球虫DNA及RNA提取方法汇总

粪便中卵囊的收集和纯化
简介
球虫感染鸡后，在宿主体内经裂殖生殖、配子生殖后形成带有卵囊壁的未孢子化卵囊，随粪便排出体外。

粪便中的卵囊由于密度小于饱和盐水，因而可以被后者漂浮起来；而卵囊的密度又大于稀释的盐水溶液，故而可以从稀释的盐水中沉淀下来。

根据此原理，利用饱和盐水漂浮粪便中的卵囊，然后将含卵囊的饱和盐水用水稀释后离心沉淀，即可将卵囊从粪便中分离和纯化。

材料
塑料盆若干个（视所收集的粪便量而定）
80目（60目、100目也可）和160目（或者180目）金属筛各一个
搅拌用塑胶软铲一个
不锈钢铲子一个
1L塑料烧杯1-3个，100ml、500 ml塑料烧杯各一个
离心罐（低速大容量离心机因平衡需要，需在任何离心时将6个罐平衡后全部放到支架上）
报纸若干张
尖头吸管
玻璃棒（粗）或药品勺（不锈钢制）
吹气软管
（以上物品需在烤箱中80℃烘烤2h后使用）
秤（婴儿秤）一台
电子天平（普通天平也可）一台
吹气设备
饱和盐水（自来水加入过量食盐煮沸，冷却后分装至塑料桶或500 ml瓶中，注意防冬天温度过低造成盐水不饱和）
2.5% 重铬酸钾溶液
步骤
1.用塑料盆收集接种后6.5-8天的粪便（本时间选取是针对柔嫩艾美耳球虫的，其他虫种请查阅文献，确定收集时间），搅拌均匀（若鸡只数目少，应在6.5天时在粪便收集盘中洒一些重铬酸钾溶液以保持粪便湿润），称重；
2.称取2g粪便至塑料小烧杯中，加入60ml饱和盐水，搅拌均匀，充入改良麦克马氏板记数室，静止3min后在显微镜下计数；计算粪便的OPG（计数所的读数×200），估算粪便中卵囊总数；
3.将粪便中加入5-10倍体积的自来水，搅拌均匀，然后用80目筛子进行过滤；此过程中需用塑胶软铲不停搅动，使大部分的水溶液滤过筛网，收集至一塑料盆；滤后的粪渣置于另一塑料盆；
4.粪渣再加入自来水，如步骤3过滤；此过程重复2次（针对粪便量少者，可以增加一次以提高卵囊收集率），最后弃去粪渣；
5.将所有的滤过液用160目的筛子进行二次过滤，滤液收集至塑料盆中；
6.滤液静止3h或更长（不宜过夜，长时间浸泡对卵囊活力有影响；需过夜再继续操作者，应在滤液中添加重铬酸钾，至浓度在1-2.5%），然后快速倾去大部分上清（动作既快又稳，小心不得将沉淀倒掉）；
7.将所得到的混悬液离心（3000rpm，8-10min或3600rpm，5min；以下离心均采用此设置），收集所有沉淀；
8.用玻棒搅匀沉淀，加入少许饱和盐水，搅匀，再次添加并搅拌，至形成均匀的混悬液（一般加入的饱和盐水的体积为粪便沉淀的5倍，采用步骤10（2）时可以将加至离心罐容积上限）；
9.离心漂浮卵囊；
（后续的操作步骤10有两种，粪便沉淀量少者可采用第一种10（1），量大者可采取第二种10（2））
10.（1）所得的含卵囊上清倒入一个大烧杯中，重复步骤8，离心后同样将上清收集至烧杯；并再重复一次，合并3次所得上清；将上清均匀分配至离心罐中，加入至少3倍体积的自来水，然后离心沉淀卵囊；
10. (2) 用尖头吸管吸取上清表层漂浮的卵囊，所吸液体收集于一个烧杯中；
至表层大部分卵囊漂浮物被吸走后，将剩余上清转移至另一大烧杯；沉淀搅匀后，倒回转移的饱和盐水，少量多次并搅拌，同步骤8，可补加盐水以弥补上清吸取转移走的盐水；如此再重复2次，合并3次所吸取的表层卵囊溶液，加入至少3倍体积的自来水，然后离心沉淀卵囊；
11.所得卵囊沉淀因含有大量粪便等杂质，需再次用饱和盐水离心漂浮一次（若卵囊数量少于1千万，此步骤推荐用50ml离心管进行操作，以免丢失过多）；随后离心沉淀；
12.两次漂浮沉淀后得到的卵囊沉淀用重铬酸钾溶液重悬，转移至小锥形瓶或盐水瓶中（重铬酸钾的体积根据卵囊的数量决定，每毫升所含卵囊不得超过100万，但可以多加）；
13.接好吹气装置，置于28℃温箱或自制孵化箱中通气孢子化，时间为48小时（注意24h时添加水，补偿吹气孵化所蒸发的水）；孢子化完毕，将卵囊做好标记保存于4℃；
14.做好善后事宜，如操作台和离心机的清洁、所用物品的清洁与归位、鸡只的剖杀与笼具的清洗等。

