8第八章原位杂交组织化学全解
原位杂交组织化学
地高辛标记物 洋地黄毒苷(Dig)，不会产生内
源性相似物质的干扰，敏感性与 放射性核素标记的探针相仿。杂 交的切片背景好、细胞定位准确， 是当前杂交化学最为流行的方法。
三、原位杂交组织化学方法 1、原位杂交的类型：
根据探针标记物是否能被直接检测到，分为直接法和 间接法。 直接法:标记物为放射性同位素、酶或荧光。 间接法:标记物为半抗原，如生物素或地高辛。 2、原位杂交技术基本方法
4、防止RNA酶的污染 ●在整个操作过程中应戴手套和口罩； ●玻璃器皿常规洗净后，应用RNA酶抑制剂（0.1%的 二乙基焦磷酸盐液， DEPC）浸泡处理（37℃,2h）,再 用双蒸灭菌水漂洗几次，高压消毒去除DEPC,然后于 180 ℃烘烤4h.;镊子高温烘烤。 ●塑料器皿最好用一次性用品，使用前进行高压消毒； ●所有溶液应加DEPC，终浓度为0.05-0.1%，室温处 理过夜。然后高压处理以去除所有残留的DEPC.
3．杂交的温度和时间 原位杂交中，多数DNA探针需要的Tm是90℃，而RNA则 需要95℃。这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片 粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交的程序中常规 的加入30%～50%甲酰胺于杂交液中。反应液中每增加 1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。由于盐和甲酰胺 浓度的调节等因素，实际采用的原位杂交的温度在Tm25℃左右，大约在30～60℃之间。 杂交的时间如过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非 特异性染色。从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在 3h左右。为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h， 或为简便起见杂交孵育过夜。
原位杂交组织化学
1991年 Couton建立将非放射性标记技 1991年 Couton建立将非放射性标记技 术更新为亲和复合物标记技术 AffinityProbFra Baidu biblioteks， （Affinity-complex Labelled Probes， ACLP）。 ACLP）。 发展趋势： 发展趋势：实验室常规技术和临床日常 应用的诊断技术。 应用的诊断技术。
DNA和RNA的区别 DNA和RNA的区别
DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。 DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。 常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或 细胞内的DNA原位杂交 细胞内的DNA原位杂交 DNA RNA：RNA酶几乎无处不在， RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的 消毒方法不能将其灭活。因此，当检测 消毒方法不能将其灭活。因此， RNA或用RNA作为探针时， RNA或用RNA作为探针时，从标本准备到 或用RNA作为探针时 杂交结束前， 杂交结束前，都要注意预防
操 作
1、固定小块组织于多聚甲醛中，4 ℃，不超过24h，时间 、固定小块组织于多聚甲醛中， 不超过24h 24h， 段，,mRNA损失少 ,mRNA损失少 2、PBS洗，两次，每次30分钟 PBS洗 两次，每次30分钟 30 3、常规脱水、透明、包埋。也可冰冻切片 常规脱水、透明、包埋。 4、切片4-5微米 切片4 5、用0.1%DEPC水捞片（捞片器皿预先处理） 0.1%DEPC水捞片（捞片器皿预先处理） 水捞片 ℃烤片 烤片1 充分干燥。 6、37 ℃烤片1-3天，充分干燥。 ℃，放干燥剂（使用时必须现在37 7、储存与-20 ℃，放干燥剂（使用时必须现在37 ℃ 干 储存与燥一天，以防脱落） 燥一天，以防脱落）
原位杂交技术原理及其应用
核酸探针的分类
• 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分 为放射性探针和非放射性探针两类。 • 根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、 RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷 酸探针等。 • DNA探针还有单链DNA（Single stranded, ssDNA）和双链DNA（Double stranded, dsDNA）之分。
• 上述生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。 另一种叫光促生物素标记核酸技术（1985） ， 该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核 酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素 生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、 连结臂和生物素。在强光下，不需酶反应，光敏 生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。 • 光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低， 但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一 个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探 针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度。
