实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌 PPT
质粒转化大肠杆菌实习报告--附实验图片
质粒转化⼤肠杆菌实习报告--附实验图⽚细胞转基因技术研究进展1实验内容：原核细胞转基因:⼤肠杆菌感受态细胞的制备, 转化和鉴定2实验原理及技术介绍：细菌质粒是⼀类双链、闭环的DNA，⼤⼩范围从1kb⾄200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独⽴于细胞染⾊体之外的⾃主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染⾊体外的游离状态，但在⼀定条件下也会可逆地整合到寄主染⾊体上，随着染⾊体的复制⽽复制，并通过细胞分裂传递到后代。
但是在⾃然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作⽤转移到新的宿主内,但在⼈⼯构建的质粒载体中,⼀般不能⾃⾏完成从⼀个细胞到另⼀个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产⽣⼀种短暂的感受态以摄取外源DNA。
所谓感受态，是指细菌⽣长过程中的某⼀阶段的培养物，只有某⼀⽣长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA ⽽不将其降解的⽣理状态。
感受态形成后，细胞⽣理状态会发⽣改变，出现各种蛋⽩质和酶，负责供体DNA的结合和加⼯等。
细胞表⾯正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分⼦的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引⼊⼤肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分⼦的感受态细胞。
在细菌中，能发⽣感受态细胞是占极少数。
⽽且，细菌的感受态是在短暂时间内发⽣。
⽬前对感受态细胞能接受外来DNA分⼦的本质看法不⼀。
主要有两种假说:⼀种是局部原⽣质体化假说——细胞表⾯的细胞壁结构发⽣变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分⼦能通过质膜进细胞。
另⼀种是酶受体假说——感受态细胞的表⾯形成⼀种能接受DNA的酶位点，使DNA分⼦能进⼊细胞。
本实验通过CaCl2对特定的⼤肠杆菌处理，制备感受态的细菌。
这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如⼀些插⼊⽬的DNA ⽚段的重组质粒，产⽣5×106~2×107个转化的菌落。
当质粒与这些⼤肠杆菌混合后，质粒粘附在⼤肠杆菌的表⾯，在42℃的温度时，⼤肠杆菌出现热休克，质粒可通过⼤肠杆菌细胞膜上形成的空隙进⼊菌体内。
实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌
Ampr：氨苄西林抗性基因 – β内酰胺酶
多克隆位点（MCS）：外源DNA片段的插入位点
pET32a
Amps菌株
pET32a
Ampr
培养基上含有X-Gal和 IPTG时，可使用蓝白 斑筛选方法鉴别真正 的重组的转化子。
涂布于含Amp的培养基上，可以生长。 次日可见白色菌落-- 转化子。
结构的三大要素： • • 多克隆位点 选择标记（耐药性，L00mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过 滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱. 3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至 100ml,用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于 4℃冰箱储存 . 4、 pET32a-SmPR10质粒：实验室自制
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但 当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。10ng 的cccDNA即可使100μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶 液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2 等均需是高纯度的(GR.或AR.),并 用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件 下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理, 所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污 染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带 来不必要的麻烦。
实验三
重组质粒DNA转化大肠杆菌
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化ppt课件
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以
满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
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感受态细胞(Competent cells)
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击 法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜 的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的 载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化（transformation）
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使 受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基 因工程等研究领域的基本实验技术。
2.抗生素使用错 策
用正确的抗生素
误
3.转化后温浴30min左
3.转化后立即涂 板忘记温浴
右，让抗性基因得 以表达
七、问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质 量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体 细胞？各有什么优缺点？
图1
图2
如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性 基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不 成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图2。
• 克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生 素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、 四环素、链霉素等。
重组DNA转化 细菌过程示意图
基因工程实验3：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化
• 3、影响感受态细胞转化效率的因素有：
• （1）细菌的生长状态和密度 OD600=0.3~0.5，细菌生长处于对数期或对数前期。
• （2）质粒DNA • 数量：质粒DNA不超过感受态细胞体积的5%。 • 大小：分子量越大，转化效率越低，超过30kb的质粒DNA很
难转化成功。 • 构型：超螺旋的DNA具有较高的转化效率，重组DNA效率低一
•转化方法：电击穿孔法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法
•感受态细胞(competent cell) ：用物理或化学方法处理后，细胞膜的通透性发 生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
•转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。
• 2、CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞及热激转化：
些，环状DNA相比线性DNA转化效率高一些。
• （3）所用试剂纯度、质量、器皿的洁净程度
• （4）防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
二、实验材料
• l、仪器和材料 • 大肠杆菌(E. coli JMl09菌株) • 恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、离心机、
30 mL离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、Ep 离心管(1.5 mL微量离心管)、加样器、1000 μL和 200 μL吸头。 • 2、试剂 • (1) LB琼脂平板： • (2) LB液体培养基： • (3) 0.1mol/L CaCl2溶液 • (4) 自提质粒等
大肠杆菌转化实验(热击法)
大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。
