中科院生化分子

大肠杆菌转录起始过程需要RNA 聚合酶全酶，其中__σ_____因子辨认起始点，而β 亚基和___β′____亚基组成了催化中心。

转录的终止反映在____终止子___。

所有信号肽的位置都在新生肽的N 端。

（）错【解析】信号肽是指存在于蛋白多肽链上的在起始密码子之后能启动蛋白质运转的一段多肽序列，该序列常位于蛋白质的氨基末端，但也可以位于中部或其他地方。

遗传密码的特性和在基因传递中的意义，以及遗传密码是如何被破译的。

（1）遗传密码的特性及其在基因传递中的意义①遗传密码是三联子密码1 个密码子由3 个连续的核苷酸组成，特异性地编码1 个氨基酸。

②密码子的连续性遗传密码以5′→3′方向、非重复、无标点的方式编码在核酸分子上。

阅读mRNA 时以密码子为单位，连续阅读，密码间无间断也没有重叠，AUG 为甲硫氨酸兼起始密码子。

UAA、UAG 和UGA 为终止密码子。

因此要正确阅读密码，必须从起始密码子开始，按一定的读码框架连续读下去，直至遇到终止密码子为止。

若插入或删除一个核苷酸，就会使以后的读码框发生错位，称为移码突变。

③密码子的简并性一种氨基酸有两种或两种以上的密码子，对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子。

除甲硫氨酸（AUG）和色氨酸（UGG）只有一个密码子外，其他氨基酸都有一个以上的密码子。

密码的简并性可以减少有害突变，在物种的稳定性上起一定作用，还可以保证翻译的速率。

④密码子与反密码子的相互作用在密码子与反密码子的配对中，前两对碱基严格遵守碱基配对原则，但第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA 可以识别 1 个以上的密码子。

tRNA 识别密码子的个数由反密码子的第一个碱基的性质决定。

a．反密码子第一位碱基为A 或C 时，只能识别1 种密码，分别为U、G；b．反密码子第一位碱基为G 或U 者可以识别2 种密码，分别为U 和C，A 和G；c．反密码子第一位碱基为I（黄嘌呤）时可识别3 种密码（U、C、A）。

如果有几个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的tRNA。

⑤密码的通用性与特殊性a．通用性：所有生物几乎都使用同一套密码子。

密码子的通用性说明生物有共同的起源，有助于生物的进化的研究。

b．特殊性：线粒体及少数生物基因组的密码子有变异，人线粒体中UGA 编码Trp，而不是终止密码子；AUA编码Met，而不是Ile；AGA 和AGC 是终止密码子，而不编码Arg。

⑥密码的防错系统密码的编排方式使得密码子中一个碱基被置换，其结果常常或是编码相同氨基酸或是以理化性质最接近的氨基酸取代。

从而使基因突变造成的危害降至最低程度。

即密码的编排具有防错功能，密码表是一个故障-安全系统，是在进化过程中获得的最佳选择质粒的复制类型有两种：受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制的称为_严紧型质粒_______，不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制称为_松弛型质粒_______。

感受态细胞（competent cell）感受态细胞是指受体细胞经过一些特殊方法（如CaCl2 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA 的载体分子通过的细胞。

将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，可以检验重组载体是否构建成功。

感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

凝胶阻滞试验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）凝胶阻滞试验是一种体外分析DNA 与蛋白质相互作用的技术，基本原理是蛋白质与DNA 结合后增加相对分子质量，没有结合蛋白的DNA 片段跑得快，结合蛋白的DNA 跑得慢。

凝胶阻滞试验可以用于检测DNA结合蛋白、RNA 结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质。

染色质免疫共沉淀技术染色质免疫沉淀反应是指研究体内蛋白质与DNA 相互作用的一种技术。

它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA 结合的状况。

操作步骤为：①固定蛋白质-DNA 复合物；②将复合物粉碎为染色质小片段；③通过抗体抗原的特异性识别，沉淀复合体；④富集与目的蛋白相结合的DNA 片段；⑤对目的片段的纯化及PCR 检测。

应用：①检测活细胞内转录调控因子与DNA 的动态作用；②研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

设计PCR 引物的主要原则是什么？（1）引物长度应大于15 个核苷酸，一般为20~24 个核苷酸。

（2）引物与靶序列间的Tm 值不应过低（一般不低于55℃）。

（3）引物不应有发卡结构，即不能有 4 bp 以上的回文序列。

（4）两引物间不应有 4 bp 以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补碱基；（5）引物中碱基的分布尽可能均匀，GC 含量接近50%。

简述免疫共沉淀的概念，原理和优缺点。

（1）免疫共沉淀的概念免疫共沉淀是指以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

（2）免疫共沉淀的原理如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用靶蛋白的抗体对靶蛋白进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。