• 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境， 又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学 工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核 酸探针进行原位杂交。 • Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探 针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功。 • Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛 （DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原 性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探 针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交 探针。 • 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高， 应用不够普遍。
最新免疫组化与原位杂交
2）复合固定剂
Bouin氏液：含苦味酸（nitroxanthic acid）和冰醋酸 （glacial acetic acid）的甲醛溶液。
Zamboni氏液：含苦味酸和冰醋酸多聚甲醛溶液。
PLP（periodate-lysine-paraformaldehyde）：含过碘酸和 赖
③ 替代实验：组化染色程序中用同型（isotype）抗体替代一抗。
④ 吸收实验：组化染色程序中用过量相应抗原吸收一抗以阻止标 本中的抗原与一抗结合。
三）敏感性(sensitivity)：指所用的免疫组化方法能检测的抗原 量。
1.敏感性与特异性的关系：一般是相反的关系。
2.提高敏感性的方法：
①选用敏感的免疫组化染色方法： 如EnVision两步法，PAP或APAAP法，ABC法。
常用的间接法： 1）两步法（two-step staining method）：
优点:敏感性很高，特异性高，不受内源性生物素影响。 缺点:背景染色高。
2)过氧化物酶抗过氧化物酶（peroxidase anti-peroxidase， PAP）
或碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（alkaline phosphatase antialkaline phosphatase, APAAP）method
原位分子杂交组织化学
寡核苷酸探针
1. 链短、分子量小、序列复杂度低,杂交时间比克隆探针短。 2. 可识别靶序列中一个碱基得变化,故成套探针用于碱基点突变得检测。 3. 一次可大量合成,价格低廉,易于标记。 4. 缺点:与克隆探针比较,特异性差,杂交信号弱。
玻片置于热肥皂水浸泡4小时以上 自来水 清洗干净置于酸缸中浸泡过夜 清水洗净烘 干 烘箱温度最好在150℃或以上烤干4小时 以上。以去除任何RNA酶、盖玻片在有条件时 最好用硅化处理,锡箔纸包裹无尘存放、
粘附剂:常用得粘附剂多聚赖氨酸溶液。
2 、切片处理:增强组织通透性和探针穿透性
1)充分脱蜡
2)防止探针与组织中碱性蛋白静电结合,降低背景 • 稀酸处理(0、2 mol/l HCL 10min) • 乙酰化(0、25%乙酸酐10min)
*引入法:运用标记好得核苷酸来合成探针;
*化学修饰法:采用化学方法将标记物掺入已合 成得探针分子中去,或改变探针原有得结构,使 之产生特定得化学基团。
• 引入法较化学修饰法更常用,按其整合得 方法不同,引入法分为: *缺口平移法 *随机引物法 *末端标记法 *PCR扩增标记法 *RNA体外转录法
缺口平移法
• 原理:利用DNA酶I在双链DNA得各股单链得不同位 置上造成随机切口,再利用大肠杆菌DNA聚合酶进 行5’→3’修复,将已标记dNTP 掺入到新合成得 DNA 链中。
原位杂交
原位杂交
核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项技术。它以带标记物的核酸作为探针，在一定条件下，在组织细胞原位与待测核酸序列（如DNA，RNA）进行杂交形成杂交体，然后通过与标记物相应的检测系统，从而在原位对组织细胞中待测的核酸序列进行定性、定位和相对定量的研究。
分子生物学技术中的杂交
液相杂交: 参加反应的二条核酸都游离在溶液中
固相杂交: 将一条核酸链固定(点样或吸印转移)到固体的支持物上, 再与溶液中的核酸探针杂交
菌落原位杂交Colony in situ hybridization
斑点杂交Dot blot
Southern 印迹杂交
Northern 印迹杂交
原位杂交
又称原位杂交组织化学
依照细胞化学的原则, 在保持组织、细胞或染色体结构的条件下，在原位检测特异的核酸分子
原位杂交原理
变性(denaturation)---双螺旋DNA分子在某些因素作用下, 双链间的氢键解开或断裂, 解离成二条单链的过程
复性(renaturation)---变性的二条DNA单链在合适的条件下, 又可按原来碱基互补配对, 再结合在一起形成双螺旋结构
退火
杂交(hybridization)---不同来源但具有同源性的二条DNA或RNA单链, 按碱基配对原则结合在一起
⏹探针(probe)---一段已知序列的DNA、RNA或寡核苷酸片段
靶核酸分子---所要检测的核酸分子或核苷酸序列，可以是DNA或RNA
原位杂交基本原理
利用标记的核酸探针与组织细胞中的待测核酸进行杂交，然后用放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行检测，从而在组织细胞原位显示某种特定基因、或mRNA分
8第八章原位杂交组织化学gil
产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。 多聚甲醛：仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。
多聚甲醛——mRNA的定位
将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻 前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或 保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸 入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。 如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂 交结果。
甲酰胺：在杂交液中占50%左右；调节杂交反应温度，利 于保持组织形态结构；防止低温时非同源性片段结合；但 具有破坏氢键的不稳定作用。 硫酸葡聚糖：在核酸杂交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是 一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合作用，因而 能大大增加杂交液的粘稠度；促进杂交率，特别是对双链 核酸探针。
