离心机

35
0
沉降中的颗粒
最大离心半径
最小 离心 半径
通常称离心管顶部 到旋转中心的距离为最 小离心半径rmin，该处承 受的离心力场为最小离 心力场；称离心管底部 到旋转中心的距离为最 大离心半径rmax，该处承 受的离心力场称为最大 离心力场。

在离心力场中加速度达到 数万甚至数十万倍重力加 速度时，颗粒的沉降也加 快了同样的倍数。这就使 得许多在重力场中不能沉 降的细小颗粒及密度较低 的物体组份能用离心技术 进行分离纯化。

当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场中，颗粒一直 沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）
形成区带，故称为等密度区带离心法。

颗粒的有效分离取决于其浮力密度差, 与颗粒的大小和形状 无关，但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽
度。颗粒的浮力密度与其原来的密度、水化程度及梯度溶
质的通透性或溶质与颗粒的结合等因素有关。因此，要求 介质梯度应有一定的陡度，要有足够的离心时间形成梯度 颗粒的再分配，进一步离心也不会有影响。
混合液
静置一段时间后
沉降速度(sedimentation velocity) 指在强大离心力作用下， 单位时间内物质运动的距离。即：
dx m(1ρ0 /ρ) g dt f
ρ0 为介质的密度，ρ为微粒的密度，g为重力加速度，f 式中， 为阻力系数。由上式可知，微粒的沉降速度与 m(1ρ 0/ ρ )g 成正比，与阻力系数f成反比。
5ml血液 离心5分钟 血细胞 血浆
第二节 常用的离心方法
一、差速离心法
差速离心法(differential velocity centrifugation method)是利用不同的粒子在离心力场中沉降的差 别，在同一离心条件下，通过不断增加相对离心 力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的 粒子分步沉淀的离心方法。主要用于一般及特殊

“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。
f
三、液体中的微粒在重力场中的分离

若想把生物样品中的微粒从液体 中分离出来，最简单的方法是将
液体静置一段时间，液体中的微
粒受重力的作用，较重的微粒下 沉与液体分开，这个现象称为重
力沉降。微粒在液体介质中的沉
降将受到介质的浮力、介质阻力 及扩散现象的影响。
逐渐下沉，下沉的速度与微粒的 大小、形态、密度、重力场的强 度及液体的黏度有关。如红细胞 颗粒，直径为数微米，可以在通 常重力作用下观察到它们的沉降 过程。此外，物质在介质中沉降 时还伴随有扩散现象。
时间
重 力

扩散是由于微粒的热运动而产生
的质量迁移现象,主要是由于密度
差引起的。对小于几微米的微粒 如病毒或蛋白质等，它们在溶液 中成胶体或半胶体状态，仅仅利 用重力是不可能观察到沉降过程
密度梯度离心法
不同的离心分离的原理
1.速率区带离心法 2.等密度区带离心法
（一）速率区带离心法

速率区带离心法是根据被分离的粒子在梯度液中沉降速度 的不同，离心后分别处于不同的密度梯度层内形成几条分 开的样品区带，达到彼此分离的目的。

梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介
质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子
密 度 梯 度 离 心 法
优 点
2.适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，又能分离有 一定浮力密度的颗粒； 3.颗粒不会积压变形，能保持其活性，并可防止已形成的 区带由于对流而引起混合。 1.离心时间较长；需要制备成梯度液； 2.操作严格，不宜掌握。
缺 点
密度梯度离心机

离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形 成的密度梯度液中，离心后被分离组份以区 带层分布于梯度液中。
扩散现象
的，因为颗粒越小沉降越慢，而
扩散现象则越严重。

扩散现象是不利于样品分离的，如果加大重力， 就可能克服扩散现象的不利影响,实现生物大分子 的分离。 离心机就是利用离心机转子高速旋转产生的强大 的离心力，迫使液体中微粒克服扩散加快沉降速 度，把样品中具有不同沉降系数和浮力密度的物 质分离开。
程中，总可见到离心技术的运用。离心机是生
命科学研究的基本设备，在生命科学，特别是 生物化学和分子生物学研究领域，随着分子生 物学研究对分离设备日益增多的需要而有了很 大的发展。

