GmCHS8和GmIFS2基因共同决定大豆中异黄酮的积累_易金鑫
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1
Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210094, China; 2 Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,
4
China; 3 Department of Plant Breeding and Genetics, University of Agriculture, Faisalabad 38040, Pakistan; Lianyungang 222006, China; Agriculture and Agri-Food Canada, London, ON N5V-4T3, Canada
[20] [14-20] [6-10]
为 CHS7 和 CHS8 在 CDS 区域内相似性达 96%, 而 5UTR 区域内相差明显 , 为特异区别两者 , CHS7 和 CHS8 的 5端引物设计位于 5UTR 内 , 而引物 3位于 Exon 内, 且两者完全相同。引物序列分别是 CHS7/5UTRf1: 5-gccCTGTGTGTTAACCAATTAAA3和 CHS8/5UTRf2: 5-GGTCAGAAGTCAACCACA TGTT-3, 而 3-端共用引物为 CHS78/EXNr: 5-GAC TTGTCACACATGCGCTGGAA-3。 用于 CHS8 取授 粉后 不同 时 期 9 种器官 [ 2 0 ] , 提取 总 RNA, 按 照 Invitrogen 反转录试剂盒说明获得单链 cDNA 进行 RT-PCR, 以揭示两者表达的组织特异性。
GmCHS8 和 GmIFS2 基因共同决定大豆中异黄酮的积累
易金鑫 1 朱虹润 1,2
1
徐照龙 1,2 马鸿翔 1
王峻峰 4 张大勇 1 何晓兰 1 SANGEETA Dhaubhadel5
ZULFIQAR Ali1,3
江苏省农业科学院农业生物技术研究所 , 江苏南京 210014; 2 南京农业大学农学院 , 江苏南京 210095; 3 Department of Plant Breeding and Genetics, University of Agriculture, Faisalabad 38040, Pakistan; 4 江苏省连云港职业技术学院 , 江苏连云港 222006; 5 Agriculturቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ and Agri-Food Canada, London, ON N5V-4T3, Canada
5
Liangyungang Technical College,
Abstract: Soybean isoflavonoids (isoFLVs) are natural secondary componds produced in Phenylpropanol metabolism Pathway. In past ten years, the isoFLVs were proved with anti-cancer activity to human health and therefore intensively included in nowadays food industry. However, the low content in natural soybean germplasm is a major limit to be weed in desired population. Herein we report that expression patterns of 18 362 genes were monitored by using Microarray between 30 to 70 days after pollination (DAP) during the soybean seed development. The expression profile of CHS8 and IFS2 revealed by both Microarray and RT-PCR indicated these two genes may play critical roles in determination of the accumulation of isoFLV in soybean seeds. According to Agrobacterium rhizogenes transformation system, over-expression of individuals of CHS8 and IFS2 resulted in 65.9% and 34.4% isoFLV increase respectively, but not significant in Duncan’s multiple test at the 0.05 probability level. However, co-expression of CHS8+ IFS2 significantly increased (P<0.0001) the isoFLV content up to 82.3% when comparing to non-transgenic control. Conclusively, both IFS2 and CHS8 gene co-determine the accumulation of isoFLV in soybean. Keywords: CHS8; IFS2; Over-expression; Co-determination; Soybean isoflavonoid content
, 因此 , 显著提高异黄酮含
量 , 已经成为进一步扩大应用大豆异黄酮亟待解决
。
利用 Microarray 技术分析发现 , CHS8