1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入10μl连接产物（一般是全部连接产物）（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中90秒进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入900μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡30min到50min（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
重组质粒的转化.ppt
提高转化效率的方法
• 感受态质量 • 质粒DNA的相对分子质量和浓度 • 防止杂菌和杂DNA污染
重组子的筛选
• 转化后的细胞在筛选培养基中培养，可筛选出转化子
蓝白斑筛选
• 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生 型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal 切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可 以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛 选的最直观有效的方法。
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花粉管通道
花粉管通道法是指在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利 用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵 细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而 成为带转基因的新个体。
重组质粒的转化
• 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，重组的 DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存 在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体 分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态 细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通 过各种方法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子 的鉴定。
操作步骤
• 取100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面 的操作)，加入10 µl重组质粒DNA(体积不超过10µl)+ 100µl感受态 细胞
• 将以上样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－ 2min，然后迅速冰上冷却2min
• 立即向上述管中分别加入 LB液体培养基（不需在冰上操作），摇匀 后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使 转化体表达抗生素基因产物。
重组质粒DNA转化大肠杆菌
重组质粒DNA转化大肠杆菌一、目的掌握外源DNA片段和质粒载体的连接反应的方法。
二、概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb＝且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
三、材料及试剂（一）、材料1.外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知。
2.载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知。
3.宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。
1.设备2.恒温摇床3.台式高速离心机4.恒温水浴锅5.琼脂糖凝胶电泳装置6.电热恒温培养箱7.电泳仪无菌8.工作台9.微量移液枪10.eppendorf管（二）、试剂1.LB固体和液体培养基2.T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。
3.X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。
4.IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
5.含AmpLB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
质粒转化大肠杆菌ppt
培养基
如胰蛋白胨、氯化钠、磷酸盐等
其他试剂
实验设备
基因扩增仪和电泳仪：用于检测目的基因是否成功转化到大肠杆菌中
电热恒温培养箱和水浴锅：用于培养大肠杆菌
离心管和试管：用于混合、沉淀和培养细胞
冰箱和超净台：用于培养大肠杆菌和质粒转化操作
移液器：用于吸取和转移液体
实验步骤及操作流程
04
01
02
准备所需试剂
将重组DNA分子导入受体细胞（如大肠杆菌），并使之在受体细胞中稳定复制和表达。
通过特定的筛选方法，获得含有目的基因的阳性克隆并进行鉴定。
质粒转化大肠杆菌的原理
02
质粒是一种存在于细胞质中的小型环状DNA分子，具有自主复制能力，可随细胞分裂而传给后代。
质粒编码次要代谢途径中的多种蛋白质，以及一些与特定表型有关的基因。
本实验的结论
02
本实验中，通过质粒转化大肠杆菌，成功地实现了外源基因的导入和表达，为进一步研究该基因的功能和表达调控机制奠定了基础。
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本实验的方法与其他基因克隆方法相比，具有简单、快速、高效等优点，同时该方法也具有很高的稳定性和可重复性。
与传统的基因克隆方法（如分子克隆、基因组克隆等）相比，质粒转化大肠杆菌具有操作简单、周期短、成本低等优点。
质粒转化大肠杆菌还可以用于构建具有特殊功能的菌株，如高产抗生素、抗肿瘤药物等，为生物医药领域的发展提供新的技术支持。
质粒转化大肠杆菌的应用前景
THANKS
感谢观看
质粒转化大肠杆菌主要通过接合方式进行。
通过抗药性、抗重金属性等表型特征对转化细胞进行筛选。
通过质粒提取、电泳、PCR等方法对转化细胞进行鉴定。
转化细胞的筛选与鉴定
实验材料及设备
实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌课件
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转化(Transformation)
是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的 一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的 基本实验技术。
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在0℃低温处理大肠杆菌细 胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击 （如42 ℃ ）下，细胞可吸收外源DNA。
3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培 养2-3小时至OD600 ＝0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键 。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外 援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）
实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌
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（二）、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
2. 热击：42℃水浴中热击60秒（注：精确计算时 间，热击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上 置于冰上冷2-5分钟。
3. 复苏：向每管中加入800μl LB液体培养基(注：
不含Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时，
使细菌恢复思正考：常热生击长后的状细态胞已，吸并入表外源达质质粒粒，如编本码实验的中的
抗生素抗性p什E基么T3复因2a苏(，A时该m用质p的粒rL)可B。培赋养予液宿不主加氨A苄m青p霉？素抗性。但是为
实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌
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（四）涂布平板筛选转化质粒
1. 将管中培养液摇匀后取100μl 均匀涂布于含Amp的筛选平 板上。 （注：将培养液摇匀后涂布。）
2. 正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培 养皿，37℃温箱中培养过夜，次日观察实验结果。