（刘贤勇整理）
球虫基因组从田间样品中的提取
1、试剂
卵囊裂解缓冲液：20 mM（毫摩每升） Tris-HCI, pH8.0；100 mM EDTA and 1% SDS
0.5M EDTA（pH8.0）：在 800ml 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节溶液 pH 至 8.0（约需 20gNaOH 颗粒），然后定容至 1L，高压灭菌。

1M Tris-HCl：将 121.1g Tris 碱溶于 800ml 蒸馏水中，用盐酸调 pH 值
至 8.0（约需 42 ml浓盐酸），定容至 1000ml，高压灭菌。

10% SDS：量取电泳级 SDS 100g（戴口罩操作）溶于 900ml 蒸馏水中，加热至 68℃助溶，用HCl 调 pH 值至 7.2，加水定容至 1000ml。

蛋白酶K溶液（20mM）：德国默克公司
80％异丙醇溶液
2、操作步骤
1、取106个已纯化卵囊，在1.5ml的离心管（需用进口管）中4000转离心
5分钟，弃上清。

2、加入等体积425-600μm玻璃珠，置于旋涡震荡器上，3000rpm/min震荡，
直到90％以上的卵囊破碎（~15min）。

3、取360µl卵囊裂解缓冲液和40µl蛋白酶K溶液加入离心管中，置37℃摇
床中孵化48小时。

4、12000rpm/min离心1min，取上清入新管。

5、加入1ml清洗树脂（按50-500µl悬液/1ml清洗树脂的比例），旋涡震荡
混匀
6、取一支2ml或者5ml的一次性注射器，去针头，拔出注射器内芯推液筒，
接上Wiard TM微型柱，将DNA-树脂混合液全部转移到注射器中。

7、用注射器内芯推液筒，慢慢的将DNA-树脂混合液推过微型柱，排出废液。

8、将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在
微型柱上，向注射器内加入2ml柱洗溶液（80％的异丙醇），用注射器
内芯推液筒慢慢将洗柱液通过微型柱，以洗涤DNA-树脂样品。

9、拔去注射器，将微型柱套在洁净的1.5ml离心管上，10000rpm离心20sec，
以除去残留的异丙醇。

10、将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上，在柱中央加入30-50µl预
热（60-70℃）的超纯水或1×TE缓冲液，静置1min，10000rpm离心20sec。

离心管中的液体即为DNA溶液。

11、用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定球虫基因组DNA提取结果。

（孙希萌整理）大量球虫卵囊基因组DNA的提取（CTAB法）
试剂
2x CTAB buffer:
药品或储液用终浓
1M Tris-HCl（pH 7.5 or 8.0）10 100mM
CTAB 2g 2%
5M NaCl 28m 1.4M
0.5 M EDTA （pH7.5 or 8.0） 4 20mM
亚硫酸氢钠 1 1%
O to 100 ml
ddH
2
注：配制时，现将CTAB溶于水，再加入其它药品和试剂RNase：储液：10mg/ml（配制方法：取0.5g RNase A置于50ml塑料离心管中；加入40ml灭菌水，充分混合溶解之后定容50ml；100℃煮沸15min,缓慢冷却至室温，1ml/管小份分装后，置于－20℃保存）；使用时：每1ml ddH
O 中加
2
入8ul RNAse储液；
酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）；
氯仿:异戊醇（24:1）；
异丙醇；
70%乙醇。

