
阻遏蛋白
酶代谢产物一旦大量积累
酶蛋白
阻遏蛋白不能与操纵基因结合，所以结构基因表达。 阻遏蛋白被产物激活，结构基因不表达。
❖ 这一理论在实践意义：
(1)设法从培养基中除去其终产物，以消除反馈 阻遏。
三、酶合成的分解代谢阻遏作用
❖ 又称葡萄糖效应
是指微生物在其培养基中由于葡萄糖的存在 虽然能迅速生长，但明显地抑制某些分解代 谢诱导酶的形成。
将E.coli培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基上，
出现“二峰生长现象”
即使有乳糖存在，也要等葡萄糖耗尽之后诱 导形成-半乳糖苷酶
葡萄糖分解产物对-半乳糖苷酶形成阻遏
葡萄糖过量存在——放出的能量部分储存在ATP中
ADP+AMP ——ATP
磷酸二酯酶
cAMP +H2O
AMP
cAMP-CRP复合物的浓度降低 启动基因(P)上没有cAMP-CRP复合物结合 RNA聚合酶无法结合到启动基因 酶的生物合成无法进行。
❖ 如果微生物需要某些代谢阻遏物作为碳源， 在工业生产中则可采用限量流加碳源的办法， 便可减少或避免这种阻遏作用。
第二节 产酶微生物及其选育
动物 酶 植物
微生物
微生物易于大量培养，倍增时间短； DNA技术使微生物生产特殊作用的酶， 并大大提高产量； 因此，微生物可以说是酶商业化生产的最佳来源。
1、产酶菌的分布规律
物，在核糖体上通过各种tRNA，酶 和
辅助因子的作用，合成多肽的过程。
第一节 酶生物合成调控机制
一、诱导酶合成调节（Induction）
❖ 操纵子学说概述：
1、操纵子（operon）： 基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结 构基因，调节基因，操作子和启动子。
Structure of a typical operon
（3）为获得能够降解某种物质的产酶菌株， 一般可以从该物质比较丰富的地方寻找。
Exp. 豆科植物的根系中，往往存在根瘤菌；
油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微 生物；
处理降解合成物质的产酶菌则往往能在污水 处理处获得；
3、菌种生产性能鉴定
❖ 生产性能鉴定主要通过初筛和复筛确定。 ❖ 初筛是从已分离出来的菌种中挑出能产生目
④调节基因（regulator gene）：
用于编码组成型调节蛋白的基因，一般远离 操纵子,但在原核生物中,可以位于操纵子旁边, 编码调节蛋白。
乳糖操纵子调控
A、无乳糖存在
调节 基因
R
阻遏蛋白 （有活性）
启 动 操纵 子 基因
PO
乳糖结构基因
LacZ
LacY Laca
基因关闭
B、有乳糖存在
调节 基因
①结构基因(structural genes)：
决定某一多肽的DNA模板，可根据其上的碱 基顺序转录出相应的mRNA，然后再可通过 核糖体转译出相应的酶
②启动子(promoter)： 能被RNA聚合酶所识别的碱基顺序，是RNA聚 合 酶的结合部位和转录起点。
③操纵子（operator）： 位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序， 是阻遏蛋白的结合位点，能通过与阻遏物相结 合来决定结构基因的转录是否能进行
自然突变一般有两种原因
诱变育种
❖ 定义：
诱变育种是人为的利用物理化学等因素，使 诱变的细胞内遗传物质染色体或DNA的片段 发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或 DNA的某一碱基对发生改变 (又称点突变)， 从而使微生物的遗传物质DNA和RNA的化学 结构发生变化，引起微生物的遗传变异。
诱发突变的变异幅度远大于自然突变 。
标酶的菌株，要求检出方法快捷、简便 ❖ 初筛多选用平板培养透明圈法
❖ 特定酶产生菌的筛选方法主要是依靠 酶催化的反应性质、作用底物的特异 性、底物和产物的特性以及酶在细胞 中所处的位置进行设计。
❖ 细胞外的水解酶
1、溶解度——不溶性底物如淀粉、纤维素、酪素、 细胞壁等培养基中生长——透明圈大小
2、酸碱度——酸碱指示剂——变色圈大小和颜色
3、颜色——合成特定底物与酶反应变色——变色 深浅
❖ 复筛是在初筛的基础上筛选产酶量高，性能 更符合要求的菌株，要求测定方法准确可靠。
❖ 复筛多采用摇瓶培养的方法。将初筛出来的 菌种移入三角瓶振荡培养，对产物进行分析 检定，找出产酶量最高，性能符合要求的菌 株。
自然选育
❖ 定义： 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育。
分解代谢阻遏实例
源自文库
酶 α-淀粉酶
微生物
引起阻遏作用物质
嗜热脂肪芽孢杆菌 果糖
纤维素酶
绿色木霉
葡萄糖、甘油、纤维二糖
蛋白酶
巨大芽孢杆菌
淀粉葡萄糖苷酶 二孢内孢酶
葡萄糖 麦芽糖、葡萄糖、甘油
❖ 用甘油代替果糖培养嗜热脂肪芽孢杆菌，α淀粉酶产量可提高25倍。
❖ 采用甘露糖作为荧光假单胞杆菌培养基时， 纤维素酶的产量比用半乳糖作为培养基时要 高1500倍以上。