基因是激活整个类苯基丙醇通路的关键基因 , 因而 也是异黄酮累积的关键基因 ; 过量表达 CHS8 基因 , 异黄酮支路代谢水平因主通路被激活而略有提高 , 异黄酮含量随之略有增加 , 但增幅不显著。这暗示 了在主通路以外 , 异黄酮支路中可能还存在关键基 因, 两者共同作用下可能显著提高异黄酮含量。 本研究试图利用 Microarray 技术 , 检测大豆整 个生育过程中类苯基丙醇主通路及异黄酮支路中所 有已知基因的表达水平及变化趋势 , 以期发现异黄 酮支路中的关键基因 , 并验证其在异黄酮积累过程 中的作用。
作物学报
ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 571578 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
http://www.chinacrops.org/zwxb/ E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00571
GmCHS8 and GmIFS2 Gene Co-Determine Accumulation of Isoflavonoid in Soybean
YI Jin-Xin1, XU Zhao-Long1,2, WANG Jun-Feng4, ZHANG Da-Yong1, HE Xiao-Lan1, ZULFIQAR Ali 1,3, ZHU Hong-Run1,2, MA Hong-Xiang1, and SANGEETA Dhaubhadel 5
摘
要 : 大豆异黄酮受多基因控制 , 采用传统育种方法提高大豆异黄酮含量比较困难。我们之前的研究表明 , CHS8
基因在异黄酮生物合成过程中发挥着重要作用 , 但 CHS8 基因过量表达并不能显著提高异黄酮含量。本研究利用 Microarray 技术 , 检测了高异黄酮品种 RCAT Angra (RCAT)和低异黄酮品种 Harovinton (HVNT)的 18 362 基因在种子 发育过程中表达水平的变化以及大豆种子中异黄酮累积的趋势 , 利用 RT-PCR 证实 CHS8 和 IFS2 分别是 CHSs 和 IFSs 基因家族中的主要基因 ; 证实 CHS8 是类苯基丙醇主路径中的主基因 , 并发现异黄酮支路中的 IFS2 基因在 RCAT 和 HVNT 品种中表达差异亦达到显著水平。进一步利用发根农杆菌转化系统 , 在大豆上分别过量表达 CHS8、 IFS2 和 CHS8+IFS2, 前两者异黄酮含量较对照分别提高 65.9%和 34.4%, 但增幅未达显著水平 ; 而后者则提高了 82.3%, 增 幅达极显著水平 (P<0.0001), 因而证实大豆中异黄酮的积累由 CHS8 和 IFS2 基因共同决定。 关键词 : CHS8; IFS2; 过量表达 ; 共同决定 ; 大豆异黄酮
大豆异黄酮是豆科植物的天然次生代谢产物 , 是大豆苷元 (daidzein)、染料木素 (genistein)和大豆黄 素 (glycitein)三大类化合物的总称 [1-2]。 异黄酮类产物
不但在植物体内参与防卫反应 [3] 及根瘤形成 [4] 等重 要生理过程 , 同时也是人类理想的天然抗癌防癌物 质 [5-7] 。目前 , 大豆及其制品已成为西方发达国家食
572
作 物 学 报
第 37 卷
品工业中的热点、重点 [8-9]。但是 , 大豆自然种质资 源中异黄酮含量较低 的问题。 大豆异黄酮含量受多基因控制 , 累加效应不显 著 , 因而使用传统方法提高大豆异黄酮含量难度较 大 , 国内最近育成的品种异黄酮含量大约在 0.4%左 右 [11-13] 。国外主要采用基因工程的策略来提高异黄 酮的含量。大豆异黄酮是由类苯基丙醇通路的分支合 成, 目前的研究表明, 过量表达 PAL、 C4H、 4CL、 CHS 和 CHI 等基因 , 并不能显著增加异黄酮含量 Sangeeta 等
本研究由国家自然科学基金项目 (30971798)，江苏省自然科学基金项目 (BK2010474)和江苏省农业科技自主创新基金项目 [CX(10)433]资助。 第一作者联系方式 : E-mail: yij@jaas.ac.cn, Tel: 025-84391105 Received(收稿日期 ): 2010-08-30; Accepted(接受日期): 2011-01-06.
Microarray 及其数据分析 大豆授粉后 30~70 d, 每 10 d 取未成熟种子提取 总 RNA, 参照 Sangeeta 等 [20]方法进行 Microarray。 采 用 Cluster 软 件 (http://rana.lbl.gov/EisenSoftware. htm) 分析数据和聚类分析基因变化趋势 , 并用 Java Treeview 软 件 (http://jtreeview.sourceforge.net/) 可 视 化作图。 载体构建及遗传转化 按照 Invitrogen 公司 Gateway BP Clonase II Enzyme Mix 和 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix 试剂盒说明 , 将候选基因 PCR 产物克隆到中间载体 pDONR221, 进而置换入植物表达载体 pEARLYGATE 103。 将构建的质粒 pEARLYGATE::CHS8、 pEARLY GATE::IFS2 和 pEARLYGATE::CHS8+IFS2 通过冻 融法转入发根农杆菌 Agrobacterium rhyzogene K599 菌株 , 参照 Yi 等 [21-22]转化方法 , 以大豆子叶为外质 体获得转基因发状根 , 用于异黄酮测定。 1.5 异黄酮含量测定 参照鞠兴荣等 [23] 和吴敏等 [24] 三波长紫外分光 光度法测定总异黄酮含量。 即取大豆发状根 0.2 g 在 15 mL 70% 乙醇中匀浆 , 60℃ 下提取 2 h, 分别在 243、 263 和 283 nm 波长下比色 , 计算异黄酮含量。 1.4
Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210094, China; 2 Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,
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China; 3 Department of Plant Breeding and Genetics, University of Agriculture, Faisalabad 38040, Pakistan; Lianyungang 222006, China; Agriculture and Agri-Food Canada, London, ON N5V-4T3, Canada
[20] [14-20] [6-10]
为 CHS7 和 CHS8 在 CDS 区域内相似性达 96%, 而 5UTR 区域内相差明显 , 为特异区别两者 , CHS7 和 CHS8 的 5端引物设计位于 5UTR 内 , 而引物 3位于 Exon 内, 且两者完全相同。引物序列分别是 CHS7/5UTRf1: 5-gccCTGTGTGTTAACCAATTAAA3和 CHS8/5UTRf2: 5-GGTCAGAAGTCAACCACA TGTT-3, 而 3-端共用引物为 CHS78/EXNr: 5-GAC TTGTCACACATGCGCTGGAA-3。 用于 CHS8 取授 粉后 不同 时 期 9 种器官 [ 2 0 ] , 提取 总 RNA, 按 照 Invitrogen 反转录试剂盒说明获得单链 cDNA 进行 RT-PCR, 以揭示两者表达的组织特异性。
GmCHS8 和 GmIFS2 基因共同决定大豆中异黄酮的积累
易金鑫 1 朱虹润 1,2
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徐照龙 1,2 马鸿翔 1
王峻峰 4 张大勇 1 何晓兰 1 SANGEETA Dhaubhadel5
ZULFIQAR Ali1,3
江苏省农业科学院农业生物技术研究所 , 江苏南京 210014; 2 南京农业大学农学院 , 江苏南京 210095; 3 Department of Plant Breeding and Genetics, University of Agriculture, Faisalabad 38040, Pakistan; 4 江苏省连云港职业技术学院 , 江苏连云港 222006; 5 Agriculturቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ and Agri-Food Canada, London, ON N5V-4T3, Canada
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Liangyungang Technical College,
Abstract: Soybean isoflavonoids (isoFLVs) are natural secondary componds produced in Phenylpropanol metabolism Pathway. In past ten years, the isoFLVs were proved with anti-cancer activity to human health and therefore intensively included in nowadays food industry. However, the low content in natural soybean germplasm is a major limit to be weed in desired population. Herein we report that expression patterns of 18 362 genes were monitored by using Microarray between 30 to 70 days after pollination (DAP) during the soybean seed development. The expression profile of CHS8 and IFS2 revealed by both Microarray and RT-PCR indicated these two genes may play critical roles in determination of the accumulation of isoFLV in soybean seeds. According to Agrobacterium rhizogenes transformation system, over-expression of individuals of CHS8 and IFS2 resulted in 65.9% and 34.4% isoFLV increase respectively, but not significant in Duncan’s multiple test at the 0.05 probability level. However, co-expression of CHS8+ IFS2 significantly increased (P<0.0001) the isoFLV content up to 82.3% when comparing to non-transgenic control. Conclusively, both IFS2 and CHS8 gene co-determine the accumulation of isoFLV in soybean. Keywords: CHS8; IFS2; Over-expression; Co-determination; Soybean isoflavonoid content
, 因此 , 显著提高异黄酮含
量 , 已经成为进一步扩大应用大豆异黄酮亟待解决
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利用 Microarray 技术分析发现 , CHS8