在引入了微处理器控制系统后，各种转速级别的离 心机已经可以分离纯化目前已知的各种生物体组份 （细胞、亚细胞器、病毒、激素、生物大分子等等

实际上颗粒是在介质中运动 的，颗粒作切线运动时将由 于介质的摩擦阻力，使其在 离心管中依图中虚线所示的 曲线运动，当离心管由0位 转到2位时，颗粒由顶位移 到B位。介质的阻力越大， 颗粒的沉降速度越小、沉降 的距离也越短。旋转速度越 大，颗粒的沉降越快。
离 心 沉 降 示 意 图

离心管依斜角插于离心机的转头 0 孔中，与转头旋转轴成 35 角，离 心管中放置被离心的样品溶液， 离心管顶部到旋转中心的距离和 离心管底部到旋转中心的距离不 一样，因此其顶部和底部所承受 的离心力场也不一样。
）。而对离心方法的深入研究又可以利用这些离心
设备更快、更纯、更多地分离纯化样品。诸如分离
出化学反应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机
物、有机物，在生物化学以及其它的生物学领域常
用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。
第一节
离心技术的基础理论
一、离心机工作原理

离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差


时间
等密度区带离心示意图
操作中，一般是将被分离样 品均匀分布于梯度液中，离 心后，粒子会移至与它本身 密度相同的地方形成区带， 收集好所需区带即为纯化的 组份。 由于其梯度形成需要梯度液 的沉降与扩散相平衡，需经 长时间离心后方可形成稳定 的梯度，所以等密度离心法 主要用于科研及实验室特殊 方面的样品组份的分离和纯 化。
样品的分离，例如分离细胞器和病毒。

操作过程一般是在离心 后用倾倒的办法把上清
液与沉淀分开，然后将
上清液加高转速离心， 分离出第二部分沉淀， 如此反复加高转速，逐
差速离心法原理示意图
级分离出所需要的物质
（如左图所示）。
差 速 离 心 法
优 点
1.操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开; 2.可使用容量较大的角式转子；分离时间短、重复性高； 3.样品处理量大。
再混合，常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

此离心法须严格控制离心时间，使得既能使各种 粒子在介质梯度中形成区带，又要把时间控制在 任一粒子达到沉淀前。若离心时间过长，所有的 样品全部都到达离心管底部；若离心时间不足， 则样品还没有分离。

此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小 的影响较大，因此一般是在物质大小相异而密度 相同的情况下应用。
方 法
相同点
不同点
等密度区带离心法
使梯度液的最大密度不超过样品 在该梯度中的浮力密度，利用这类生 物组份在尺寸上的差异形成的沉降速 率的不同，选择某一特定离心时间， 当它们中的各个纯样品区带之间的距 预先制备 离拉得最远时停止离心即可以达到分 分离液 离目的。 是一种平衡离心法，利用被分离 物的密度的差别而进行分离纯化，从 梯度介质形成到样品颗粒形成等密度 区带，与分离物的大小及形状无关。
2 2 2 N 4 N rm 2 2 Fc m r m( ) r 60 3600
式中ω是旋转角速度，Ｎ是每分钟转头旋转次数，r 为
离心半径，m是质量。
2.相对离心力(relative centrifugal force，RCF)

相对离心力是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于 地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”。 由于各种离心机转子的半径或离心管至旋转轴中心的距离不 同，离心力也不同,因此在文献中常用“相对离心力”或“ 数字×g”表示离心力,例如25000×g,表示相对离心力为25000 。只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相 同的结果。一般情况下,低速离心时相对离心力常以转速
速率区带离心法
方 法
特点 根据样品组份的沉降系数不 同进行分离 根据样品组份的沉降系数不 同进行分离
差速离心法 速率区带离心法
等密度区带离心法
根据样品组份的密度不同进 行分离
缺 点
1.分辨率有限、分离效果差，不能一次得到纯颗粒； 2.壁效应严重，容易使颗粒变形、聚集而失活。

