酶联免疫吸附实验培训课件
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酶联免疫吸附实验PPT课件
乙肝表面抗原，存在于HBV感
HBeAg, HBeAb
染者的血清中,为感染指标之
一。 HBcAb(IgG,IgM)
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实验材料
1.HBsAg诊断试剂盒 2.HBsAg抗原（阳性对照），阴性血清，待 检血清
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微孔条已经包被HBsAb
1、编号：微孔条按顺序编号。 2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul， 空白对照。 3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加， 轻拍混匀。 4、温育：贴上胶纸，37℃温育30分钟。 5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持 30-60秒的浸泡时间）。 6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口，37℃暗 置10-15分钟。 7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。 8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果， 读数在加终止液10分钟内完成。
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四、注意事项 1、所有样品按传染源处理； 2、加试剂前应混匀，力求滴加准确； 3、加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成； 4、洗涤时各孔均需加满，洗涤必须彻底，防止产生假阳性； 5.温育的时间要严格控制。
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自习
五、 ELISA的影响因素
（一）固相载体 （二）抗原 （三）试验样品 （四）结合物
酶联免疫吸附测定法ppt课件
酶联免疫吸附测定法显色反应测定波长辣根过氧化物酶四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺22连胺基23乙基并噻唑啉磺酸6铵盐橘红色黄色棕色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶4硝基酚磷酸盐pnp萘酚asmx磷酸盐重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶abtshrp葡萄糖葡萄糖甲硫酚嗪噻唑兰黄色深蓝色405420d半乳糖甲基伞酮基半乳糖苷4mug硝基酚半乳糖苷onpg荧光黄色360450420酶联免疫吸附测定法10一双抗体夹心法二间接法三竞争法四双位点一步法五捕获法测igm抗体六应用亲和素和生物素的elisa酶联免疫吸附测定法11一双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原酶联免疫吸附测定法12获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本抗原形成固相抗体抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体待测抗原酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定酶联免疫吸附测定法13间接法是检测抗体最常用的方法其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体故称为间接法
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
参考文献：
《生物体系中的化学测量》 Kent k.Stewart Richard E.EBEL 著 www.biox.cn 生命经纬
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DNM-9602 标配酶标分析仪
参考文献：
《生物体系中的化学测量》 Kent k.Stewart Richard E.EBEL 著 www.biox.cn 生命经纬
酶联免疫吸附试验的基本原理 ppt课件
ppt课件
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（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参 考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测 管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
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检测抗体的方法
（一）间接法 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测 已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
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9
（二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定 簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本 的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了 操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感 性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的 ELISA提高 到新水平。
Leabharlann Baiduppt课件
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（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。 洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性 IgM抗体 存在，是为阳性反应
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ppt课件
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4
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分 析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测 定方法达到很高的敏感度。
酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)
酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验（ELISA）
一、基本原理
将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面， 使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法 将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分 分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显 色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定 量分析。
二、ELISA的方法类型（六种）
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：
①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。
②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。
③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。
④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比 色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗 体含量成反比。
竞争法检测HBeAb
（一）双抗体夹心法检测抗原
1.原理 将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相
应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合 成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成 固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗原的含量。
双抗体夹心法检测抗原
标本（含抗原） 固相抗体
底物
酶标抗体
E
E
2．棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度
（1）用包被液将抗原作一系列稀释后包被，洗涤。 （2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性 参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，温育，洗 涤。 （3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，温育， 洗涤。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
一、基本原理
将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面， 使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法 将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分 分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显 色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定 量分析。
