高级生化 第二章 基因研究技术2(测序)

主要用于重复序 列少、相对简单 的原核生物基因 组
5）基于物理图谱的全基因组测序（简称作图法）
1）利用RFLP、SSR、RAPD等分子标记构建物种染色体 物理图谱
2）用限制性内切酶将基因组DNA切割长度为0.1Mb－ 1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上，构建基因 文库（YAC库BAC库） 3）从文库中挑取单克隆直接测序或者运用鸟枪法构建亚 克隆，在分别测定单个亚克隆的序列 4）装配、连接成连续的DNA分子。 又称“克隆重叠群法（clone contig）”、“clone-byclone method”
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一、成熟的第一代DNA测序技术
一）化学裂解法(Maxam-Gilbert，1977)
基本原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的 DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一 组具有各种不同长度的DNA链的反应混和物，经 凝胶电泳按大小分离和放射自显影，便可根据X 线片底板上显示相应带谱，直接读出待测DNA片 段的核苷酸顺序。
杂交测序技术
焦磷酸测序（Pyrosequencing, Roche/454）
合成测序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa） 连接测序（Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD）
一）杂交测序技术
原理
将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上， 每个点播 的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置。待检测的 DNA分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定 位置发出信号，然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进 行对比组装拼接成完全的DNA顺序。 优点：检测速度快，成本低。 缺点：误差较大，不能重复测定。
A+G pH2.0 甲酸可使嘌呤环的N原子化,并因此消弱腺嘌呤 和鸟嘌呤的糖苷键，使得哌啶很容易断开糖苷键从而 导致脱嘌呤
C+T 肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易被哌啶 除去
C 1.5mol/L NaCl存在时,可用肼只作用于胞嘧啶环，使 得该处的糖苷键易被哌啶断开从而脱去胞嘧啶
1M 的 哌 啶 加 热 90 度
几种不同生物基因组的测序
1) 大肠杆菌基因组测序----作图法 2) 流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法
3) 果蝇基因组测序---鸟枪法
4) 人类基因组测序---作图法和鸟枪法
4) 拟南芥基因组测序—作图法
5) 水稻基因组测序---作图法和鸟枪法
二、开始商业化的第二代DNA测序技术 ——基于芯片的测序技术
3、DNA序列测定的策略
1）短片段DNA（<1kb）可采用单向测序或双向 测序法
2）较长片段DNA 可采用引物延伸法（ Primer walking）
引物延伸法是从目的片段的一端开始，利用载体上的序列为 依据，设计第一次反应的反应引物进行测序，然后依次根据前 一次测序结果，设计下一次反应引物，递进测序，直至完成。 引物依次推进法需要多次设计和合成引物，比较繁琐。
这一方法是由剑桥的医学研究委员会实验室率推行的，曾经成 功地用于测定人线粒体DNA（Anderson 等，1981）、λ噬菌体 DNA（Sanger等，1982）等序列。
该方法也称作“随机法（random approach）”、 “霰弹法
鸟枪法的优缺点 优点：不需要高 密度的图谱； 速 度快、简单、成 本低 缺点：拼接组装 困难，尤其在重 复序列多的区域
主要技术改进
1、用不同的荧光色彩标记ddNTP，如ddATP标记红色荧光、 ddCTP标记蓝色荧光、 ddGTP标记黄色荧光、ddTTP标记 绿色荧光。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，因此 终止的末端便于观察。 2、测序反应由原来的4管分 别反应改为1管混合反应。
3、用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳，电泳由4泳道 简化 为由1个泳道同时判读4种碱基。这种电泳装置有96个泳道， 每次可同时进行96次测序。节省时间，加快测序进程。
3）制备DNA磁珠：单链DNA文库被固定在特 别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了 一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被 扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就 形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反 应器。 4）乳液PCR扩增：每个独特的片段在自己的 微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞 争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的 扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后 产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合 物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。
“双脱氧末端 终止”的含义
技术路线与要求
制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火
↓
加入DNA多聚酶、 dNTP、少量ddNTP ↓ PCR反应 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
三）自动化测序
基本原理：DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数 据获取、碱基阅读等步骤自动化。与链终止法测序原理相同
技术路线
将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记, 以便显示DNA条带
↓
分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解 DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序
Maxam-Gilbert 法所用的化学技术
碱基 G 特异修饰方法 Ph8.0,用硫酸二甲酯（DMS）对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对哌啶有特殊敏感性
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二）双脱氧终止法(酶法)
（一）原理(单链)
