灵芝孢子粉中孢子油提取及生物活性的研究

灵芝孢子粉中孢子油提取及生物活性的研究
摘要：采用超临界CO2萃取法提取灵芝孢子油，通过正交试验确定最佳萃取条件是：萃取压力、温度、时间分别为25 MPa、45 ℃、60 min，CO2流量25 L/h，在此条件下出油率可达3.96%。

灵芝孢子油具有清除NaNO2和DPPH（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）自由基的作用，并且其清除作用随孢子油用量的增加而增加。

关键词：超临界CO2;孢子油;清除NaNO2;DPPH自由基
灵芝是一种著名的药用真菌，千百年来，一直被民间视为仙草［1］。

灵芝孢子是灵芝的有性生殖细胞担孢子。

灵芝孢子粉中含有多糖、三萜类等特殊物质，具有抑制肿瘤细胞生长、抗癌、免疫、保肝、降血糖、抗缺氧等作用和功能［2~14］。

灵芝孢子油是从灵芝孢子粉中萃取出的油脂质物质,集中了灵芝孢子中的诸多有效成分,如三萜类灵芝酸、不饱和脂肪酸和微量元素等多种活性成分［15］。

本实验用超临界CO2流体法对破壁孢子粉中的孢子油进行提取，并测定了孢子油对NaNO2和DPPH自由基的清除率，旨在为灵芝孢子油的开发提供理论依据。

1 材料与方法
1.1材料及主要试剂
破壁中华赤芝孢子粉由山西农业大学食用菌中心提供。

CO2(纯度>99.9%)购于太谷县金桥气体有限公司。

1，1-二苯基-2-苦基肼基游离自由基（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）由Sigma公司提供。

亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸α-萘胺等试剂均为分析纯。

1.2仪器设备
HA121-50-01超临界萃取装置（江苏南通华安超临界萃取有限公司）；2100型分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.3方法
1.3.1出油率的计算
出油率=萃取油脂重量/原料重量×100%
1.3.2超临界CO2萃取灵芝孢子油条件的优化
利用L 9（3.4）正交试验对最佳萃取条件进行研究，各因素和水平见表1。

20 g孢子粉置于1 L萃取釜中，在分离I压力8 MPa、温度45 ℃，分离II压力6 MPa的条件下，按正交试验设计，调整萃取压力、温度、时间和CO2流量。

表1 正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of the orthogonal test
水平LevelA萃取压力Pressure（Mpa）B萃取温度Temperature（℃）CCO2流量CO2 flux（L/h）D萃取时间Time（min）
120351560
225402070
330452580
冯翠萍，等：灵芝孢子粉中孢子油提取及生物活性的研究
1.3.3NaNO2清除率的测定［16］
将5.0 mL 0.5 mol/L的柠檬酸钠-盐酸缓冲液（pH 3.0）置于10 mL容量瓶中，加入1 mL 0.01%的NaNO2溶液，再分别加入0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL萃取的孢子油样品，用蒸馏水定容至刻度（孢子油在反应体系中浓度分别为1%、2%、3%、4%和5%），37 ℃下反应1 h，取1 mL反应液，加入0.4%的对氨基苯磺酸溶液2 mL，0.2%盐酸α-萘胺1 mL，摇匀放置15 min后用分光光度计在540 nm 处测吸光度值，用下式计算清除率。

清除率=A 0-A xA 0×100%
A 0：不加提取油的空白试验的吸光度值
A X：不同用量提取油反应液的吸光度值
1.3.4DPPH自由基清除率的测定［17］
2 mL 125 μmol/L的DPPH无水甲醇溶液，分别加入0.05、0.10、0.20、0.30和0.40 mL萃取的孢子油样品，加无水甲醇至4 mL（孢子油在反应体系中浓度分别为1.25%、2.50 %、5.00%、7.50%和10.00%），震荡后在黑暗中放置30 min，以无水甲醇为空白在517 nm测定其吸光度A，同时测2 mLDPPH溶液和2 mL
无水甲醇混合液的吸光值A 0，并测孢子油样品加无水甲醇混合液的吸光值
A b，按下面公式计算清除率。

清除率=A 0-(A-A b)A 0×100%
2 结果与分析
2.1超临界CO2流体萃取灵芝孢子油工艺条件的优化
由表2可见最佳萃取工艺为：A 2B 3C 3D 1，即萃取压力25 MPa、
萃取温度45 ℃、CO2流量为25 L/h，时间60 min。

经验证试验，在此条件下，出油率为3.96%，确定为最佳工艺条件。

由极差值R可知，各因素对出油率的影响程度由大到小依次为萃取压力，萃取温度，萃取时间，CO2流量。

2.2孢子油对NaNO2的清除作用
图1是孢子油对NaNO2清除率的测定结果。

图1表明，NaNO2的清除率随着孢子油用
图1 孢子油对NaNO2的清除率
Fig.1 NaNO2 scavenging activity of spore oil
量的增加而升高。

当孢子油用量从1%增加到5%时，清除率从23.5％增加到70.1%。

2.3孢子油对DPPH自由基的清除作用
图2 孢子油对DPPH自由基的清除率
Fig.2 DPPH scavenging activity of spore oil
孢子油对DPPH自由基的清除能力见图2。

DPPH自由基的清除率随着孢子油用量的增加而升高，当孢子油用量从1.25%增加到10.00%时，清除率从20.2%增加到40.5%。

3 讨论
正交试验结果表明，超临界CO2流体萃取灵芝孢子油的最佳条件是：萃取压力、温度、时间分别为25 MPa、45 ℃、60 min，CO2流量25 L/h，在此条件
下出油率可达3.96%，提取的孢子油在常温下为金黄色半透明液体。

本实验表明，灵芝孢子油具有清除NaNO2的作用，这可能与灵芝孢子油中的一些活性成分有关，具体的机理有待进一步研究。

胡居吾等从灵芝孢子油中检出亚油酸、油酸、棕榈酸、花生四烯酸、棕榈油酸和EPA等15 种脂肪酸，不饱和脂肪酸是主要的成分, 占总量的61.15% ［18］，因此，灵芝孢子油清除DPPH 自由基的活性可能是不饱和脂肪酸作用的结果。

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Ganoderma lucidum Spore Oil: Optimization of Extraction Conditions and Biological Activity
FENG Cuiping.1,CHENG Hongyan.2,TANG Bing.1,
ZHANG Jie.1,CHANG Mingchang.1*
.1 College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China;
.2 College of Resources and Environment, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China
Abstract:Orthogonal testing was used to optimize the conditions for extracting oil from Ganoderma lucidum spores using supercritical CO2 fluid technology. Oil yields (3.96%) were highest under the following conditions: 25 Mpa pressure, 45 ℃extraction temperature, 60 min extraction time and a CO2 flux of 25 L/h. Extracted spore oil was active in scavenging NaNO2 and DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl): NaNO2 scavenging activity increased from 23.5% to 70.1% when the concentration of spore oil was increased from 1% to 5%, and DPPH scavenging activity increased from 20.2% to 40.5% when concentration of spore oil was increased from 1.25% to 10%.
Key words:supercritical CO2;spore oil;NaNO2 scavenging;DPPH radical
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。