二、ELISA的方法类型（六种）
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：
①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。
②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。
③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。
④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比 色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗 体含量成反比。
竞争法检测HBeAb
（一）双抗体夹心法检测抗原
1.原理 将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相
应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合 成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成 固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗原的含量。
双抗体夹心法检测抗原
标本（含抗原） 固相抗体
底物
酶标抗体
E
E
2．棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度
（1）用包被液将抗原作一系列稀释后包被，洗涤。 （2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性 参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，温育，洗 涤。 （3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，温育， 洗涤。
酶联免疫吸附测定法ppt课件
酶Fra Baidu bibliotek底物
1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，
最适吸收波长为492nm TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4
终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶
一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物 为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。 用NaOH终止酶反应
实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
酶联免疫吸附测 定法
免疫学实验
基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
实验原理 双抗体夹心法
双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测 抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少 两个抗原决定簇的多价抗原。 其基本工作原理是：利用连接于固相载体上 的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子 上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶 标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原 的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的 底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测 抗原含量。
全面酶联免疫吸附实验.ppt
二、双抗体夹心法 此法常用于测抗原。将已知抗体吸附
于固相载体，加入待检标本（含相应抗原） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和 底物显色进行测定（图2）。
精心整理
5
图2: 双抗体夹心法测抗原示意图
精心整理
6
第二部分: 常用实验方法
三、竞争法
此法常用于测抗原和半抗原，也用于测 抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于 固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原， 使两者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分 离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗 原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原 颜色反应的差数是待测抗原的含量（图3）。
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源自文库
9
第四.一部分: 人TNF-α检测实验原理
基本实验原理: 双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-α单抗包
被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-α会与 单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素 化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-α 抗体与结合在单抗上的人TNF-α结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反 应孔中有人TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的 显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A 值，人TNF-α浓度与A450值之间呈正比，可通过 绘制标准曲线求出标本中人TNF-α浓度。
125 62.5 pg/ml pg/ml
于固相载体，加入待检标本（含相应抗原） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和 底物显色进行测定（图2）。
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图2: 双抗体夹心法测抗原示意图
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第二部分: 常用实验方法
三、竞争法
此法常用于测抗原和半抗原，也用于测 抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于 固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原， 使两者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分 离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗 原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原 颜色反应的差数是待测抗原的含量（图3）。
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第四.一部分: 人TNF-α检测实验原理
基本实验原理: 双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-α单抗包
被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-α会与 单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素 化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-α 抗体与结合在单抗上的人TNF-α结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反 应孔中有人TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的 显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A 值，人TNF-α浓度与A450值之间呈正比，可通过 绘制标准曲线求出标本中人TNF-α浓度。
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酶联免疫吸附试验 ppt课件
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
Or
加入底 物溶液A、
B
孵育
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入终 止液
37℃
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
▲ 例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶结 合物）
孵育， 洗板
加入底 物溶液A、
B
粉碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温
（药品冷藏箱（2~8℃）） 结果分 析
吸光度 测量
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
Or
加入底 物溶液A、
B
孵育
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入终 止液
37℃
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
▲ 例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶结 合物）
孵育， 洗板
加入底 物溶液A、
B