❖ 包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。
目的：通过杂交后的洗涤将组织切片中非碱基配对除去，有 效地减低背景染色，获得较好的反差效果。 洗涤的条件：如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核 酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共 同原则是盐溶液浓度由高到低，而温度则由低到高。
❖ 注意事项： 漂洗过程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作 Prepared on 24 November 2020
原位杂交实验原理与方法
一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、
35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记
原位杂交技术名词解释
原位杂交技术名词解释
「原位杂交技术」
原位杂交技术是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall 等(1969)首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。
原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)
原位杂交介绍与步骤
原位杂交介绍与步骤
原位杂交
组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求
1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。
2. 固定目的是：
（1）保持细胞结构；
（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；
（3）使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：
最新免疫组化与原位杂交
三）包埋和切片（embedding and section）
1.石蜡切片基本步骤：
1）逐级乙醇溶液脱水：使组织脱水，便于二甲苯（xylene）介入 的过程。时间的长短取决于组织块的大小及结构。置80%以上的 乙醇溶液时间过长，会使组织变硬变脆，应当避免。 70% 80% 90% 100%I 100%II 100%III
四）预防脱片的措施：
1. 载玻片的处理： 重铬酸钾（bichromicum Kalium）浓硫酸（concentrated sulfuric acid）清洁液浸泡24小时 充分流水冲洗 去离子 水冲洗2遍 烘干
2.粘附剂的使用： ① 2%3氨基乙氧基甲硅烷（3-amino propyltriethoxy silane,
7.天然抗体 接受免疫的动物在自然过程中产生的对某些动物组织或血清成分 的抗体。 用相对应的动物血清或组织成分吸收, 或尽可能提高抗体稀释度。
8.杂质抗体 由于免疫原不纯，混有某些组织成分免疫动物所产生的抗体。 尽可能提高抗体稀释度。
9.自发荧光 标本中的某些成分如红细胞、弹性纤维、脂质等有自发荧光。 改用免疫显色方法。
免疫组化与原位杂交
免疫组织化学
前提条件：所使用的抗体必须能用于免疫组化。
一、基本原理 ：
利用 抗体（antibody）与 相应抗原（antigen）的特 异性结合, 通过与抗体连接 的酶反应或荧光染料显示 抗原所在的位置。
病理学实验技术考题汇总
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◆填空素材
1)组织切片的主要程序：取材、固定，脱水，透明、浸透，包埋、切片，贴片、染色，浸洗，脱水，透
明，封固
2)常用的固定液：1：单纯固定液：乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸；2：
混合固定剂有：Bouin液、Zenker液、A-F液、Carnoy液、Zamboni’s液、PLP液
3)常用的脱水剂：1：非石腊溶剂的脱水剂：如乙醇和丙酮，其组织在脱水后必须再经二甲苯透明才可
浸腊。2：脱水兼石腊溶剂的脱水剂：如正丁醇和二氧陆环等，组织在
脱水后即可直接透腊，不必经过中间溶剂如二甲苯之类的试剂。
4)常用酶组织（细胞）化学方法常用酶：酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、三磷酸腺苷酶、乙酰胆碱酯酶、细
胞色素氧化酶、一氧化氮合酶
5)酶组织（细胞）化学常用的显色液：DAB（Diaminobenzidine；3，3-二氨基苯联胺）显色液；CN
（4-Cl-1-Naphthol，4-氯-1-萘酚）显色液；AEC（3-amino-9-ethyl-carbozole, 3-氨基-9-乙基卡唑）显色液；TMB显色液；BCIP/NBT显色液
6)免疫酶组织化学标记物的酶：辣根过氧物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、
半乳糖苷酶
7)免疫荧光组织化学的基本方法：直接法、间接法、免疫荧光双标记法
8)免疫酶组织化学的基本方法：直接法、间接法、非标记抗体法
9)亲和免疫组织化学的基本方法：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法）；链霉素和素-过氧化
原位杂交和RNA原位杂交
原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA 或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。
RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。
1 基因组原位杂交技术
基因组原位杂交(Genome in situ hybridization，GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。GISH技术最初应用于动物方面的研究(Pinkel et al.,1986)，在植物上最早应用于小麦杂种和栽培种的鉴定(余舜武等2001；王文奎等2000)。
原位杂交
双链DNA 变性一半所需要的温度称为 DNA的解链温度，又称 熔解温度, Tm)。其大小与G+C含量成正比。
DNA复性
• DNA复性在Leabharlann Baidu当条件下，变性DNA的两条互补链 可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(annealing) 。