基因是激活整个类苯基丙醇通路的关键基因 , 因而 也是异黄酮累积的关键基因 ; 过量表达 CHS8 基因 , 异黄酮支路代谢水平因主通路被激活而略有提高 , 异黄酮含量随之略有增加 , 但增幅不显著。这暗示 了在主通路以外 , 异黄酮支路中可能还存在关键基 因, 两者共同作用下可能显著提高异黄酮含量。 本研究试图利用 Microarray 技术 , 检测大豆整 个生育过程中类苯基丙醇主通路及异黄酮支路中所 有已知基因的表达水平及变化趋势 , 以期发现异黄 酮支路中的关键基因 , 并验证其在异黄酮积累过程 中的作用。
作物学报
ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 571578 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
http://www.chinacrops.org/zwxb/ E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00571
GmCHS8 and GmIFS2 Gene Co-Determine Accumulation of Isoflavonoid in Soybean
YI Jin-Xin1, XU Zhao-Long1,2, WANG Jun-Feng4, ZHANG Da-Yong1, HE Xiao-Lan1, ZULFIQAR Ali 1,3, ZHU Hong-Run1,2, MA Hong-Xiang1, and SANGEETA Dhaubhadel 5
摘
要 : 大豆异黄酮受多基因控制 , 采用传统育种方法提高大豆异黄酮含量比较困难。我们之前的研究表明 , CHS8
基因在异黄酮生物合成过程中发挥着重要作用 , 但 CHS8 基因过量表达并不能显著提高异黄酮含量。本研究利用 Microarray 技术 , 检测了高异黄酮品种 RCAT Angra (RCAT)和低异黄酮品种 Harovinton (HVNT)的 18 362 基因在种子 发育过程中表达水平的变化以及大豆种子中异黄酮累积的趋势 , 利用 RT-PCR 证实 CHS8 和 IFS2 分别是 CHSs 和 IFSs 基因家族中的主要基因 ; 证实 CHS8 是类苯基丙醇主路径中的主基因 , 并发现异黄酮支路中的 IFS2 基因在 RCAT 和 HVNT 品种中表达差异亦达到显著水平。进一步利用发根农杆菌转化系统 , 在大豆上分别过量表达 CHS8、 IFS2 和 CHS8+IFS2, 前两者异黄酮含量较对照分别提高 65.9%和 34.4%, 但增幅未达显著水平 ; 而后者则提高了 82.3%, 增 幅达极显著水平 (P<0.0001), 因而证实大豆中异黄酮的积累由 CHS8 和 IFS2 基因共同决定。 关键词 : CHS8; IFS2; 过量表达 ; 共同决定 ; 大豆异黄酮
大豆异黄酮是豆科植物的天然次生代谢产物 , 是大豆苷元 (daidzein)、染料木素 (genistein)和大豆黄 素 (glycitein)三大类化合物的总称 [1-2]。 异黄酮类产物
不但在植物体内参与防卫反应 [3] 及根瘤形成 [4] 等重 要生理过程 , 同时也是人类理想的天然抗癌防癌物 质 [5-7] 。目前 , 大豆及其制品已成为西方发达国家食
572
作 物 学 报
第 37 卷
品工业中的热点、重点 [8-9]。但是 , 大豆自然种质资 源中异黄酮含量较低 的问题。 大豆异黄酮含量受多基因控制 , 累加效应不显 著 , 因而使用传统方法提高大豆异黄酮含量难度较 大 , 国内最近育成的品种异黄酮含量大约在 0.4%左 右 [11-13] 。国外主要采用基因工程的策略来提高异黄 酮的含量。大豆异黄酮是由类苯基丙醇通路的分支合 成, 目前的研究表明, 过量表达 PAL、 C4H、 4CL、 CHS 和 CHI 等基因 , 并不能显著增加异黄酮含量 Sangeeta 等
本研究由国家自然科学基金项目 (30971798)，江苏省自然科学基金项目 (BK2010474)和江苏省农业科技自主创新基金项目 [CX(10)433]资助。 第一作者联系方式 : E-mail: yij@jaas.ac.cn, Tel: 025-84391105 Received(收稿日期 ): 2010-08-30; Accepted(接受日期): 2011-01-06.
Microarray 及其数据分析 大豆授粉后 30~70 d, 每 10 d 取未成熟种子提取 总 RNA, 参照 Sangeeta 等 [20]方法进行 Microarray。 采 用 Cluster 软 件 (http://rana.lbl.gov/EisenSoftware. htm) 分析数据和聚类分析基因变化趋势 , 并用 Java Treeview 软 件 (http://jtreeview.sourceforge.net/) 可 视 化作图。 载体构建及遗传转化 按照 Invitrogen 公司 Gateway BP Clonase II Enzyme Mix 和 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix 试剂盒说明 , 将候选基因 PCR 产物克隆到中间载体 pDONR221, 进而置换入植物表达载体 pEARLYGATE 103。 将构建的质粒 pEARLYGATE::CHS8、 pEARLY GATE::IFS2 和 pEARLYGATE::CHS8+IFS2 通过冻 融法转入发根农杆菌 Agrobacterium rhyzogene K599 菌株 , 参照 Yi 等 [21-22]转化方法 , 以大豆子叶为外质 体获得转基因发状根 , 用于异黄酮测定。 1.5 异黄酮含量测定 参照鞠兴荣等 [23] 和吴敏等 [24] 三波长紫外分光 光度法测定总异黄酮含量。 即取大豆发状根 0.2 g 在 15 mL 70% 乙醇中匀浆 , 60℃ 下提取 2 h, 分别在 243、 263 和 283 nm 波长下比色 , 计算异黄酮含量。 1.4