粉碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温
（药品冷藏箱（2~8℃）） 结果分 析
吸光度 测量
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
酶联免疫吸附试验 PPT课件
酶联免疫吸附试验
（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)
ELISA的基本原理
①使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。 ②使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。 ③在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗体）按
不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。
为酶标记抗原-抗体复合物。
4.酶催化底物并显色。
参
酶标抗原
考 管
YYY +
YYY +
YYY
待
酶标抗原
测 管
YYY +
YYY +
YYY
抗原
间接ELISA方法的建立
1、抗原最佳包被液的选择； 2、抗原、血清和酶标二抗工作浓度的确定； 3、封闭液的选择； 4、封闭时间的优化； 5、血清稀释液的选择； 6、抗原抗体反应时间的优化。
7、 酶标二抗：稀释HRP标记羊抗猪IgG，每孔100µL， 37℃作用30min； 8、洗涤； 9、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔100µL，室温 避光作用15min； 10、加终止液：加50µL 2mol/L硫酸； 11、读数：用酶标仪检测OD450值。
ELISA的优点：
血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血 凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体结合 等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技 术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从 而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可 做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结 构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同 时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)
ELISA的基本原理
①使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。 ②使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。 ③在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗体）按
不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。
为酶标记抗原-抗体复合物。
4.酶催化底物并显色。
参
酶标抗原
考 管
YYY +
YYY +
YYY
待
酶标抗原
测 管
YYY +
YYY +
YYY
抗原
间接ELISA方法的建立
1、抗原最佳包被液的选择； 2、抗原、血清和酶标二抗工作浓度的确定； 3、封闭液的选择； 4、封闭时间的优化； 5、血清稀释液的选择； 6、抗原抗体反应时间的优化。
7、 酶标二抗：稀释HRP标记羊抗猪IgG，每孔100µL， 37℃作用30min； 8、洗涤； 9、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔100µL，室温 避光作用15min； 10、加终止液：加50µL 2mol/L硫酸； 11、读数：用酶标仪检测OD450值。
ELISA的优点：
血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血 凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体结合 等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技 术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从 而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可 做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结 构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同 时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
酶联免疫吸附实验ppt课件
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。
2、冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属 于正常现象，加热溶解后再配制。
3、装量极少的试剂(2a和3a)应先离心或用手 甩几下，以使管壁液体沉于管底。
4、不同批号的试剂盒组份不能混用。
21
第四.五部分: 注意事项(2)
5、检测标本如为组织培养液，应用培养液作 为标准品/样品稀释液。
22
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
-20℃,避免反复冻融 6.可根据实际情况, 将标本作适当倍数稀释(建议做
预实验, 以确定稀释倍数)
12
试剂盒及其内容物
1a 标准品1支(4000pg，冻干)4℃ 1b 标准品和标本稀释液(粉红色) 1瓶(15ml)4℃ 2a 浓缩生物素化抗体2/1支*(60μl)4℃ 2b 生物素化抗体稀释液（绿色）（15ml）4 ℃ 3a 浓缩酶结合物2/1支*(60μl)4℃(避光) 3b 酶结合物稀释液(黄色)1瓶(15ml)4℃ 4 浓缩洗涤液 20×(兰色)1瓶(15ml)4℃ 5 显色剂1瓶(6ml)4℃ 6 终止液1瓶(12ml)4℃ 抗体包被板条8×12 或 8×6 4℃ 封板胶纸1张 说明书1份 *:[96/48 Test]
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。
2、冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属 于正常现象，加热溶解后再配制。
3、装量极少的试剂(2a和3a)应先离心或用手 甩几下，以使管壁液体沉于管底。
4、不同批号的试剂盒组份不能混用。
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第四.五部分: 注意事项(2)
5、检测标本如为组织培养液，应用培养液作 为标准品/样品稀释液。
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-20℃,避免反复冻融 6.可根据实际情况, 将标本作适当倍数稀释(建议做
预实验, 以确定稀释倍数)
12
试剂盒及其内容物
1a 标准品1支(4000pg，冻干)4℃ 1b 标准品和标本稀释液(粉红色) 1瓶(15ml)4℃ 2a 浓缩生物素化抗体2/1支*(60μl)4℃ 2b 生物素化抗体稀释液（绿色）（15ml）4 ℃ 3a 浓缩酶结合物2/1支*(60μl)4℃(避光) 3b 酶结合物稀释液(黄色)1瓶(15ml)4℃ 4 浓缩洗涤液 20×(兰色)1瓶(15ml)4℃ 5 显色剂1瓶(6ml)4℃ 6 终止液1瓶(12ml)4℃ 抗体包被板条8×12 或 8×6 4℃ 封板胶纸1张 说明书1份 *:[96/48 Test]
酶联免疫吸附试验ppt课件
4.
5.
6.
结果判定：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的酶标抗
体的稀释度为该抗体的效价。
抗体稀释及加样方法
500l 样品稀释液
① ②
③
④
⑤ 女
⑥
500l E-Ab
女
1.准备7个稀释管，做好标记。 2.先在每个稀释管中加入稀释液 500ul。 3.取500ul抗体加入第一管，混 匀后，取出500ul加入第二管， 依此类推至最后管。
显色原理
DH2 + H2O2
HRP
D
+
2H2O
（底物）
常用的供氢体： 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB ABTS
OPD（邻苯二胺）
OPD氧化后的产物呈明黄色，用酸终止酶反应 后，由橙红色转向棕黄色，在492nm处有最高
吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物
最常用的底物。
磷酸盐缓冲液：（PBS）
吐温20（Tween 20):
非离子型表面活性剂 抑制蛋白质非特异性吸附于塑料表面
标记抗体常用的酶
辣根过氧化物酶(horseradish
碱性磷酸酶(alkaline
peroxidase, HRP)
phosohatase, AP)。
葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
酶联免疫吸附测定法ppt课件
特点一：灵敏性
该测定法的灵敏度来自作为报告集团的 酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少 量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可 供观察的显色反应现象。因此该体系常被称 为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细 胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在 微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时， 化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应 测定法的敏感度约为5~10μg/ml 。
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法 间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体