对分离纯度要求较高的样品应用此法，容易造成被 分离物的大量丢失，变性以及造成污染，尤其对于
一些沉降系数相差不太大的组份要获得完全的分离
提纯比较困难，所以该离心方法常用于要求不严格
样本的初步分离和大批量标本的处理，例如分离已
沉降系数（sedimentation coefficient）

颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度，其单位为 秒。沉降系数与样品颗粒的分子量、分子密度、组 成、形状等都有关，样品颗粒的质量或密度越大， 它表现出的沉降系数也越大。各种生物样品的沉降 系数差别很大，因此可以应用离心技术来进行其定 性和定量的分析及分离制备。
异进行分离、浓缩和提纯生物样品的一种方法。悬浮液在高速旋转
下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大 分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而使溶液得以分离、浓缩和
提纯，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速、颗粒的质量、大小和
密度。
血浆 试管 离心沉降物
血液

当悬浮液静置不动时，由于重力
场的作用可使得其中悬浮的颗粒
破碎的细胞各组份等。
二、密度梯度离心法

密度梯度离心法(isodensity centrifugation
method)又称为区带离心法。
பைடு நூலகம்

样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉
淀或沉降平衡，在一定离心力作用下把
颗粒分配到梯度液中某些特定位置上， 形成不同区带的分离方法。
分离前 分离后
1.分辨率高，分离效果好，可一次获得较纯颗粒；
四、液体中的微粒在离心力场中的沉降

在离心机中，离心管 （centrifuge tube）放 于离心转头里，当离 心机开动时，离心管 绕离心转头的轴旋转 ，作圆周运动，在离 心管内的样品颗粒将 同样运动。

假如颗粒处于真空中，颗粒 会沿切线方向飞去,也就是当 离心管由图中的0位转到1位 时，颗粒到达离心管底部A 位。对于离心管而言，样品 颗粒由顶位移到了A位，也 就是由离心管顶部移到了底 部，这与重力场中的由高处 落到低处相似。这种颗粒在 圆周运动时的切线运动称为 离心沉降.
第二章 离心技术与离心机


离心现象是指物体在离心力 场中表现的沉降运动现象。 应用离心沉降进行物质的分 析和分离的技术称为离心技 术（centrifugal technique）。 实现离心技术的仪器是离心 机（centrifuge）。

离心技术主要用于各种生物样品的分离、纯化
和制备，在细胞生物学和分子生物学的每一进
临床实验室常用Percoll作
分离溶液，用于静脉血中单个 核细胞的分离。先把梯度液加 入离心管中，溶液的密度从离 心管顶部至底部逐渐增加（正 梯度）。将所需分离的样品小 心的加至密度梯度溶液的顶部 ，样品在梯度溶液表面形成一 负梯度（如右图所示）。
速率区带离心示意图
第二节 常用的离心方法 （二）等密度区带离心法

二、离心力与相对离心力
1.离心力（centrifugal force，Fc） 当物体所受外力小于运动所需要 的向心力时，物体将向远离圆心 的方向运动。物体远离圆心运动 的现象称为离心现象。也叫离心 运动。离心运动是由于向心力消 失或不足而造成的。
旋 转 离心力
离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任何物 体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小 等于离心加速度ω2 r与颗粒质量m的乘积，即：
沉降时间(sedimentation time，Ts)

在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上 把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来需用多 大转速与多长时间可达到目的的问题。如果转速 已知，则需确定分离某粒子所需的时间即沉降时 间。
K系数(k factor)

描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率，也 就是溶液恢复成澄清程度的一个指数，所以也称 之为“cleaning factor”。原则上，K系数愈小，愈 容易也愈快地将粒子沉降。K系数与离心转速及粒 子沉降的路径有关，所以K系数是一个变数。