度要均匀）,冰上放置备用。
质粒DNA转化大肠杆
3）转化操作： 受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转 化率影响最大。对于Ca2+ 诱导的完整细胞转化而 言，菌龄、CaCl2处理时间、感受态细胞的保存期 以及热脉冲时间均是很重要的因素，其中感受态 细胞通常在12-24小时内转化率最高，之后转化率 急剧下降。 4）试剂纯度与器皿的洁净度： 转化过程中，所用的试剂（CaCl2，甘油，水） 必须是高纯度的。所用器皿尽量酸洗后乙醇洗涤， 超声后用超纯水淋洗。
1970年Mandel和Higa发现用CaCl2 处理过的大 肠杆菌能够吸收噬菌体DNA，此后不久，Cohen等 人用CaCl2法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受 态细胞，其整个操作程序为： 1）将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液 中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液 晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶 离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感 受态； 2）此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的 羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表 面上；
（6）弃尽上清液，将菌体置于冰水浴中，用30ml预 冷的100mmol/L CaCl2溶液轻轻混匀洗涤一次。 （7）4℃，6 000转/分离心10min。 （8）弃尽上清液，将沉淀用1ml预冷的CaCl2-甘油混 合液重新轻轻悬浮。 （ 9 ）200µl/ 管 分装至预冷 的 EP管 中（ 冰水 浴 中操 作），迅速置–80℃冰箱冷冻保藏。
3. 试剂与器材 1. 材料：p1300-TaSTK质粒、DH5a大肠杆菌感受 态菌液 2. 试剂：LB液体培养基、含有100µg/ml Kan抗生 素的LB固体培养基、20mg/ml IPTG, 20mg/ml X-Gal(二甲基甲酰胺DMF配制，避光保存) 3. 仪器：摇床、培养箱、超净工作台、超低温冰 箱、水浴锅 4. 其他：涂棒 、微量移液器
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（二）、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
4、 pET32a-SmPR10质粒：实验室自制
操作步骤
（一） 受体菌的培养
1、取-70℃或-20℃贮存的大肠杆菌DH5α菌种，在LB培养液中培养过夜 ，进行活化;
2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于 37℃培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液 体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
1. 复苏：向每管中加入800μl LB液体培养基(注：不含
Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时，使细菌恢
4、暂时不用的感受态细胞可置于 -80℃保存。 注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！
（三） 重组质粒DNA的转化
l 质粒和感受态细胞混和：在100μl感受态细胞悬液中加 入5μl重组质粒DNA（ pET32a-SmPR10 ），轻轻混匀 后冰上放置30分钟。
l 热击：42℃水浴中热击60秒（注：精确计算时间，热 击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上置于冰上冷2-5 分钟。
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂 ，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至 7.0。121℃湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作
台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养
皿铺板。
2、Amp母液：
实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌
实验目的
学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法 为下一步重组体筛选做准备
实验原理
遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的 表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大 肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平 板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来 ，这个过程就是转化。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
‹#›
Gene fragment (SmPR10)
Vector (pET-32a)
pET32a-SmPR10
材料、设备及试剂
材料
➢ E. coli DH5α菌株: R-、M-、Amp- (转化过程所用的受体细胞 一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲 基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳 定地遗传给后代。）
➢ pET32a-SmPR10质粒DNA（浓度：2 ng/μl): 实验室自制
设备 ➢ 恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作
台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。
试剂
1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨
10
酵母提取物 5
NaCl
10
琼脂粉（1.5%） 15g （注：LB液体培养基不加琼脂粉）
pET32a
多克隆位点（MCS）：外源DNA片段的插入位点
Amps菌株
pET32a
Ampr
培养基上含有X-Gal和 IPTG时，可使用蓝白 斑筛选方法鉴别真正 的重组的转化子。
涂布于含Amp的培养基上，可以生长。 次日可见白色菌落-- 转化子。
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 复制起始位点 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状 的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在0℃低温处理大肠杆菌细 胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击 （如42 ℃ ）下，细胞可吸收外源DNA。
1、将菌液转入1.5ml离心管中,冰上放置10分钟,然后于 4℃、4000rpm离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬 浮细胞,冰上放置10分钟后,4℃、4000rpm离心10分钟 。
3、弃去上清,加入0.1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液,轻 轻悬浮细胞。每份100μl（注意悬液密度要均匀）,冰 上放置备用。
将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导（电击法、 CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜 的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进 入的细胞即感受态细胞(Competent cells)。
转化(Transformation)
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.
pET-32 cloning/expression region
为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标 记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。 pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的 大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌 则不能再这种培养基上生长。
Ampr：氨苄西林抗性基因 – β内酰胺酶
称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过 滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至 100ml,用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于 4℃冰箱储存 .