一、基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待 测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上， 但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原） 与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保 留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体 上的抗原（抗体）反应结合后， 再加上酶 的相应底 物，即起 催化水解 或氧化还 原反应而 呈颜色。
培训课件酶联免疫吸附试验ELISA操作注意事项ppt课件
产生非特异性显色的原因
一． 试剂盒因素：固相载体原料的不同和制作工艺的差别、包被物 的提纯度、固相载体表面未被包被的空隙封闭不良等；
二． 人为因素：加样、洗板、温育、判断结果中的操作不当或责任 心不强等造成假阳性或假阴性；
三． 标本中含有干扰物： 1.内源性干扰物——样品中有与目标成分性质相似的物质。 2.外源性干扰物——常常因样品采集、储存、处理不当造成的 样品性质变异，被细菌污染等。
洗液：非离子型洗涤剂
酶反应的底物： H2O2，为受氢体； 显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS，
为供氢体。
终止液为硫酸。ຫໍສະໝຸດ Baidu
2 试剂的准备
（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出， 在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使试 剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要 是为了缩短升温时间，使反应孔内的温度能较快 地达到所要求的高度，以满足测定要求。
1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样本及反应试剂 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断
1 标本的收集和保存
样品必须置冰箱中冷冻保存。 待检测时取出解冻待测。
1 标本的收集和保存
（1）细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体 等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶可对 以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 样品在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状 物时，应离心沉淀后取上清检测。
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500 pg/ml
250 pg/ml
125 62.5 pg/ml pg/ml
31.25 pg/ml
标准品稀释方法
酶联免疫吸附实验
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第四.四部分: 结果判断与计算
1、每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。 2、绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
-20℃,避免反复冻融 6.可根据实际情况, 将标本作适当倍数稀释(建议做
预实验, 以确定稀释倍数)
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试剂盒及其内容物
1a 标准品1支(4000pg，冻干)4℃ 1b 标准品和标本稀释液(粉红色) 1瓶(15ml)4℃ 2a 浓缩生物素化抗体2/1支*(60μl)4℃ 2b 生物素化抗体稀释液（绿色）（15ml）4 ℃ 3a 浓缩酶结合物2/1支*(60μl)4℃(避光) 3b 酶结合物稀释液(黄色)1瓶(15ml)4℃ 4 浓缩洗涤液 20×(兰色)1瓶(15ml)4℃ 5 显色剂1瓶(6ml)4℃ 6 终止液1瓶(12ml)4℃ 抗体包被板条8×12 或 8×6 4℃ 封板胶纸1张
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酶联免疫吸附实验
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第四.二部分: 实验试剂、材料和仪器设备
• 实验标本 • 试剂盒及其内容物 • 实验材料 • 仪器设备
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实验标本
人外周血(血清) 1.收集血液的试管应为无热源和内毒素试管 2.血浆抗凝剂为EDTA 3.标本应清澈透明, 如有悬浮物应离心除去 4.避免溶血, 高血脂 5.标本收集后若不及时检测,按一次用量分装,冻存于
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第四.一部分: 人TNF-α检测实验原理
基本实验原理: 双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-α单抗包
被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-α会与 单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素 化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-α 抗体与结合在单抗上的人TNF-α结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反 应孔中有人TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的 显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A 值，人TNF-α浓度与A450值之间呈正比，可通过 绘制标准曲线求出标本中人TNF-α浓度。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。
10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合 工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟.
说明书1份 *:[96/48 Test]
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实验材料与设备
1.加样器: 0.5-10ul, 2-20ul, 20-200ul, 2001000ul
2.吸头: 10ul, 200ul,1000ul 3.酶标仪: 450nm 4.双蒸水或去离子水, 坐标纸等
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第四.三部分: 实验方法与步骤
酶联免疫吸附实验
第一部分: 基本实验原理
基本原理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相
载体上，并保持其免疫活性，将待检标本 和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体 表面吸附的抗体或抗原进行反应，用洗涤 的方法分离抗原抗体复合物和游离成分， 然后加入酶的作用底物催化显色，进行抗 原或抗体的定性或定量检测。
11 、洗板4次.
12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。
13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。
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500μl std.
500μl 500μl 500μl 500μl 500μl
2000 pg/ml
1000 pg/ml
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
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2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第二部分: 常用实验方法
一、间接法 此法常用于测抗体。将已知抗原吸附于
固相载体，加入待检标本（含相应抗体） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋 白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测 定（图1）。
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固相抗原 酶标抗抗体
待测标本(含相应抗体)
图1: 间接法测抗体示意图
• 1、提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至 室温。
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
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第二部分: 常用实验方法
二、双抗体夹心法 此法常用于测抗原。将已知抗体吸附
于固相载体，加入待检标本（含相应抗原） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和 底物显色进行测定（图2）。
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图2: 双抗体夹心法测抗原示意图
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图3: 竞争法测抗原示意图
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第三部分: 方法的特点和进展
ELISA方法由于灵敏、特异，操作简便、 快速，实验设备要求较为简单，应用范围 广泛，无放射性污染等优点，成为目前普 及应用最广，发展最快的免疫学技术之一。 生物素-亲合素系统（BAS）是在ELISA中 应用的常见技术（BAS-ELISA），其中 ABC- ELISA法更为常用，其基本原理为， 固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素 -酶标生物素复合物+底物显色。