• 减色效应: DNA复性时，其溶液OD260降低。
• 标记碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶显色
• 优点：完全、方便、省时，敏感性和质 量控制较好，可检测人基因组DNA的单拷 贝基因，背景反差好。
发展简史
• 1991 年 Couton 建立将非放射性标记技 术 更 新 为 亲 和 复 合 物 标 记 技 术 （ Affinity-complex Labelled Probes ， ACLP）。
DNA/RNA核酸分子杂交
DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA的定性定量分析、酶切图谱分析、基因 突变分析及限制性片段长度多态性分析（RFLP）等。 RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。靶核酸是RNA；电泳时， 凝胶中加入变性剂，防止RNA分子形成二级结构 蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
• 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开 成两条单链的过程。
8第八章重组体的筛选ppt课件
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。
1. 原理 抗原——抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成 “沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理〔溶菌酶、原噬菌体诱发）。
4、直接凝胶电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
实 验 步 骤
A
B
C
M
bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237
5、酶切电泳筛选法 原理 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果〔DNA带数和长度）
第八章 重组体的筛选检测
一、核酸分子的遗传学与物理检测法 二、免疫化学与核酸序列分析法
将目的DNA片段与载体连接形 成重组子，然后通过各种方法将重 组子导入宿主细胞，得到所需要的 带有重组DNA的转化子，这是基因 工程的目的所在。
转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志 的细菌细胞或其他受体细胞。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作
原位杂交实验原理与方法
一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry ；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互
补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA 中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和
32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA 探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
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原位杂交组织化学（ISHH）
原理： 用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸 序列的方法。 特点：杂交在载玻片上的细胞进行。 分类： 根据所用探针和靶核苷酸不同--
DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂交、 RNA-RNA杂交
根据探针标记物是否直接被检测— 直接法、间接法
（4）防止RNA酶的污染
① 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。
② 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温
烘烤——消除RNA酶,亦可用消毒锅。
③ 要破坏RNA酶，最低温度必须在150℃左右。 ④ 消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出 时空气污染。 ⑤ 杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。
二 原位杂交组织化学基本技术
原位杂交的基本方法和应用原则：
① 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，
如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； ② 杂交； ③ 杂交后处理； ④ 显示（visualization）： 放射性自显影显色、非放射性标记显色
（一）原位杂交的基本要求
1 固定 2 玻片和组织切片的处理 3 杂交 4 杂交后处理
固定剂：
多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定剂、 Carnoy’s液 优缺点：
沉淀性固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、 Carnoy’s液
能增加核酸探针的穿透性，但不能最大限度地保存RNA， 且对组织结构有损伤。 戊二醛：能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质 产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。
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6 对照实验和ISHH结果的判断
1 固定
固定剂的应用和选择原则： ① 保持细胞结构； ② 最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平； ③ 使探针易于进入细胞或组织。