DNA链中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯键相连接，合成 DNA所用的底物是2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger 双 脱 氧 链 终 止 法 中 被 掺 入 了 2` ， 3`- 双 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 (ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3`- OH， 不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯键，DNA合 成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则新生 链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，则新生链的末端为T、C或G，根据这个原理， Sanger与1977年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因 此而获得了1980 获诺贝尔化学奖。
4、利用共聚焦荧光扫 描显微镜，可将核苷 酸的荧光标记信号放 大，并由计算机读取 碱基顺序。
每轮实验不到2小时，1天可完成近千次反应
DNA全自动测序
3730 全自动测序仪
5ˊ
四）第一代测序技术的缺点
测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所 测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。 测序反应费时费力——科学家们完成第一个人类 基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美 元的费用。 测序准确度不高——DNA聚合酶造成的碱基错配， DNA序列判读错误
利用基因芯片进行杂交测序的原理
杂交测序举例
目标序列
CGTGACT
互补序列 GCACTGA 探针 4碱基 杂交结果 GCAC CACT ACTG CTGA 重构目标序列的互补序列GCACTGA
目标序列 CGTGACT 。
二）Solexa测序技术
Illumina 公 司 发 明 。 2008 年 ， 《Nature》 杂志上一连出现三 个人类基因组图谱： 炎黄一号-第一个亚 洲人图谱；第一个 癌症病人图谱；第 一个非洲人图谱。 它 们 全 是 用 Illumina 公司依据Solexa测序 技术完成的。
测序基于PCR反应，需要引物并且有些结够复杂的 难于进行PCR反应的片段不能测序。
三）DNA序列测定的策略
1、sanger测序的DNA模板
1）一般用PCR产物或者连接到载体上的目标DNA作为 测序模板 2）Sanger测序法检测的是单链DNA片段
2、测序引物
1）特异引物：即根据目标DNA序列设计的引物 2）通用引物：即根据载体序列设计的引物 3）测序引物只能用单引物
测序原理 5）芯片制备：经乳液PCR法扩增后 携带有大量模板的磁珠被放置到芯 片(PTP)上的微孔中。PTP孔的直径 (29um)只能容纳一个磁珠(20um)。 然后将PTP板放置在GS FLX测序仪 中，测序开始。
6）在微孔中加入反应液：酶混合物 （ 包 括 DNA Polymerase 、 ATP Sulfurylase 、 Luciferase 和 Apyrase ）和底物混合物（包括APS(腺苷酰 硫酸)和Luciferin(荧光素)）。
第二章 基因研究技术
第二节 基因组测序技术
生 命 奥 秘 的 四 字 天 书
…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA
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CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC
⑤需要样品量少。Genome Analyzer系统需要的样 品量低至100ng，这是很多研究人员所考虑的因 素。
⑥可以进行Pair-end( PE) 双向测序，PE 文库插入 片段大小范围可由150 bp 到10 kb。
三） GS FLX测序技术
454公司发明。早在2005年底，454公司推出了革 命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序 系统——Genome Sequencer 20 System，被《 Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成 边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。 之后，他们又推出了性能更优的第二代基因组测 序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。
⑤
⑥
⑦序列拼接
4）全基因组鸟枪法测序
策略 （1）将基因组DNA片段随机断裂成适于序列测定的小片段 （300-600bp），断裂方法有超声波处理、核酸酶I法和限制酶 切割法。 （2）将小片段连接入载体（入T-easy克隆载体），转化入大肠 杆菌构建基因文库 （3）挑取单克隆菌、提取质粒，用质粒做模板测序 （4）根据测序结果构建重叠群，获得基因组完整序列
对于重复序列较多的目的 DNA ，由于引物的非特异性结合概 率高，所以该方法不适合于测定含有多重复序列的 DNA 片段。
3）大片段DNA可采用嵌套缺失法（nested deletion, Erase-a-base）测序
① ② ③ ④
将大片段克隆 到测序载体
核酸酶III：从双 链DNA的3’OH上逐 一去除单核苷酸， 不降解单链DNA和 3’突出的双链DNA （37C，250核苷 酸/min） 核酸酶S1：降解 单链DNA或者RNA， 产生5’磷酸的单核 苷酸或者寡核苷酸
7）测序PCR：放置在四个单独的试 剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C 、G的顺序依次循环进入PTP板孔 内，每次只进入一种碱基。如果发 生碱基配对，就会释放一个焦磷酸 。同时反应体系中剩余的dNTP在 腺苷二磷酸酶的作用下发生降解。 8）信号检测：释放的焦磷酸经过一 些列反应最终释放出光信号，此光 信号实时被高灵敏度CCD捕获到。 有一个碱基和测序模板进行配对， 就会捕获到一分子的光信号；由此 一一对应，就可以准确、快速地确 定待测模板的碱基序列。 A：液体试剂供应装置 B：反应池芯片 C：信号检测系统
GS FLX测序技术原理
1）样品片段化： GS FLX系统支 持各种不同来源的样品，包括基因 组DNA、PCR产物、 BAC、cDNA 、小分子RNA等等。大的样品例如 基 因 组 DNA 或 者 BAC 等 被 打 断 成 300－800 bp的片段；对于小分子的 非编码RNA或者PCR扩增产物，这 一步则不需要。 2）文库制备：借助一系列标准的 分子生物学技术，将A和B接头（3’ 和5’端具有特异性）连接到DNA片 段上。接头也将用于后续的纯化， 扩增和测序步骤。具有A、B接头的 单链DNA片段组成了样品文库。
Incorporation
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Cleavage
Solexa测序技术的特点
①通量高。目前一台机器在两周内最高可产出360G 的数据; ②准确率高。≥98. 5% ，同时也有效地解决了多聚 重复序列的读取问题; ③成本低。低于传统Sanger 测序技术成本的1% ; ④DNA 序列的读取长度不断增加，当前单条序列读 长可达到150 bp。