仪器设备
高速冷冻离心机；
EP管（酚:氯仿:异戊醇和氯仿:异戊醇抽提时，一定要用聚丙烯管，不可用聚碳酸酯管）；
玻璃研磨器（使用前煮沸5min以上或高压灭菌）；
实验操作步骤
1.卵囊离心，洗去储存液，并用NaClO消化（一定要在提取之前消化，以除
去其它微生物的基因组污染）；
2.用无菌蒸馏水按体积比1:1重悬卵囊，加入研磨器中；
3.置冰上研磨，直至卵囊释出内容物；
4.按体积比1:1的用量，用2x CTAB溶液洗下所有研磨物，转移至EP管，每管装600ul；
5.置60℃水浴，孵育30min；
6.加入600ul酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡10s，14000rpm离心3min；
7.取上清入新管（剩有有机层和杂质的管，要扣紧管盖后再丢弃，以防污染环境）；
注：若杂蛋白较多，可再重复步骤6和步骤7 1-2次。

8.加入600ul氯仿:异戊醇（24:1），震荡10s，14000rpm离心3min；
9.取上清入新管；
10.加入等体积异丙醇，颠倒混匀，直至析出沉淀（-20℃放置、或过夜沉淀，有助增加沉淀的量）；
11.14000rpm离心10min，收集沉淀；
12.用70%乙醇洗沉淀，14000rpm离心3min，弃上清；
13.用微量真空泵小心吸去残液，37℃或室温晾干；
14.用含RNase的ddH
O或TE buffer溶解沉淀，并于37℃温箱作用1h以上、
2
或4℃过夜，消化RNA，最后置-20℃保存（要长期保存，则无需加水溶解，直接将固体沉淀置-20℃或-80℃冰箱冻存即可）。

注：提取结束后，建议跑胶，检测DNA的完整性，并估算DNA浓度。

球虫子孢子总RNA，基因组DNA和蛋白质的
提取方法
一、球虫子孢子总RNA的提取
（一）试剂：
氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水（溶液均需用DEPC处理过的水配
制）
（二）仪器及耗材的处理：
（三）操作步骤:
1.取约1×107个子孢子（必须是新鲜提取的）悬液，2000rpm离心5min
2.加入1ml TRIzol，用移液器反复吸打几次，直至子孢子完全裂解，室温（15-30℃）放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
3.每1mlTRIzol中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；
4.2-8℃不超过12000×g离心15min。

5.将水相转移到新管中（如需分离DNA和蛋白质，可保留有机相，操作步骤见后面），用预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA；每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10min；
6.2-8℃不超过12000×g离心10min，弃上清。

7.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀；每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。

2-8℃不超过7500×g离心5min，弃上清。

8.用移液器吸弃残留乙醇，根据RNA的量加入25-100μl无RNase的水,用枪头吸打几次使RNA溶解。

注意事项：
①所用的耗材尽量用一次性的进口耗材，保证没有RNA酶污染；
②在操作过程中要戴手套和口罩，确保不要带入外源性的RNA 酶；
③提取的RNA要保存于-70℃。

二、球虫子孢子DNA的分离
（一）试剂：
乙醇，0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)，75%乙醇，TE缓冲液。

（二）操作步骤:
1.样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。

每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000×g 离心5min；
2.移去上清（如需分离蛋白质，可保留上清，进一步操作见后）用含10%乙
醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。

每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30min，2-8℃2000×g离心5min，弃上清，重复一次；
3.用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1mlTRIzol加入1.5-2ml 75%乙醇,室温放置10-20min(不时颠倒混合)，2-8℃2000×g离心5min,弃上清；
4.室温放置晾干DNA5-15min，用TE缓冲液溶解DNA。

注意事项：
① DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜；
② DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存几个月；
③DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃长期保存。

三、子孢子蛋白质的提取
（一）试剂：异丙醇，含0.3M盐酸胍的95%乙醇，无水乙醇，1%SDS
（二）操作步骤：
1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1mlTRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃12000×g离心10min弃上清。

2．用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。

每使用1mlTRIzol加2ml 洗涤液，室温放置20min，2-8℃7500×g离心5min，弃上清，重复两次。

用2ml 无水乙醇同样方法再洗一次。

3．真空抽干蛋白质沉淀5-10min，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g离心10min除去。

分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或-5至-20℃保存备用。

注意事项：
①蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。

②用0.1%SDS在2-8℃透析三次，10000×g离心10min取上清即可用于WesternBlot。

常见问题分析：
①得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底；
B．最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解；
蛋白质降解:
A.组织取出后没有马上处理或冷冻电泳时条带变形；
B.蛋白质沉淀洗涤不充分。