（3）免疫共沉淀的优缺点①优点a．相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；b．蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；c．可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

②缺点a．可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用；b．两种蛋白质的结合可能不是直接结合，可能有第三者在中间起桥梁作用；c．必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性；d．实验操作步骤较多，需要高质量的抗体，免疫沉淀体系需要严格的控制指标。

研究蛋白质与DNA相互作用的方法主要有哪些？详述其中一种的原理和步骤。

（1）研究蛋白质与DNA 相互作用的方法凝胶阻滞（EMSA）实验、DNaseⅠ足迹法、酵母单杂交技术、染色质免疫共沉淀（CHIP）技术、甲基化干扰试验和体内足迹试验等。

（2）酵母单杂交系统酵母单杂交系统是用于研究DNA-蛋白质之间的相互作用的方法，可通过筛选DNA 文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。

①原理真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA 特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。

将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin 下游，然后将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin 启动子，使报告基因得到表达。

②步骤a．构建报道子载体。

将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最基本启动子的上游，把报告基因连接到Pmin 下游。

b．筛选含有报道子载体的酵母细胞。

将构建好的报道子载体转化酵母细胞并筛选合适的3-AT 浓度。

c．构建cDNA 表达文库。

将样品经过一定处理之后，提取mRNA，经过反转录获得cDNA。

d．筛选cDNA 融合的表达文库。

将报道子、cDNA 和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的SD 培养基上筛选阳性克隆。

e．对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆。

f．对获得的阳性克隆进行测序。

在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白；在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白。

简述乳糖操纵子正调控的作用机制。

乳糖操纵子（lac 操纵子）的正调控即cAMP-CRP 的调节，作用机制如下：（1）ATP 在腺苷酸环化酶的作用下生成cAMP。

（2）在大肠杆菌中，cAMP 的浓度受到葡萄糖代谢的调节，细菌在缺乏碳源或只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源中，细胞内cAMP 浓度高；在含葡萄糖的环境中，cAMP 的浓度低。

（3）在lac 操纵子启动子上游有代谢物激活蛋白（CAP）结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP 浓度升高，与环腺苷酸受体蛋白（CRP）结合，使CRP 发生变构，形成cAMP-CRP 复合物，cAMP-CRP 复合物结合于lac 操纵子启动序列中的CAP 位点，帮助RNA 聚合酶结合到启动子区域，激活lac mRNA 的转录，对lac 操纵子实行正调控，促进合成分解乳糖的三种酶大肠杆菌乳糖操纵子的主要结构和阻遏蛋白的作用机制是什么？（1）大肠杆菌乳糖操纵子的主要结构①三个结构基因：lacZ，lacY 和lacA，分别编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透过酶和β-半乳糖苷乙酰基转移酶。

②操纵基因（O）：DNA 上的一小段序列，是阻遏物的结合位点。

③阻遏基因（I）：编码阻遏蛋白。

④启动子（P）：可以与RNA 聚合酶结合。

（2）阻遏蛋白的作用机制①阻遏蛋白由调节基因I 编码。

当细胞中无诱导物（乳糖）存在时，阻遏蛋白与lac 操纵基因（O）特异性结合，阻止RNA 聚合酶与lac 操纵子启动子区的结合，抑制lac mRNA 的转录。

②当细胞中有乳糖存在时，真正的诱导物异构乳糖（乳糖的异构体）与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白构象发生改变，不能与O 特异性结合，lac 操纵子的转录起始区暴露并与RNA 聚合酶结合，启动lac mRNA 转录。

③乳糖耗尽，诱导物异构乳糖减少，失去诱导物的阻遏蛋白会重新结合在lac 操纵基因（O）上，阻止基因转录鸟枪法是一种检测单核苷酸多态性（SNP）的常用方法。

【答案】错【解析】鸟枪法是将目的DNA 随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。

SNP 是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。

SNP 不再以DNA 片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记。

简述全基因组鸟枪测序（whole genome shotgun sequencing）的基本步骤答：全基因组鸟枪测序法是在获得一定的遗传及物理图谱信息的基础上，将基因组DNA 分解成2kb 左右的数百万个DNA 小片段进行随机测序，辅以一定数量的10kb 的克隆和BAC 克隆的末端测序，利用超级计算机进行整合及序列组装。

该方法是一种广泛使用的DNA 测序的方法，比传统的测序法快速，但精确度较差。

其基本步骤为：（1）利用非特异性DNA酶随机切断DNA，建立高度随机、插入片段大小为1～2kb 左右的基因组文库。

克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组 5 倍以上。

（2）高效、大规模的末端测序。

对文库中每一个克隆进行两端测序。

（3）序列集合。