DNA：比较稳定，对于DNA的定位来说，固定剂的种类 和浓度并不十分重要。 RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解减少 到最低限度，固定剂的种类、浓度和固定的时间十分 重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。
杂交注意环节
（1）探针的浓度
原则:探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。最佳原 则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合 度为目的。 杂交液的量要适当:
以10～20μl/每张切片为宜。
杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动脱落,过量 的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。
（3）减低背景染色
预杂交（Prehybridization）: 是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交
液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片
浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从 而减低背景染色。
杂交后洗涤: 采用低浓度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，去
除残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。
（2）探针的长度
最佳长度应在50～100个碱基之间。 探针短--- 易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 500个碱基的探针--- 杂交时间约需20h左右。
200～500个碱基的探针--- 可应用.
冷冻切片—— 应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片 也可获得满意效果。
2 玻片和组织切片的处理
（1）玻片的处理
热肥皂刷洗 自来水清洗 清洁液中浸泡24h 清水洗净
烘干
95%酒精中浸泡24h
蒸馏水冲洗
烘干
烘箱温度＞150℃过夜以去除RNA酶
盖玻片硅化处理 锡箔纸包裹无尘存放
（2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探 针长度而定。 常用方法： 稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂 Triton X-100、酒精或 某些消化酶等。 优点: 通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性,ຫໍສະໝຸດ Baidu高杂 交信号. 缺点: 减低RNA的保存,影响组织结构形态.因此，在用量及孵 育时间上应慎为掌握。
多聚甲醛：仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。
多聚甲醛——mRNA的定位
将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻 前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保
存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。
组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸 入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰
固相杂交技术包括：
④ Northern印迹杂交
⑤ 组织原位杂交
（二）原位杂交技术的发展
在近20年飞跃发展的突出特点： ① 由分子遗传学研究提供的探针大量增加； ② 探针生产的可靠性和速率大大发展了； ③ 非放射性标记物的发展使原位杂交技术成为实验室的常 规技术和临床日常应用的诊断技术。 ④ 新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。
3 杂交（Hybridisation）
杂交:核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。
是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。
杂交方式:是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。
加盖片的目的
防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发; 硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑,无气泡,不会影响 组织切片与杂交液的接触; 盖玻片自身重量能与杂交液吸附达到覆盖和防蒸发的作用。
箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结 果。
病理学活检取材—— 福尔马林固定和石蜡包埋，这种标 本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号。
石蜡包埋切片—— 由于与蛋白质交叉连接的增加，影响 核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时， 在包埋的过程中可减低mRNA的含量。
一 原位杂交的由来与发展
（一）核酸分子杂交技术
按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种 液相杂交：参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 液相分子杂交技术包括： ① 吸附杂交 ② 发光液相杂交 ③ 液相夹心杂交 ④ 复性速率液相分子杂交
固相杂交： 是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常 用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微 孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 ① 菌落原位杂交 ② 斑点杂交法 ③ Southern印迹杂交